Première preuve directe de la cellule directe

Communications Biology volume 5, Article number: 1132 (2022) Citer cet article

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Les bactéries produisent des homopoly(acides aminés) polycationiques, caractérisés par des squelettes isopeptidiques. Bien que la signification biologique des homopoly(acides aminés) polycationiques reste incertaine, une attention croissante s'est récemment portée sur leur utilisation potentielle pour réaliser l'internalisation cellulaire. Ici, pour la première fois, nous fournissons des preuves directes que deux isopeptides polycationiques bactériens représentatifs, ε-poly-l-α-lysine (ε-PαL) et ε-oligo-l-β-lysine (ε-OβL), ont été internalisés dans les cellules de mammifères par pénétration directe de la membrane cellulaire, puis diffusé dans tout le cytosol. Dans cette étude, nous avons utilisé des dérivés cliquables ε-PαL et ε-OβL portant un groupe azide C-terminal, qui ont été produits par voie enzymatique puis conjugués avec un colorant fluorescent pour analyser la localisation subcellulaire. Fait intéressant, les protéines fluorescentes conjuguées au ε-PαL ou ε-OβL cliquable ont également été internalisées dans les cellules et diffusées dans tout le cytosol. Notamment, un conjugué de recombinase Cre avec ε-PαL est entré dans les cellules et a médié la recombinaison Cre / loxP, et ε-PαL s'est avéré délivrer un anticorps IgG de pleine longueur au cytosol et au noyau.

Les homopoly(acides aminés), qui sont rares dans la nature, sont produits par les bactéries en tant que métabolites secondaires (Fig. 1a, b et Fig. 1a supplémentaire). A ce jour, six polymères, ε-poly-l-α-lysine (ε-PαL, 1)1,2, ε-oligo-l-β-lysine (ε-OβL, 2)3, γ-poly-l/ L'acide d-diaminobutyrique4,5, l'acide β-poly-l-diaminopropionique6, l'ε-poly-l-β-lysine (notre découverte récente)7 et l'acide γ-poly-l/d-glutamique1,8 ont été identifiés. En plus de ces polymères linéaires caractérisés par des squelettes isopeptidiques, deux polymères ramifiés constitués de chaînes dipeptidiques répétées ont également été trouvés chez les bactéries : l'acide multi-l-arginyl-poly-l-aspartique (également appelé cyanophycine)9,10 et acide multi-l-diaminopropionyl-poly-l-diaminopropionique11. Parmi ces huit homopoly(acides aminés), l'acide γ-poly-l/d-glutamique est le seul exemple d'un isopeptide polyanionique naturel. Les autres sont polycationiques et les connaissances sur les activités antimicrobiennes des isopeptides polycationiques linéaires sont limitées. Bien que la signification biologique des homopoly(acides aminés) mentionnés ci-dessus ait largement échappé aux chercheurs, leurs propriétés polyioniques et leurs structures polyamides sont actuellement un domaine d'intérêt en science des matériaux biologiques.

a, b Structures chimiques de ε-PαL (1) et ε-OβL (2). Le polymère 1 constitué de 25 à 35 résidus l-αLys est produit par Streptomyces albulus NBRC14147 en tant que métabolite secondaire (a). L'oligomère 2 est une sous-structure des ST. Tous les composés liés à la ST sont constitués de d-gulosamine carbamoylée à laquelle 2 (1 à 7 résidus l-βLys) et la forme amide de l'acide aminé inhabituel streptolidine (streptolidine lactame) sont attachés. c Dérivés esters ε-PαL produits par la souche NBRC14147 dans cette étude. Leurs extrémités C-terminales ont été estérifiées avec des alcools et ajoutées au milieu de culture. Pls a catalysé la polymérisation de l-αLys et les réactions d'estérification. iαK (cercles bleu clair), unité monomère isopeptide l-αLys. d La structure chimique du R8-azide (9). Le peptide 9 a été synthétisé chimiquement et utilisé comme contrôle canonique du CPP. R (cercles violet clair), unité monomère α-peptide l-arginine. e ε-OβL-PEG-azide (19) synthétisé par voie enzymatique par rORF19. iβK (cercles bleu clair), unité monomère isopeptidique l-βLys.

Contrairement aux isopeptides à fonction inconnue, les peptides standards (également appelés eupeptides) avec des séquences riches en arginine et/ou lysine (typiquement 5 à 30 résidus d'acides aminés) suscitent actuellement l'intérêt pour leurs activités de pénétration cellulaire dans les cellules de mammifères en raison de leur polycationic. caractéristiques au pH physiologique ; ces eupeptides sont appelés peptides pénétrant dans les cellules (CPP)12,13,14,15. Bien que les CPP amphipathiques et hydrophobes soient également connus, les CPP polycationiques sont fréquemment utilisés comme véhicules pour délivrer des macromolécules biologiques (cargos) dans les cellules de mammifères14. Les voies d'internalisation des CPP cationiques sont elles-mêmes largement divisées en pénétration directe indépendante de l'énergie et endocytose/macropinocytose dépendante de l'énergie14,15 ; dans les deux voies, les liaisons du CPP aux composants de la membrane cellulaire chargés négativement (tels que les protéoglycanes de sulfate d'héparane) sont un déclencheur essentiel des événements d'internalisation. Contrairement aux voies de pénétration directe, les cargaisons captées par l'endocytose/macropinocytose doivent s'échapper des endosomes vers le cytosol pour éviter la dégradation, atteindre leurs cibles moléculaires et exercer leurs activités biologiques. Il est important de noter que les CPP transportant une cargaison de macromolécules telles qu'une protéine pénètrent généralement dans les cellules uniquement par une voie endocytotique/macropinocytotique14,15,16,17. Par conséquent, des travaux récents se sont concentrés sur des CPP synthétiques conçus de manière rationnelle pour obtenir des internalisations plus efficaces, à la fois pour faciliter les pénétrations directes ou les fuites endosomales des conjugués CPP-protéine et pour conférer une résistance à la dégradation protéolytique17,18,19,20,21. En plus de ces passerelles historiques récentes, différentes approches visant à simplifier divers aspects de la méthodologie devraient stimuler la livraison intracellulaire pratique de macromolécules biologiques. De plus, les effets nocifs des caractéristiques polycationiques restent un problème critique à résoudre dans les CPP canoniques à structure eupeptidique.

Dans ce contexte, un polymère polycationique d'origine bactérienne, ε-PαL (1) (Fig. 1a), a suscité un intérêt croissant ces dernières années comme alternative aux CPP cationiques canoniques. Le polymère 1 présente de puissantes activités antimicrobiennes et des niveaux de cytotoxicité non détectables1,2, en plus d'une résistance protéolytique due aux liaisons isopeptidiques entre ses groupes α-carboxyle et ses groupes ε-amino22. Des études récentes ont rapporté que 1 a montré des améliorations potentielles des absorptions cellulaires de ses homologues électrostatiques, c'est-à-dire l'ADN23,24,25,26, l'ARNsi27 et les microcapsules de médicament28,29,30,31. Cependant, les charges cationiques de 1 ont été principalement neutralisées par les homologues anioniques dans leurs formes complexes, soulevant la question de savoir comment 1 transporte ses cargaisons anioniques dans les cellules. De plus, aucun rapport n'a démontré la voie d'internalisation de 1 lui-même, dont le poids moléculaire (environ 4000) est bien supérieur à celui des CPP canoniques.

En plus de 1, les structures polycationiques lysine-isopeptide se retrouvent également dans les antibiotiques streptothricine (ST) (Fig. 1b); cependant, leurs unités monomères ne sont pas la l-α-lysine (l-αLys) mais la l-β-lysine (l-βLys) : à savoir ε-OβL (2). Les ST présentent des activités antimicrobiennes et une cytotoxicité pour les cellules de mammifères. Leurs cibles moléculaires dans les cellules procaryotes sont les ribosomes, afin d'inhiber la biosynthèse des protéines, mais leur mécanisme cytotoxique dans les cellules eucaryotes reste incertain. Ces effets nocifs sont amplifiés par la chaîne pendante ε-OβL (1–7 mer). En fait, les ST avec une chaîne pendante ε-OβL plus longue (ST-B, ST-A et ST-X) présentent une plus grande cytotoxicité. Par conséquent, il a été émis l'hypothèse que la chaîne ε-OβL se comporte comme un CPP afin d'internaliser la structure centrale ST (ST-F) dans les cellules.

Nos études précédentes ont démontré que les structures polymères isopeptidiques en 1 et 2 sont synthétisées de manière non ribosomique par des mécanismes disparates (Fig. 1b, c supplémentaires) 2,3. Dans cette étude, nous avons généré des dérivés cliquables de 1 et 2 en utilisant leurs enzymes biosynthétiques avec les spécificités de substrat relâchées dans les réactions de polymérisation. Nous avons ensuite clarifié leurs activités de pénétration cellulaire à l'aide de conjugués avec un colorant fluorescent produit par la chimie du clic. Ce rapport décrit en outre les remarquables internalisations de conjugués 1-protéine et 2-protéine dans des cellules de mammifères vivants. Nous démontrons également la capacité de la décoration ε-PαL à délivrer un anticorps IgG pleine longueur (150 kDa) dans les cellules, ce qui pourrait transformer radicalement les approches thérapeutiques et favoriser des percées expérimentales en biologie moléculaire.

L'installation d'un groupe fonctionnel cliquable à l'extrémité C-terminale de 1 est demandée pour décorer des matériaux sans contreparties électrostatiques supplémentaires ; cette approche n'élimine pas la caractéristique polycationique de 1. Cependant, il y a eu pas mal d'approches chimiques réussies pour résoudre ce problème. En revanche, il a été rapporté qu'une bactérie productrice de ε-PαL, Streptomyces albulus NBRC14147, peut produire des dérivés esters de ε-PαL lorsque le milieu de culture est complété par des polyols à chaîne courte32. Notre présente étude a également confirmé la production d'un dérivé ester dans le milieu de culture contenant 0,2 % (p/v) de glycérol ; l'extrémité C-terminale de 1 a été estérifiée avec du glycérol, produisant du ε-PαL-glycérol (3) (Fig. 1c, Fig. 2a, b et tableaux supplémentaires 1, 2). Le raccourcissement de la chaîne isopeptidique de 3 était une observation courante lors de l'estérification avec des polyols à chaîne courte32.

Le mécanisme d'estérification reste incertain. Cependant, ces découvertes nous ont permis d'examiner si un groupe réactif, tel qu'un groupe alcyne, alcène ou azide, pouvait être installé à l'extrémité C-terminale de 1 pendant le processus d'estérification. Nous avons d'abord examiné si le 2-propyn-1-ol et le 3-butène-1-ol pouvaient être incorporés dans l'extrémité C-terminale. A cet effet, la souche NBRC14147 a été cultivée dans un milieu additionné de 2-propyn-1-ol ou de 3-butène-1-ol. Le bouillon de culture a été analysé par chromatographie liquide haute performance et spectrométrie de masse à ionisation électrospray haute résolution (HPLC-HR-ESI-MS). Comme prévu, des suppléments à 0, 2% (p / v) de ces deux alcools ont entraîné la production des dérivés esters correspondants (Fig. 2c, d et tableaux supplémentaires 3, 4). De même, trois autres alcools, le polyéthylène glycol (PEG), le triéthylène glycol mono(2-propynyl) éther (PEG-alcyne) et le 11-azido-3,6,9-trioxaundécanol (PEG-azide), ont également été incorporés dans le C-terminal de 1 via une liaison ester (Fig. 2e – g supplémentaire et tableaux supplémentaires 5–7). Ces réactions d'estérification se sont produites dans environ 70% de ε-PαL produit (tableau supplémentaire 8). Nous avons en outre montré que, in vitro, la synthétase ε-PαL recombinante (rPls) produisait deux dérivés esters, ε-PαL-glycérol (3) et ε-PαL-PEG (6), dans le mélange réactionnel contenant respectivement du glycérol et du PEG. (Fig. 3 supplémentaire et tableaux supplémentaires 9, 10). Ces résultats ont démontré que les rPls catalysaient directement les réactions d'estérification.

Parmi les dérivés d'ester ε-PαL, le ε-PαL-PEG-azide (8) a été purifié à partir du bouillon de culture et utilisé pour d'autres expériences après confirmation de sa structure chimique par analyse RMN (tableau supplémentaire 11).

Pour marquer par fluorescence 1, le composé 8 a été lié de manière covalente à un dérivé de fluorescéine (FAM, 0, 4 kDa) portant un groupe dibenzocyclooctyne (DBCO) par réaction de clic (cycloaddition azide-alcyne sans cuivre) (tableau supplémentaire 12). Le composé résultant ε-PαL-FAM (10) (Fig. 2) a ensuite été utilisé pour étudier l'activité de pénétration cellulaire de 1.

Un colorant fluorescéine (FAM) et des protéines (mAG, mKO et mAb) ont été conjugués avec ε-PαL, R8 ou ε-OβLm par clic chimique, et les produits résultants sont représentés schématiquement. Leurs structures chimiques validées par les données HPLC-HR-ESI-MS sont présentées dans les tableaux supplémentaires. Notre présente étude a démontré les voies dominantes pour leur absorption intracellulaire (en bas à droite). Les composés 10, 12, 14, 16 et 24 ont été internalisés dans les cellules principalement par pénétration directe. Cependant, 17 et 25 ont été absorbés dans les cellules par endocytose et/ou macropinocytose et ont ensuite été libérés des endosomes. Les composés 11, 13 et 15 ont été utilisés comme témoins CPP canoniques.

La microscopie confocale (CM) a été initialement utilisée pour évaluer l'internalisation cellulaire de 10 (Fig. 3a). Les cellules HeLa ont été incubées avec 10 (50 uM) dans des conditions typiques de culture cellulaire avec du sérum. Avant l'imagerie, les cellules ont été lavées avec de l'héparine, qui est fortement chargée négativement et doit dépouiller 10 électrostatiquement associée à la surface de la membrane plasmique. Les cellules ont ensuite été fixées avec du paraformaldéhyde à 4 %14. Lors de l'incubation à 37 ° C pendant 60 min, CM a démontré que 10 était intériorisé dans les cellules et diffusé dans tout le cytosol. L'image fluorescente verte observée indiquait la voie de translocation directe pour 10 car il n'y avait pas de signaux ponctués suggérant des endosomes. De plus, des signaux diffus de 10 ont également été observés lors de l'absorption intracellulaire à 4 ° C, une température à laquelle l'endocytose dépendante de l'énergie était fortement supprimée. Ces résultats ont révélé que l'internalisation cellulaire de 10 s'est produite par une voie de pénétration directe. Cependant, une faible concentration (2 µM) de 10 n'a donné que des signaux ponctués suggérant des endosomes à 37 ° C (Fig. 3b). Ces signaux dose-dépendants (diffus ou ponctués) ont été rapportés dans les PPC synthétiques canoniques, comme l'octa-arginine (R8) et la dodéca-arginine (R12)33,34. Nous avons en effet observé de tels signaux dans le traitement avec R8-FAM (11) en main (Fig. 2 et Fig. 3a, b). Ainsi, comme R8, 1 est entré dans les cellules par deux voies : pénétration directe et endocytose/macropinocytose. Pour cette internalisation, la conjugaison de la liaison covalente était nécessaire ; une approche non covalente n'a entraîné aucune absorption cellulaire (Fig. 3c). Le sérum dans le milieu de culture n'a pas affecté le taux d'internalisation cellulaire (Fig. 3c), mais l'héparine polyanionique a inhibé de manière significative l'événement de pénétration cellulaire (Fig. 3d), suggérant fortement que les composants membranaires chargés négativement, y compris le protéoglycane de sulfate d'héparane, sont essentiels pour l'internalisation ε-PαL. De plus, des absorptions cellulaires rapides (dans les 5 à 15 minutes) et des absorptions dose-dépendantes de 10 se sont produites à 4 ° C et 37 ° C (Fig. 3e – h). La PAO (un inhibiteur de l'endocytose) 35 et l'EIPA (un inhibiteur de la macropinocytose) 36 ont supprimé ces absorptions cellulaires (Fig. 3i). Cependant, les niveaux d'inhibition étaient inférieurs à ceux de 11 (Fig. 3j), ce qui suggère que la principale voie d'internalisation de ε-PαL est la pénétration directe à travers les membranes cellulaires. Nous avons donc porté notre attention sur la livraison cytosolique des cargaisons de protéines par 1.

a, b Délivrance cytosolique de FAM conjugué à ε-PαL (1) ou R8. Les cellules HeLa ont été incubées avec FAM, ε-PαL-FAM (10) et R8-FAM (11) dans des conditions de culture cellulaire typiques avec du sérum. Après lavage et fixation des cellules, la localisation cellulaire (vert) des FAM, 10 et 11 a été déterminée par microscopie confocale (CM). La membrane cellulaire a été colorée avec le marqueur membranaire agglutinine de germe de blé (Alexa594-WGA; rouge). Les images CM représentatives et les vues agrandies des zones en boîte jaune sont affichées. Barres d'échelle, 20 µm. Les cellules ont été incubées avec 50 µM de FAM, 10 et 11 pendant 60 min à 37 °C et 4 °C (a). Les cellules ont été incubées avec 2 µM chacune pendant 60 min à 37 ° C (b). c–j Absorption cellulaire relative de 10 à 37 °C (gris clair) et 4 °C (blanc). FAM (50 µM), FAM mélangé avec 1 (FAM + 1, 50 µM chacun) et 10 (50 µM) ont été incubés avec des cellules dans le milieu de culture complété avec ou sans sérum (FBS) pendant 60 min (c). Les résultats sont présentés sous forme de moyenne ± écart type (sd) (n = 3). ** Significatif à p < 0,01 par ANOVA à deux facteurs suivi du test de comparaisons multiples de Sidak. ns non significatif. Le composé 10 a été incubé avec des cellules dans le milieu de culture additionné ou non d'héparine mg ml-1 pendant 60 min à 37 ° C ( d ). Les résultats sont présentés sous forme de moyenne ± écart-type (n = 3) ** Significatif à p < 0,01 par le test t de Student non apparié. Le composé 10 a été incubé avec des cellules pendant 5 à 60 min à 4 ° C ( e ) et 37 ° C ( f ). Le composé 10 (3,1 à 100 µM) a été incubé avec des cellules pendant 60 min à 4 °C (g) et 37 °C (h). Les composés 10 (i) et 11 (j) ont été incubés avec des cellules pendant 60 min à 37 ° C dans le milieu de culture additionné d'un inhibiteur d'endocytose/macropinocytose (PAO, Dynasore, MDC ou EIPA). Les résultats sont présentés sous forme de moyenne ± sd (n = 3). Les astérisques indiquent la signification à *p < 0,05, **p < 0,01 par ANOVA unidirectionnelle suivie du test de comparaisons multiples de Tukey.

Une protéine fluorescente verte de 27 kDa, monomère Azami-Green (mAG), a été chimiquement dérivée avec DBCO-Sulfo-N-hydroxysuccinimidyl ester pour introduire un groupe DBCO sur la surface mAG et ensuite conjuguée avec 8 par réaction de clic, donnant ε-PαL -mAG (12) (Fig. 2, Tableau supplémentaire 13). Les cellules HeLa ont été incubées avec 12 (50 µM) pendant 60 min à 37 °C ou 4 °C, puis lavées et fixées comme décrit ci-dessus. Lorsque les cellules ont été incubées à 37 ° C, l'analyse CM a révélé des signaux diffus et vésiculaires (Fig. 4a). L'incubation à 4 ° C a entraîné des signaux fluorescents condensés dans les noyaux et des signaux fluorescents verts diffusés dans les cytosols (Fig. 4a). Alors que le conjugué à 12 liaisons covalentes pouvait délivrer la cargaison de protéines dans les cellules, une approche non covalente n'entraînait aucune absorption cellulaire (Fig. 4b). Malgré la grande cargaison (27 kDa), 12 sont entrés rapidement dans les cellules en 5 à 15 min, et ses absorptions dépendantes de la dose ont également été montrées à 4 ° C et à 37 ° C (Fig. 4c – f). Les inhibiteurs d'endocytose/macropinocytose n'ont pas aboli l'internalisation cellulaire (Fig. 4g). Contrairement à 12, le mAG conjugué à R8 (R8-mAG, 13) (Fig. 2, Tableau supplémentaire 14) était à peine internalisé dans les cellules à 4 ° C et piégé dans les endosomes à 37 ° C (Fig. 4a).

une délivrance cytosolique de mAG conjugué avec ε-PαL (1) ou R8. Les cellules HeLa ont été incubées avec mAG, ε-PαL-mAG (12) et R8-mAG (13) pendant 60 min à 37 ° C et 4 ° C. Après lavage et fixation des cellules, la localisation cellulaire de 12 (vert) et 13 (vert) a été déterminée par CM. La membrane cellulaire a été colorée avec Alexa594-WGA (rouge). Les images CM représentatives et les vues agrandies des zones en boîte jaune sont affichées. Barres d'échelle, 20 µm. b–g Absorption cellulaire relative de 12 à 37 °C (gris clair) et 4 °C (blanc). mAG, mAG mélangé avec 1 (mAG + 1) et 12 ont été incubés avec des cellules HeLa pendant 60 min à 37 °C et 4 °C. Les résultats sont présentés sous forme de moyenne ± sd (n = 3). ** Significatif à p < 0,01 par ANOVA à deux facteurs suivi du test de comparaisons multiples de Sidak (b). La protéine 12 (50 µM) a été incubée avec des cellules pendant 5 à 60 min à 4 °C (c) et 37 °C (d). La protéine 12 (3,1 à 100 µM) a été incubée avec des cellules pendant 60 min à 4 °C (e) et 37 °C (f). Effet des inhibiteurs d'endocytose/macropinocytose sur l'absorption cellulaire de 12. Les cellules HeLa ont été incubées avec 12 pendant 60 min à 37 ° C dans le milieu de culture additionné de l'inhibiteur (PAO, Dynasore, MDC ou EIPA). Les résultats sont présentés sous forme de moyenne ± sd (n = 3). * Significatif à p < 0,05 par ANOVA unidirectionnelle suivie du test de comparaisons multiples de Tukey (g).

Pour confirmer l'événement de pénétration directe dans 12, nous avons effectué une imagerie time-lapse avec CM. Notamment, 12 ont montré la formation de taches enrichies en fluorescence sur les membranes cellulaires lors de la phase d'internalisation initiale (Fig. 5a) (Vidéo supplémentaire 1). À partir des taches, 12 se sont ensuite progressivement répandus dans le cytosol et le noyau. De telles taches ont également été observées au cours du processus de pénétration directe de peptides canoniques riches en arginine et ont été précédemment décrites comme des zones de nucléation (NZ)14,37,38. ε-PαL (isopeptide) et les peptides riches en arginine (eupeptide) doivent être structurellement classés en différentes classes, mais il est intéressant de noter que ε-PαL peut délivrer des cargaisons de protéines directement et très rapidement dans les cellules via NZ. Trois mécanismes de pénétration directe ont été proposés dans les CPP ayant des conformations en hélice α (Fig. 5a)15. ε-PαL a été suggéré pour former une conformation en feuillet β39,40. Bien que le mécanisme d'absorption intracellulaire reste incertain, les absorptions cellulaires et les distributions cytosoliques de 12 ont été observées dans toutes les lignées cellulaires testées (Fig. 4 supplémentaire). Pour examiner la polyvalence du véhicule ε-PαL pour la délivrance cytosolique, une protéine fluorescente alternative, le monomère Kusabira-Orange (mKO, 25 kDa), a été conjuguée à 8, donnant ε-PαL-mKO (14) (Fig. 2 et Supplémentaire Tableau 15). Comme prévu, des résultats identiques ont été obtenus avec 14 (Fig. 5 supplémentaire). mKO conjugué à R8 (R8-mKO) (15) (Fig. 2 et Tableau supplémentaire 16) n'a été repris que lorsqu'il a été incubé à 37 °C. De plus, l'imagerie en accéléré avec CM a confirmé que l'internalisation cellulaire ne se produisait que par la voie endocytaire (Vidéo supplémentaire 2). Ces résultats ont montré que la modification polycationique par ε-PαL est assez efficace pour la livraison cytosolique de cargaisons protéiques.

une expérience Time-lapse montrant l'absorption cellulaire de 12. L'imagerie time-lapse a montré des cellules HeLa avec CM après l'ajout de 12 à 37 ° C. Après 1, 5, 10, 15 et 20 min, les images instantanées sont affichées (voir également la vidéo supplémentaire 1). NZ, zone de nucléation. Barres d'échelle, 20 µm. Les mécanismes de pénétration directe proposés sont représentés schématiquement (en bas). b Le plasmide rapporteur d'activité Cre construit dans cette étude est représenté schématiquement. Le plasmide rapporteur exprimait une protéine fluorescente de fusion (mKO-mAG) et mKO seul dans des cellules HeLa avec et sans recombinase Cre, respectivement. Les cellules HEK293T ont été transfectées avec le plasmide rapporteur puis incubées pendant 24h à 37°C. Les cellules ont été traitées avec la recombinase Cre (50 μM) ou ε-PαL-Cre (16) (50 μM) pendant 60 min à 37 ° C après confirmation de l'expression de mKO. Les cellules ont été incubées pendant 24 h dans des conditions de culture typiques après lavage. L'événement de recombinaison génique par 16 a été contrôlé par microscopie. Les images de microscopie représentatives sont affichées. Les rapports de recombinaison génique sont présentés comme la moyenne ± sd (n = 3). Barres d'échelle, 20 µm.

Le suivi des conjugués CPP-protéine après leur absorption intracellulaire est important pour évaluer leurs capacités en tant que CPP. Nous avons donc étudié la distribution dynamique du 12 intracellulaire. L'imagerie time-lapse avec microscopie à coupe optique a démontré que le signal diffusé de 12 était détecté en continu pendant au moins 12 h (Vidéo supplémentaire 3). En revanche, les signaux R8-mKO (15) ont été détectés en continu sous forme de formes vésiculaires jusqu'à 12 h (vidéo supplémentaire 4). Ainsi, la plupart des 15 molécules étaient constamment piégées dans les endosomes.

Pour examiner si les cargaisons enzymatiques délivrées par ε-PαL présentent leurs fonctions dans les cellules, nous avons préparé la recombinase Cre (38 kDa) conjuguée à 8 (ε-PαL-Cre, 16) (Fig. 2 et tableau supplémentaire 17). Nous avons d'abord transfecté des cellules HEK293T avec un plasmide rapporteur d'activité Cre (pmKO_loxP_mAG) qui exprime une protéine de fusion mKO-mAG et mKO seul avec et sans 16, respectivement. Nous avons ensuite traité les cellules transfectées avec 50 μM de 16 et surveillé au microscope l'expression du gène rapporteur. Comme prévu, l'ajout de 16 a entraîné l'expression de mKO-mAG, démontrant la délivrance et l'action réussies (recombinaison Cre / loxP) de 16 (Fig. 5b).

Les succès des livraisons intracellulaires pilotées par ε-PαL de mAG (27 kDa), mKO (25 kDa) et Cre recombinase (38 kDa) ont attiré notre attention sur la livraison d'un anticorps IgG de pleine longueur, qui reste difficile en raison de son haut poids moléculaire (150 kDa)41. Pour examiner la capacité de ε-PαL à internaliser les anticorps, un anticorps monoclonal anti-α-tubuline marqué par fluorescence (mAbFAM) a été conjugué à 8, donnant ε-PαL-mAbFAM (17) (Fig. 2 et tableau supplémentaire 18). Nous avons émis l'hypothèse qu'un traitement à haute concentration (50 μM) ne pouvait pas nous donner une image fluorescente du cytosquelette microfilamenteux en raison d'un excès de signaux fluorescents. En revanche, la faible concentration (par exemple, ~ 2 μM) n'entraînerait que des signaux ponctués évocateurs d'endosomes. Par conséquent, les cellules HeLa ont été incubées avec 10 µM de 17. Après l'incubation pendant 2 h à 37 °C et 4 °C, l'analyse CM a révélé à la fois des signaux diffusants et ponctués de 17 dans les cellules incubées à 37 °C, mais pas celles incubées. à 4 °C (figure 6a). Ces découvertes suggèrent fortement que le 17 absorbé principalement par endocytose et/ou macropinocytose est libéré des endosomes et distribué dans la cellule. Plus surprenant, les signaux fluorescents condensés ont également été détectés dans les noyaux. À l'inverse, 17 n'ont pas fourni d'image fluorescente du cytosquelette microfilamenteux, bien que 17 l'aient fait dans une expérience d'immunocoloration standard (Fig. 6b). Les signaux diffusés cytosoliquement de 17 résultaient probablement de l'excès de 17 α-tubuline non lié qui ne peut pas être retiré dans les cellules vivantes.

a Les cellules HeLa ont été incubées avec ε-PαL-mAbFAM (17) pendant 120 min à 37 °C et 4 °C. Après lavage et fixation des cellules, la localisation cellulaire de 17 (vert) a été déterminée par CM. La membrane cellulaire a été colorée avec Alexa594-WGA (rouge). Des images CM représentatives et des vues agrandies des zones en boîte jaune sont affichées. Barres d'échelle, 20 µm. b immunomarquage de l'α-tubuline par 17 dans les cellules HeLa. Les cellules ont été fixées avec du paraformaldéhyde 4%, perméabilisées dans du Triton X-100 0,1% en PBS, puis bloquées dans un réactif bloquant (Blocking One). Les cellules ont ensuite été incubées avec 17 à 2 μg ml-1 (en vert) pendant 60 min à 25 °C. La membrane cellulaire a été colorée avec Alexa594-WGA (rouge) après lavage des cellules, et les cellules ont ensuite été observées par CM. Barres d'échelle, 20 µm.

Pour répondre à la demande mondiale croissante de CPP, des CPP structurellement et fonctionnellement distincts sont nécessaires pour contourner les inconvénients canoniques du CPP tels que la cytotoxicité. Cette étude s'est donc concentrée sur les cytotoxicités de ε-PαL (1) contre les cellules de mammifères, tandis que la non-toxicité de 1 in vivo a également été rapportée de sorte que ε-PαL est utilisé comme conservateur alimentaire naturel dans plusieurs pays1,42. Cependant, la cytotoxicité in vitro de 1 dans d'autres lignées cellulaires est restée incertaine. Nous avons donc effectué le test de viabilité cellulaire MTT avec 1 dans les cellules K562, HepG2 et HEK293T en plus des cellules HeLa, et nous avons confirmé que 1 ne présentait pas de cytotoxicité dans ces lignées cellulaires (tableau supplémentaire 19).

Comme mentionné précédemment, nous avons émis l'hypothèse que le fragment ε-OβL (2) se comporte comme un CPP pour internaliser la structure du noyau ST (ST-F) dans les cellules (Fig. 1b). Nous avons donc étudié l'activité de pénétration cellulaire de 2 dans les cellules de mammifères. Nous avons utilisé une approche chimioenzymatique pour introduire un groupe azide à l'extrémité C-terminale de 2.

Dans la biosynthèse ST, la croissance de la chaîne ε-OβL (2–7 mer) est médiée par ORF19, un domaine d'adénylation autonome de la peptide synthétase non ribosomale (NRPS) (Fig. 1c supplémentaire)3. Dans cette réaction d'allongement de chaîne, ORF19 ne s'oligomérise jamais directement avec uniquement des unités monomères l-βLys; ORF19 nécessite plutôt l'échafaudage l-βLys attaché à 4′PP-ORF18 comme unité d'amorçage3. Les thioesters d'aminoacyl-N-acétylcystéamine (aminoacyl-SNAC) sont souvent utilisés comme substrats imitant le substrat aminoacyle attaché au bras 4′-PP43. Cependant, au lieu des aminoacyl-SNAC, nous avons examiné si le l-βLys attaché à une queue de PEG-azide synthétisée chimiquement (l-βLys-PEG-azide, 18) (Fig. 1e et Tableau supplémentaire 20) serait acceptable comme amorçage unité pour ORF19 recombinant (rORF19). Nous avons incubé le composé 18 (unité d'amorçage) et l-βLys (unité d'extension) avec rORF19 (0, 1 mg ml-1) et ATP. Heureusement, l'analyse HPLC-ESI-HR-TOF du mélange réactionnel a montré que rORF19 induisait un allongement de chaîne dépendant de l'ATP (2–4 mer) sur l'échafaudage 18 et produisait de l'ε-OβL-PEG-azide (19) (Fig. 1e, Supplémentaire Fig. 6a, b et Supplémentaire Tableau 21). Cette découverte a démontré que 18 est acceptable en tant qu'unité d'amorçage. Nous avons également examiné trois unités d'amorçage différentes (Fig. 6a supplémentaire) sur la base de la spécificité de substrat d'ORF19 précédemment rapportée par notre groupe3. Un analogue de la l-βLys, la l-β-homolysine (l-βhLys), était auparavant acceptable. Par conséquent, le l-βhLys-PEG-azide (20) a été synthétisé chimiquement (tableau supplémentaire 22) et utilisé dans la réaction rORF19. Comme prévu, rORF19 a médié la croissance de la chaîne des isopeptides l-βLys en présence de 20 (Fig. 6c supplémentaire et Tableau supplémentaire 23). L'unité d'amorçage 20 était plus efficace que 18 sur la base de deux découvertes : (i) les productivités des isopeptides allongés étaient améliorées, et (ii) le composé 20 était davantage consommé par rORF19. Inversement, le l-αLys-PEG-azide (22) (tableau supplémentaire 24) et le NH2-PEG-azide (23) n'ont pas été acceptés comme unités d'amorçage (supplémentaires Fig. 6d, e). À partir de ces découvertes, nous avons sélectionné 20 comme unité d'amorçage appropriée et désigné l'oligomère produit par voie enzymatique comme ε-OβLm-PEG-azide (21) (Fig. 6f supplémentaire).

En augmentant la concentration de rORF19 de 0,1 à 1,0 mg ml-1, le mélange réactionnel a produit 21 avec des chaînes isopeptidiques plus longues (2–9 mer) (tableau supplémentaire 25). L'oligomère résultant a été purifié à partir du mélange réactionnel puis utilisé à nouveau comme unité d'amorçage. Cette réaction enzymatique de 2e tour a donné des oligomères plus étendus (2 à 13 mers) (tableau supplémentaire 25), qui ont été utilisés comme ε-OβL cliquables pour d'autres expériences.

Le composé 21 avait des chaînes de longueurs beaucoup plus courtes que 8 (tableau supplémentaire 7). Nous avons donc d'abord étudié la relation entre l'activité de pénétration cellulaire et la longueur de la chaîne peptidique. Les 21 oligomères ont été purifiés en fonction de la longueur de la chaîne (2, 3, 4, 5, 6 et 7–13 mer). Les six oligomères avec différentes longueurs de chaîne, 21 (2 mer), 21 (3 mer), 21 (4 mer), 21 (5 mer), 21 (6 mer) et 21 (7-13 mer), ont ensuite été respectivement conjugué avec FAM par réaction de clic, produisant ε-OβLm-FAM (24) (2 mer), 24 (3 mer), 24 (4 mer), 24 (5 mer), 24 (6 mer) et 24 (7– 13 mer) (tableau complémentaire 26). Les cellules HeLa ont été incubées avec 24 (50 µM) à 37 °C et 4 °C pendant 60 min. L'analyse CM n'a démontré aucune activité de pénétration cellulaire dans les chaînes courtes (2 mer et 3 mer) (Fig. 7). En revanche, les chaînes plus longues (> 4 mer) sont entrées dans les cellules à 37 ° C et 4 ° C et sont arrivées au noyau. Pour l'analyse quantitative, nous avons préparé 24 composés uniquement des isopeptides perméables aux cellules (4-13 mer) (tableau supplémentaire 27), et il a été intériorisé de manière significative, rapide et dose-dépendante dans les cellules à 37 ° C et 4 ° C ( Fig. 7a–e supplémentaire). Au cours de l'incubation avec des inhibiteurs d'endocytose / macropinocytose, l'absorption intracellulaire de 24 (4–13 mer) n'a été supprimée que par l'EIPA (Fig. 7f supplémentaire). Ces résultats ont révélé que l'internalisation de 2 a été réalisée par pénétration directe et macropinocytose. Plus intéressant encore, ces résultats impliquaient que 2, une sous-structure de ST, fonctionne comme un CPP pour délivrer la structure centrale ST (ST-F) dans les cellules.

Les cellules HeLa ont été incubées avec 50 µM de ε-OβLm-FAM (24) (2 mer), 24 (3 mer), 24 (4 mer), 24 (5 mer), 24 (6 mer) ou 24 (7– 13 mer) pendant 60 min à 37 ° C ou 4 ° C dans des conditions typiques de culture cellulaire avec du sérum. Après lavage et fixation des cellules, la localisation cellulaire (vert) de 24 a été déterminée par CM. La membrane cellulaire a été colorée avec Alexa594-WGA (rouge). Les images CM représentatives sont affichées. Barres d'échelle, 20 µm.

Nous avons conjugué mAG avec 21 (4–13 mer) par réaction de clic pour examiner si ε-OβL peut délivrer des macromolécules de manière intracellulaire (tableau supplémentaire 28). Le conjugué résultant, ε-OβLm-mAG (25) (Fig. 2), a été ajouté à la culture de cellules HeLa à 50 µM et incubé pendant 60 min à 37 °C ou 4 °C. Fait intéressant, les signaux diffusants et vésiculaires de 25 ont été observés dans les cellules en incubation à 37 ° C (Fig. 8a). Cependant, sous incubation à 4 ° C, 25 a été piégé par la membrane cellulaire et à peine intériorisé dans les cellules (Fig. 8a, b). Ces données ont montré que 25 était internalisé principalement par endocytose/macropinocytose. Les résultats suivants le confirment également : (i) l'administration intracellulaire a été significativement supprimée par la PAO et l'EIPA (Fig. 8c), et (ii) 25 ont eu besoin d'un peu plus de temps (~ 60 min) (Fig. 8d) que 12 pour entrer dans les cellules. , tandis que des absorptions dose-dépendantes de 25 se sont produites à 37 ° C (Fig. 8e). Inversement, nous avons observé simultanément les signaux de diffusion dans les cellules traitées au 25 à 37 ° C (Fig. 8a), démontrant que le 25 était libéré des endosomes puis diffusé dans le cytosol (Fig. 2).

a Livraisons cytosoliques de mAG conjugué à ε-OβL (2). Les cellules HeLa ont été incubées avec mAG et ε-OβL-mAG (25) pendant 60 min à 37 ° C et 4 ° C. La localisation cellulaire de 25 (vert) a été déterminée par CM après lavage et fixation des cellules. La membrane cellulaire a été colorée avec Alexa594-WGA (rouge). Les images CM représentatives et les vues agrandies des zones en boîte jaune sont affichées. Barres d'échelle, 20 µm. b–e Absorption cellulaire relative de 25 dans les cellules HeLa. Les cellules HeLa ont été incubées avec 50 µM (sauf indication contraire) de mAG ou 25. mAG et 25 ont été incubées avec des cellules pendant 60 min à 37 ° C (gris clair) et 4 ° C (blanc) (b). Les résultats sont présentés sous forme de moyenne ± sd (n = 3). * Significatif à p < 0,05 par ANOVA à deux facteurs suivi du test de comparaisons multiples de Sidak. La protéine 25 a été incubée avec des cellules pendant 60 min à 37 ° C dans le milieu de culture additionné d'un inhibiteur d'endocytose/macropinocytose (PAO, Dynasore, MDC ou EIPA) (c). Les résultats sont présentés sous forme de moyenne ± sd (n = 3). ** Significatif à p < 0,01 par ANOVA unidirectionnelle suivie du test de comparaisons multiples de Tukey. La protéine 25 a été incubée avec des cellules pendant 5 à 60 min à 37 ° C ( d ) et 25 (3, 1 à 50 µM) a été incubée avec des cellules pendant 60 min à 37 ° C ( e ).

Nos explorations ont montré que les absorptions cellulaires de 1 et 2, qui avaient une petite cargaison (par exemple, FAM dans cette étude), se produisaient principalement par pénétration directe indépendante de l'énergie. Étonnamment, des pénétrations directes ont également été observées dans 12 (27 kDa) et 14 (25 kDa), tandis que le CPP canonique (R8) n'intervenait dans les livraisons de cargaisons protéiques que par endocytose/macropinocytose. Considérant que 16 (38 kDa) a médié sa recombinaison Cre/loxP dans le noyau et que 17 (150 kDa) s'est échappé des endosomes puis est arrivé au noyau, nous concluons que l'approche de conjugaison polycationique avec 1 est efficace à la fois pour le noyau ciblé livraison et la livraison cytosolique de cargaisons protéiques. Notre présente étude a également révélé que la chaîne ε-OβL des ST antibiotiques fonctionne comme un CPP pour délivrer la structure centrale ST (ST-F) dans les cellules. De plus, à notre grande surprise, nous avons constaté que la conjugaison avec 2 facilitait l'échappement endosomique des cargaisons de protéines. Bien que nous ayons utilisé 21 (4–13 mer) dans cette étude, l'allongement de la longueur de la chaîne isopeptidique pourrait permettre une pénétration directe des cargaisons de protéines.

L'administration intracellulaire pratique de macromolécules biologiques (produits biopharmaceutiques) transformerait radicalement les approches thérapeutiques et favoriserait des percées expérimentales, car de nombreuses cibles médicamenteuses potentielles (cytokines, facteurs de croissance et protéines de transduction du signal) se trouvent à l'intérieur de la cellule44. Les CPP sont parmi les stratégies les plus prometteuses, et la technologie basée sur les CPP tourne actuellement autour d'eupeptides naturels et synthétiques. La poly-l/d-arginine13,14,15, la poly-l-histidine45 et la poly-l/d-lysine46, qui ont été produites chimiquement ou génétiquement, ont été utilisées comme CPP. Pour permettre la livraison de cargaisons de protéines par ces eupeptides, l'expression recombinante de fusions CPP-cargo à l'extrémité N ou C-terminale est une stratégie simple. Cependant, les expressions de faible niveau dans une souche hôte sont des problèmes connus en raison de l'insolubilité, de la toxicité et de la troncature des protéines de fusion16,47. En revanche, la fixation chimique in vitro d'un CPP à une surface de protéine est une approche alternative prometteuse. Ce processus de bioconjugaison repose sur la synthèse chimique des CPP qui contiennent souvent une extrémité de groupe réactif spécifique aux groupes fonctionnels (par exemple, les groupes amine primaire et sulfhydryle) à la surface de la protéine. Cependant, le bras oscillant CPP résultant sur le corps protéique est souvent biochimiquement instable en raison de la dégradation protéolytique48. Bien que les CPP cycliques (par exemple, les peptides Tat cycliques et les oligoarginines cycliques) aient un grand potentiel pour surmonter le problème de dégradation critique, une méthode beaucoup plus polyvalente et facile sans synthèse laborieuse élargirait le potentiel d'application de la technologie axée sur le CPP. Par conséquent, les isopeptides polycationiques naturels 1 et 2, résistants aux peptidases/protéinases22 et non toxiques pour les cellules de mammifères1,2,3, constituent une nouvelle classe prometteuse de CPP. De plus, leurs machineries biosynthétiques se sont révélées être des alternatives utiles pour installer un groupe cliquable aux extrémités C-terminales des isopeptides polycationiques.

Les mécanismes des activités de pénétration cellulaire exceptionnelles de 1 et 2 restent encore flous, comme les CPP canoniques. Cependant, les cargaisons de protéines conjuguées à 1 ou 2 ont certainement été internalisées dans les cellules par pénétration directe dans des conditions de concentration élevée (50 μM). Des études récentes se sont concentrées sur des CPP synthétiques de conception rationnelle pour obtenir des internalisations plus efficaces (pénétrations directes ou échappements endosomaux) avec des traitements à faible concentration (~ 2 μM) et pour conférer une résistance à la dégradation protéolytique19,20,21,48,49,50,51. Parallèlement, ces tentatives peuvent réduire la quantité de CPP synthétiques préparés par synthèse chimique avancée à un coût élevé. En revanche, une stratégie rentable permet d'effectuer des livraisons intracellulaires de protéines dans des conditions de concentration élevée (par exemple,> 50 μM) préférables pour des absorptions de pénétration directe fiables. Les isopeptides polycationiques bactériens, 1 et 2, sont de nouveaux outils intrigants avec ce potentiel. Compte tenu de la preuve de ces activités de pénétration cellulaire, nous proposons le nom d'isopeptides polycationiques entrant dans les cellules (PIECE) pour 1 et 2. Bien qu'il s'agisse des premiers exemples de PIECE bactériennes, d'autres investigations sur les activités de pénétration cellulaire dans les isopeptides polycationiques bactériens, tels que comme acide γ-poly-l/d-diaminobutyrique4,5, acide β-poly-l-diaminopropionique6, ε-poly-l-β-lysine7, cyanophycine9,10 et acide multi-l-diaminopropionyl-poly-l-diaminopropionique (Fig. 1a supplémentaire)11, élargirait les applications potentielles de la technologie basée sur le CPP.

Polyols à chaîne courte, 2-propyn-1-ol, 3-butène-1-ol, tétraéthylène glycol (PEG), triéthylène glycol mono(2-propynyl) éther (PEG-alcyne), 11-azido-3,6, Le 9-trioxaundécanol (PEG-azide) et la 11-azido-3,6,9-trioxaundécane-1-amine (NH2-PEG-azide) ont été achetés auprès de Tokyo Chemical Industry (Japon). β-hLys a été acheté chez Watanabe Chemical (Japon). DBCO-PEG4-5/6-FAM a été acheté auprès de Jena Bioscience (Allemagne). L'ester de DBCO-sulfo-N-hydroxysuccinimidyle (DBCO-Sulfo-NHS) a été acheté chez BROADPHARM (USA). L'ester FAM-NHS a été acheté chez ANASPEC (USA). R8-azide (9) et R8-FAM (11) ont été achetés auprès d'Eurofins Genomics (Japon). Les inhibiteurs d'endocytose/macropinocytose, c'est-à-dire l'oxyde de phénylarsine (PAO), Dynasore, la monodansylcadavérine (MDC) et l'amiloride d'éthylisopropyle (EIPA), ont été achetés auprès de Fujifilm Wako Pure Chemical (Japon), Adipogen Life Sciences (États-Unis), Sigma-Aldrich ( États-Unis) et TOCRIS bioscience (États-Unis), respectivement. Tous les autres produits chimiques utilisés étaient de qualité analytique.

S. albulus NBRC14147 a été utilisé pour produire ε-PαL et ses dérivés esters. E. coli BL21(DE3) a été utilisé pour surexprimer mAG, mKO et Cre recombinase. Des cellules cancéreuses cervicales humaines (HeLa), des cellules rénales embryonnaires humaines (HEK293T), des cellules de carcinome hépatocellulaire humain (HepG2) et des cellules de leucémie myéloïde aiguë humaine (K562) ont été achetées au RIKEN BioResource Research Center (Japon). Des cellules de neuroblastome humain (SH-SY5Y) et des cellules de fibroblastes dermiques humains (HDF) ont été achetées respectivement auprès de l'American Type Culture Collection (États-Unis) et de PromCell (Allemagne). Les lignées cellulaires (HeLa, HEK293T, HepG2, K562) authentifiées par le RIKEN BioResource Research Center (Japon) n'ont pas été davantage validées. Les lignées cellulaires, SH-SY5Y et HDF, n'ont pas été authentifiées. Nous avons acheté les lignées cellulaires (HeLa, HEK293T, HepG2, K562) testées pour la contamination par les mycoplasmes par RIKEN BioResource Research Center (Japon), mais SH-SY5Y et HDF n'ont pas été testées pour la contamination par les mycoplasmes.

Deux plasmides, pmAG1-S1 et pmKO1-MC1 (MBL, Japon), ont été utilisés comme modèles de PCR pour amplifier les gènes mAG et mKO, et le plasmide pmKO1-MC1 a également été utilisé pour construire le plasmide rapporteur d'activité Cre. pKU470 (un cadeau du Dr Haruo Ikeda)52 a été utilisé comme matrice de PCR pour amplifier le gène de la recombinase Cre.

S. albulus NBRC14147 a été cultivé dans du milieu M3G53 pendant 1 jour à 28 °C. Lorsque le pH du bouillon de culture atteint environ 4, 0,2 % (p/v) du polyol à chaîne courte (glycérol, 2-propyn-1-ol, 3-butène-1-ol, PEG, PEG-alcyne ou PEG-azide) a été ajouté au milieu de culture. Après culture pendant 2 jours à 28 ° C, le dérivé d'ester ε-PαL résultant dans le bouillon de culture a été analysé par HPLC-HR-ESI-MS (voir ci-dessous).

Les dérivés d'ester ε-PαL ont été purifiés à partir du bouillon de culture (1000 ml) en utilisant la formation de complexes ioniques comme décrit dans notre étude précédente54, puis purifiés davantage par HPLC préparative en utilisant une colonne en phase inverse (Sunniest RP-AQUA, 5 µm, 10,0 × 250 mm ; ChromaNik Technologies, Japon) à 35 °C à un débit de 7 ml min−1 et avec un gradient linéaire d'acétonitrile dans de l'eau dans du HFBA à 0,1 % (v/v) pendant 30 min (20 à 50 % [v/v] acétonitrile pendant 30 min). Les fractions ont été collectées et contrôlées par un détecteur ultraviolet (UV) à 210 nm. La fraction contenant les dérivés esters ε-PαL purifiés a été lyophilisée pour donner une poudre blanche (environ 300 mg). Les quantités de ε-PαL et des dérivés esters de ε-PαL produits dans le surnageant ont été déterminées selon la méthode rapportée par Itzhaki55.

En utilisant la méthode décrite dans notre étude précédente56, la Pls recombinante (rPls) a été purifiée à partir d'une souche de Streptomyces surexprimant. Nous avons effectué des réactions enzymatiques avec du glycérol et du PEG pour déterminer si les dérivés esters ε-PαL étaient produits par Pls. Le mélange réactionnel contenant 100 mM d'acide N-tris(hydroxyméthyl)méthyl-3-aminopropanesulfonique (TAPS)-NaOH (pH 8,5), 1 mM l-αLys, 5 mM MgCl2, 5 mM ATP, 1 mM dithiothréitol (DTT), 20 % (p/v) de glycérol, 0,2 % (p/v) de NP-40 et 300 µg ml-1 rPls ont été incubés avec et sans 1 % (p/v) de PEG à 25 °C pendant 10 min. Le mélange réactionnel contenant ε-PαL-glycérol (3) ou ε-PαL-PEG (6) a ensuite été analysé par HPLC-HR-ESI-MS (voir ci-dessous).

Les trois ensembles d'amorces PCR suivants (tableau supplémentaire 29) ont été conçus et utilisés pour amplifier les gènes de recombinase mAG, mKO et Cre : pET21a_mAG-F et pET21a_mAG-R pour la construction de mAG recombinant ; pET21a_mKO-F et pET21a_mKO-R pour la construction de mKO recombinant ; et pET21a_Cre-F et pET21a_Cre-R pour la construction de la recombinase Cre recombinante. Les produits de PCR ont été ligaturés avec le vecteur d'expression, pET21a (Novagen, USA). Après confirmation de leurs séquences d'ADN, les plasmides résultants ont été introduits dans E. coli BL21 (DE3) pour l'expression en tant que protéines de fusion à étiquette C-terminale 6 × His. Les protéines recombinantes (enzymes) ont été purifiées en utilisant des protocoles standard avec du nickel-acide nitriloacétique (Ni-NTA) Sepharose (Qiagen) puis utilisées pour d'autres expériences.

ε-PαL-FAM (10) : de l'ε-PαL-PEG-azide (8, 25 µmol) a été ajouté à 50 ml de DMSO à 80 % (v/v). Ensuite, du DBCO-PEG4-5/6-FAM (27,5 µmol) a été ajouté et le mélange a été agité pendant 3 h à 25 °C. Le ε-PαL-FAM (10) dans le mélange réactionnel a été analysé par HPLC-HR-ESI-MS et a ensuite été purifié par HPLC préparative comme décrit ci-dessus. Les fractions ont été collectées et contrôlées par un détecteur ultraviolet (UV) à 254 nm. La fraction contenant le 10 purifié a été lyophilisée pour donner une poudre jaune (environ 50 mg).

ε-PαL-mAG (12), ε-PαL-mKO (14) et ε-PαL-Cre (16) : Les protéines recombinantes (enzymes) (5 µmol) ont été ajoutées à 50 ml de NaHCO3 100 mM, avec Ester DBCO-sulfo-NHS (10 µmol). Après agitation pendant 4 h à 4 °C, les mélanges réactionnels ont été dialysés avec un tampon phosphate de sodium 20 mM (pH 6,0) et 8 (5,5 µmol) ont été ajoutés à 50 ml de la solution dialysée et agités pendant 4 h à 4 °C . De plus, 12 et 14 ont été purifiés davantage par chromatographie d'échange d'ions à l'aide d'une colonne HiTrap SP HP (Cytiva) sur le système AKTA (GE Healthcare) après confirmation des productions de 12, 14 et 16 par analyse HPLC-HR-ESI-MS (voir ci-dessous). Le tampon A (tampon phosphate de sodium 20 mM, pH 6,0) et le tampon B (tampon NaCl 2 M et phosphate de sodium 20 mM, pH 6,0) ont été utilisés comme éluants. Débit : 3 ml min−1 ; gradient : 0–20 volume de colonne (CV) (B, 10–75 %), 20–30 CV (B, 100 %). Les fractions ont été collectées et contrôlées par un détecteur UV à 280 nm. Les fractions contenant les protéines purifiées ont été concentrées par ultrafiltration (Vivaspin 6 ; Cytiva) puis utilisées pour d'autres expériences. ε-PαL-Cre (16) a été utilisé pour d'autres expériences sans purification par chromatographie échangeuse d'ions.

R8-mAG (13) et R8-mKO (15) : Les mAG et mKO recombinants (0,5 µmol) ont été ajoutés à 5 ml de NaHCO3 100 mM, avec l'ester DBCO-Sulfo-NHS (1 µmol). Après agitation pendant 4 h à 4 °C, les mélanges réactionnels ont été dialysés avec du tampon phosphate de sodium 20 mM (pH 6,0) et du R8-azide (9, 0,55 µmol) a été ajouté à 5 ml de la solution dialysée et agité pendant 4 h à 4 °C. Les conjugués résultants, 13 et 15, ont ensuite été purifiés par chromatographie échangeuse d'ions à l'aide d'une colonne HiTrap SP HP (Cytiva) sur le système AKTA (GE Healthcare) comme décrit ci-dessus, après confirmation des productions de 13 et 15 par HPLC-HR- Analyse ESI-MS (voir ci-dessous). Les fractions contenant 13 et 15 ont été concentrées par ultrafiltration (Vivaspin 6) puis utilisées pour d'autres expériences.

Le fragment d'ADN synthétique portant deux séquences loxP, un codon stop TGA et le gène de résistance à l'ampicilline (gène Ampr) (tableau supplémentaire 30) a été ligaturé avec pmKO1-MC1 digéré par BamHI et EcoRI. Le plasmide résultant, pmKO_loxP, a été digéré avec EcoRI et Hind III et ligaturé avec le fragment de gène mAG amplifié par les amorces de PCR (pmKO1_mAG-F et pmKO1_mAG-R, tableau supplémentaire 29) pour donner le plasmide rapporteur d'activité Cre (pmKO_loxP_mAG).

Un anticorps anti-α-tubuline (mAb, 1 µmol) (Fujifilm Wako Pure Chemical, Japon) a été ajouté à 10 ml de NaHCO3 100 mM, avec de l'ester FAM-NHS (4 µmol). Après agitation à 37 °C pendant 30 min, un ester DBCO-sulfo-NHS (4 µmol) a été ajouté au mélange réactionnel et agité à 37 °C pendant 30 min. Les mélanges réactionnels ont été dialysés avec un tampon phosphate de sodium 20 mM (pH 6,0) et 8 (2 umol) ont été ajoutés à 10 ml de la solution dialysée et agités pendant 4 h à 4 °C. En outre, 17 dans le mélange réactionnel a été concentré par ultrafiltration (Vivaspin 6) et utilisé pour d'autres expériences après confirmation de la production de 17 par analyse HPLC-HR-ESI-MS.

Les lignées cellulaires ont été cultivées à 37°C dans une atmosphère humidifiée avec 5% de CO2. Les lignées cellulaires et les milieux correspondants étaient les suivants : HeLa, milieu Eagles modifié de Dulbecco (DMEM) avec 10 % de sérum bovin fœtal (FBS) ; HEK293T, DMEM avec 10 % de FBS ; HepG2, DMEM avec 10 % de FBS ; HDF, DMEM avec 10 % de FBS ; SH-SY5Y, F-12 DMEM/Ham avec 10 % de FBS ; et K562, RPMI1640 avec 10 % de FBS. Tous les milieux contiennent 100 U/ml de pénicilline et 100 µg/ml de streptomycine.

Les cellules ont été ensemencées dans chaque puits d'une lame de verre à 8 puits (Matsunami, Japon) et ont été incubées à 37 ° C pendant 24 h. Un milieu frais contenant un échantillon (10–17, 24 ou 25) a été ajouté aux cellules puis incubé à 4 °C ou 37 °C pendant 60 min ou 120 min après avoir lavé les cellules avec le milieu. Les cellules ont ensuite été lavées avec du PBS, 100 µg ml-1 d'héparine dans du PBS, puis deux fois de plus avec du PBS. Nous avons ajouté 4 % de paraformaldéhyde dans du PBS pour fixer les cellules et les avons incubées à 25 °C pendant 30 min. 5 µg ml-1 d'agglutinine de germe de blé (WGA)/Alexa594 (ou Alexa488) dans du PBS ont été ajoutés et incubés à 25 °C pendant 10 min pour colorer la membrane cellulaire après avoir lavé les cellules trois fois avec du PBS. Ensuite, les cellules ont été traitées avec le réactif antifade ProLongTM Gold avec DAPI (Invitrogen, USA). Les cellules ont été observées en utilisant un microscope confocal à balayage laser LSM 900 (ZEISS).

Des cellules HeLa ont été ensemencées dans chaque puits d'une plaque à 12 puits (Falcon) et ont été incubées pendant 24 h à 37 ° C dans du DMEM contenant 10 % de FBS. Ensuite, un milieu frais contenant un échantillon (10–12, 24 ou 25) a été ajouté aux cellules puis incubé à 4 °C ou 37 °C pendant 5–60 min. Les cellules ont ensuite été lavées avec du PBS, suivi de 100 µg ml-1 d'héparine dans du PBS, puis deux fois avec du PBS. 300 ul de tampon de lyse (1% Triton X-100 dans Tris-HCl 100 mM, pH 8,0) ont été ajoutés aux cellules pour la lyse cellulaire. Les lysats cellulaires résultants ont été centrifugés pendant 30 min (21 500 × g à 4 °C), et la fluorescence (485 ex/535 em) des surnageants a été mesurée avec un lecteur de plaques fluorescentes (SpectraMax iD3 ; Molecular Devices ou SYNERGY 4 ; BioTek ).

Dans les dosages utilisant des inhibiteurs d'endocytose/macropinocytose, 1 µM de PAO, 100 µM de MDC, 100 µM de Dynasore ou 100 µM d'EIPA ont été ajoutés à la culture cellulaire.

Les cellules HeLa ont été ensemencées dans une boîte à fond de verre de 35 mm (Matsunami, Japon) et ont été incubées dans du DMEM contenant 10 % de FBS pendant 24 h à 37 °C. Ensuite, un milieu frais réchauffé (37 ° C) contenant 50 µM de ε-PαL-mAG (12) ou R8-mKO (15) a été ajouté, et les images accélérées des cellules ont été capturées toutes les 1 min pendant 30 min par un microscope confocal à balayage laser LSM 900 (ZEISS).

Les cellules HeLa ont été ensemencées dans une boîte à fond de verre de 35 mm (Matsunami, Japon) et ont été incubées à 37 ° C dans du DMEM contenant 10% de FBS pendant 24 h. Ensuite, un milieu frais contenant 50 µM de ε-PαL-mAG (12) ou R8-mKO (15) a été ajouté et les cellules ont été incubées à 37 °C pendant 60 min. Les cellules ont ensuite été lavées avec du PBS, suivi de 100 µg ml-1 d'héparine dans du PBS, puis deux fois de plus avec du PBS. Enfin, du DMEM frais contenant 10 % de FBS a été ajouté et incubé à 37 °C. Les images en accéléré ont été capturées toutes les 10 min pendant 12 h par microscopie à coupe optique (microscope à fluorescence tout-en-un BZ-X810; KEYENCE) pour suivre 12 ou 15 après les absorptions cellulaires.

Des cellules HEK293T ont été transfectées avec le plasmide pmKO_loxP_mAG en utilisant FuGENE Transfection (Promega) selon les spécifications du fabricant. Les cellules ont été lavées avec du milieu DMEM puis traitées avec 50 µM de ε-PαL-Cre (16) à 37 °C pendant 60 min. Les cellules ont ensuite été lavées avec du PBS, suivi de 100 µg ml-1 d'héparine dans du PBS, puis deux fois de plus avec du PBS. Enfin, du DMEM frais contenant 10 % de FBS a été ajouté et incubé à 37 °C pendant 24 h pour exprimer une protéine fluorescente. L'imagerie des cellules vivantes a été capturée par microscopie à fluorescence (Leica DMi8).

N,N-bis(tert-butoxycarbonyl)-l-β-Lysine [(Boc)2-l-βLys; 1,5 mmol]·DCHA, qui avait été synthétisé comme décrit dans la note supplémentaire selon les méthodes précédemment décrites57, a été extrait à l'acide avec AcOEt/10 % d'acide citrique pour éliminer le DCHA. Du NH2-PEG-azide (0,55 mmol) et du DMT-MM (1,5 mmol) ont été ajoutés à une solution de MeOH (10 ml) de (Boc)2-l-βLys libre, et le mélange a été agité à température ambiante pendant une nuit. Le résidu a été dissous dans Et20 (10 ml), lavé avec de la saumure et séché (Na2S04) après concentration sous vide. Un (Boc)2-l-βLys-PEG-azide brut ainsi obtenu par évaporation a été ajouté à HCl 4N/AcOEt (20 ml), et le mélange a été agité à température ambiante pendant 3 h. Après evaporation, le HCl resté dans le mélange a été encore éliminé par évaporation azéotropique avec du toluène/MeOH. Le résidu a été dissous dans de l'eau et lyophilisé, donnant du 1-βLys-PEG-azide (18)·HCl sous la forme d'une huile incolore (rendement de 22 %, 2 étapes). l-βhLys-PEG-azide (20)·HCl (rendement 38 %) et l-αLys-PEG-azide (22)·HCl (rendement 81 %) ont été synthétisés à partir de l-βhLys et l-αLys, respectivement, par bis -Dérivatisation Boc, condensation avec NH2-PEG-azide et déprotection subséquente. Leurs données RMN sont résumées dans les tableaux supplémentaires 19, 21 et 23.

Selon la méthode décrite dans notre précédente étude3, l'ORF19 recombinant (rORF19) a été purifié à partir d'une souche d'E. coli surexprimant. Un mélange réactionnel (100 μl) composé de 50 mM de TAPS (pH 9,0), 18 % (v/v) de glycérol, 5 mM d'ATP, 5 mM de MgCl2, 5 mM de l-βLys, 1 mM de substrat accepteur (18, 20 ou 22), et 0,1 mg ml-1 rORF19 a été incubé pendant 1 h à 30 °C. La réaction a été arrêtée par chauffage à 100 ° C pendant 5 min, le mélange a été centrifugé et le surnageant a été analysé par HPLC-HR-ESI-MS (voir ci-dessous).

Un mélange réactionnel (20 ml) composé de 50 mM TAPS (pH 9,0), 18 % (v/v) de glycérol, 5 mM ATP, 5 mM MgCl2, 5 mM l-βLys, 1 mM 20 et 1 mg ml-1 rORF19 a été incubé à 30 ° C pendant la nuit (réaction enzymatique du 1er tour, tableau supplémentaire 25). Le ε-OβLm-PEG-azide résultant (21) a été purifié par une colonne échangeuse d'ions jetable (colonne InertSep MC-2; GL Science, Japon). Le mélange (20 ml) a été ajouté à 80 ml de méthanol aqueux à 20 % (v/v) et appliqué sur une colonne d'InertSep MC-2 (forme Na+ ; 1 g : équilibré avec du méthanol aqueux à 20 % (v/v)) après ajustement du pH du mélange réactionnel à 7 par HCl. Le produit (chaîne courte 21, 2–9 mer) a été élué avec 10 ml de NH4OH 1 M après avoir lavé la colonne avec 50 ml de méthanol aqueux à 20 % (v/v). La fraction d'élution a été lyophilisée puis utilisée comme substrat accepteur pour la réaction enzymatique du 2e tour. Le mélange de réaction enzymatique du 2e tour (20 ml) composé de 50 mM TAPS (pH 9,0), 18 % (v/v) de glycérol, 5 mM ATP, 5 mM MgCl2, 5 mM l-βLys, 1 mM chaîne courte 21 ( 2–9 mer), et 1 mg ml-1 rORF19 a été incubé pendant une nuit à 30 ° C (tableau supplémentaire 25). Le produit de la réaction, chaîne longue 21 (2–13 mer), a été purifié par InertSep MC-2, puis purifié davantage par HPLC préparative à l'aide d'une colonne en phase inversée (Sunniest RP-AQUA : 5 µm, 10,0 × 250 mm ; ChromaNik Technologies, Japon) à 40 °C à un débit de 7 ml min−1 et avec un gradient linéaire d'acétonitrile dans de l'eau dans du HFBA à 0,1 % (v/v) pendant 36 min [20–38 % (v/v) acétonitrile pendant 36 min]. Les fractions ont été collectées et contrôlées par un détecteur ultraviolet (UV) à 210 nm. La fraction contenant le 21 purifié a été lyophilisée et utilisée pour d'autres expériences.

e-OßLm-FAM (24) et e-OßLm-mAG (25) ont été synthétisés par la même procédure que celle utilisée pour la synthèse de 10 et 12 (voir ci-dessus).

ε-PαL (1), ε-PαL-glycérol (3), ε-PαL-alcyne (4), ε-PαL-alcène (5), ε-PαL-PEG (6), ε-PαL-PEG-alcyne (7), ε-PαL-PEG-azide (8) et ε-PαL-FAM (10) ont été analysés par HPLC-HR-ESI-MS (maXis plus ; Bruker) en utilisant une colonne en phase inverse (SunShell HFC18– 16 : 2,6 µm, 2,1 × 150 mm ; ChromaNik Technologies, Japon) à 40 °C à un débit de 0,3 ml min−1 et avec un gradient linéaire en trois étapes d'acétonitrile (ACN) dans de l'eau à 0,1 % (v/ v) acide heptafluorobutyrique (HFBA) (Fujifilm Wako Pure Chemical, Japon) pendant 30 min [10–25 % (v/v) ACN pendant 5 min, 25–60 % (v/v) ACN pendant 17 min, 60– ACN à 95 % (v/v) pendant 5 min et ACN à 95–95 % (v/v) pendant 3 min].

ε-PαL-mAG (12), R8-mAG (13), ε-PαL-mKO (14), R8-mKO (15) et ε-PαL-Cre (16) ont été analysés par HPLC-HR-ESI- MS (maXis plus) en utilisant une colonne en phase inverse (Sunshell C8-30HT : 3,4 µm, 2,1 × 150 mm ; ChromaNik Technologies) à 70 °C à un débit de 0,3 ml min−1 et avec un gradient linéaire d'ACN dans eau dans de l'acide trifluoroacétique (TFA) à 0,1 % (v/v) pendant 30 min [12 et 13, 31-37 % (v/v) d'ACN pendant 30 min ; 14 et 15, ACN 2–90 % (v/v) pendant 30 min ; 16, 20–70 % (v/v) ACN pendant 30 min].

l-βLys-PEG-azide (18), l-βhLys-PEG-azide (20) et l-αLys-PEG-azide (22) ont été analysés par HPLC-HR-ESI-MS (maXis plus) à l'aide d'un -phase (SunShell HFC18-16 : 2,6 µm, 2,1 × 150 mm ; ChromaNik Technologies, Japon) à 40 °C à un débit de 0,3 ml min−1 et avec un gradient linéaire en trois étapes d'ACN dans l'eau dans 0,1 % (v/v) HFBA exécuté sur 30 min (5–25 % [v/v] ACN pendant 5 min, 25–35 % [v/v] ACN pendant 17 min, 35–95 % [v/v] ACN pendant 5 min et 95–95 % [v/v] ACN pendant 3 min).

Les spectres RMN 1H et 13C ont été enregistrés à 600 et 150 MHz, respectivement, en utilisant un JNM-ECA 600 RMN (JEOL). Des expériences unidimensionnelles et bidimensionnelles (spectroscopie à corrélation filtrée double quantique [DQF-COSY] et connectivité multi-liaison hétéronucléaire à temps constant [CT-HMBC]) ont été réalisées à température ambiante. Les échantillons ont été dissous dans du D2O.

Toutes les analyses statistiques ont été effectuées à l'aide du logiciel GraphPad Prism (ver. 8 ; GraphPad, San Diego, CA, USA). Les différences étaient considérées comme significatives lorsque la valeur p calculée était < 0,05. Aucune méthode statique n'a été utilisée pour prédéterminer la taille de l'échantillon. Lorsque des analyses statiques ont été effectuées, les tailles d'échantillon sont répertoriées dans les légendes des figures correspondantes. Toutes les expériences présentées dans le manuscrit étaient reproductibles. Les résultats sont présentés sous forme de moyenne ± écart type (sd) (n = 3). Les informations concernant le nombre de répétitions biologiques et techniques sont rapportées pour les expériences individuelles dans les légendes des figures.

De plus amples informations sur la conception de la recherche sont disponibles dans le résumé des rapports de recherche sur la nature lié à cet article.

Toutes les données sont disponibles dans les figures principales et les figures supplémentaires. Données brutes pour les Fig. 3c–j, 4b–g, 8b–e, Supplémentaire Fig. 7a–f et Supplémentaire Tableau 19 sont disponibles dans les Données supplémentaires 1–5. Le plasmide, pmKO_loxP_mAG, construit dans cette étude a été déposé dans l'Addgene sous le numéro d'identification 192857.

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Cette recherche a été soutenue par une subvention JSPS KAKENHI pour la recherche scientifique sur les domaines innovants 16H06445 (YH), ​​par le programme de prospective JSPS A3, par les subventions JSPS KAKENHI 16H03284 (YH) et 20H02918 (YH), ​​et par la Fondation japonaise pour l'enzymologie appliquée (YH ), la Nagase Science and Technology Foundation (YH) et la Amano Enzyme Foundation (YH). Nous remercions H. Fujino pour la discussion sur la culture cellulaire.

Ces auteurs ont contribué à parts égales : Yamato Takeuchi, Kazunori Ushimaru, Kohei Kaneda.

École supérieure de biosciences et de biotechnologie, Université préfectorale de Fukui, Eiheiji-cho, Fukui, 910-1195, Japon

Yamato Takeuchi, Kazunori Ushimaru, Kohei Kaneda, Chitose Maruyama, Takashi Ito, Hajime Katano et Yoshimitsu Hamano

Institut de recherche pour une chimie durable, Institut national des sciences et technologies industrielles avancées (AIST), Tsukuba, Ibaraki, 305-8565, Japon

Kazunori Ushimaru

Fukui Bio Incubation Center (FBIC), Université préfectorale de Fukui, Eiheiji-cho, Fukui, 910-1195, Japon

Chitose Maruyama, Takashi Ito et Yoshimitsu Hamano

MicrobeChem Inc., Eiheiji-cho, Fukui, 910-1195, Japon

Chitose Maruyama et Yoshimitsu Hamano

Département des sciences et technologies de la vie, Université du Kansai, Suita, Osaka, 564-8680, Japon

Kazuya Yamanaka

École supérieure d'ingénierie, Université d'Hokkaido, Kita-ku, Sapporo, Hokkaido, 060-8628, Japon

Yasushi Ogasawara et Tohru Dairi

Département de biotechnologie, Université préfectorale de Toyama, Imizu-shi, Toyama, 939-0398, Japon

Yasuo Kato

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YH a conçu et conçu le projet. YT, KU et KY ont réalisé des expériences et collecté des données concernant ε-PαL. HK a développé des protocoles pour la purification des dérivés d'esters ε-PαL. KK et CM ont réalisé des expériences et collecté des données concernant ε-OβL. TI a discuté et interprété les résultats des cultures cellulaires. CM, YO et TD ont analysé les composés et élucidé leurs structures chimiques. YK a synthétisé L-βLys. YH a écrit le manuscrit, et tous les autres auteurs l'ont revu et commenté.

Correspondance à Yoshimitsu Hamano.

YH et KU sont co-inventeurs d'une demande de brevet (PCT/JP2018/031153) déposée par l'Université préfectorale de Fukui concernant les travaux de ce manuscrit. YH et CM sont co-fondateurs de MicrobeChem Inc. Les autres auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Communications Biology remercie Rakesh Tiwari, Ole Tietz et les autres examinateurs anonymes pour leur contribution à l'examen par les pairs de ce travail. Rédacteur en chef de la gestion principale : Zhijuan Qiu. Les rapports des pairs examinateurs sont disponibles.

Note de l'éditeur Springer Nature reste neutre en ce qui concerne les revendications juridictionnelles dans les cartes publiées et les affiliations institutionnelles.

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Réimpressions et autorisations

Takeuchi, Y., Ushimaru, K., Kaneda, K. et al. Première preuve directe de pénétrations directes dans la membrane cellulaire d'homopoly(acides aminés) polycationiques produits par des bactéries. Commun Biol 5, 1132 (2022). https://doi.org/10.1038/s42003-022-04110-4

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Reçu : 03 juin 2022

Accepté : 13 octobre 2022

Publié: 26 octobre 2022

DOI : https://doi.org/10.1038/s42003-022-04110-4

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