Révéler les protéoformes de Corynebacterium glutamicum par le haut

Rapports scientifiques volume 13, Numéro d'article : 2602 (2023) Citer cet article

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Corynebacterium glutamicum est une bactérie largement utilisée dans la production industrielle d'acides aminés ainsi que d'une large gamme d'autres produits biotechnologiques. La présente étude décrit la caractérisation des protéoformes de C. glutamicum et leurs modifications post-traductionnelles (PTM) utilisant la protéomique descendante. Malgré des preuves antérieures de PTM jouant un rôle dans la régulation du métabolisme de C. glutamicum, il s'agit de la première analyse descendante du protéome de cet organisme. Nous avons identifié 1125 protéoformes à partir de 273 protéines, avec 60% des protéines présentant au moins un déplacement de masse, suggérant la présence de PTM, dont plusieurs protéoformes acétylées, oxydées et formylées. De plus, des protéines pertinentes pour la production d'acides aminés, la sécrétion de protéines et le stress oxydatif ont été identifiées avec des changements de masse suggérant la présence de PTM et de protéoformes non caractérisés qui peuvent affecter les processus biotechnologiquement pertinents chez ce cheval de bataille industriel. Par exemple, les protéines membranaires mepB et SecG ont été identifiées comme une protéoforme clivée et formylée, respectivement. Dans le métabolisme central, OdhI a été identifié comme deux protéoformes ayant une pertinence biologique potentielle : une protéoforme clivée et une protéoforme avec des PTM correspondant à un déplacement de masse de 70 Da.

La bactérie Corynebacterium glutamicum est un bourreau de travail industriel capable de produire une large gamme de biomolécules à partir d'un large pool de substrats1 et est actuellement la meilleure option pour la production d'acides aminés L-alpha2. La production d'acides aminés représente un marché de plusieurs milliards de dollars3, avec une production annuelle d'environ 10 millions de tonnes dans le monde2, le l-glutamate et la l-lysine correspondant respectivement à 3,3 millions de tonnes/an et 2,2 millions de tonnes/an2. Outre la production d'acides aminés, C. glutamicum est également utilisé dans d'autres processus biotechnologiques, tels que la production de protéines hétérologues4, d'acides organiques5, de caroténoïdes, d'isobutanol6, de polymères7 et, plus récemment, son potentiel dans les processus de bioremédiation a été étudié8.

Les développements récents en protéomique ont démontré l'importance des modifications post-traductionnelles (PTM) chez plusieurs espèces de bactéries9. Chez C. glutamicum, l'importance des PTM a été étudiée précédemment, révélant l'effet crucial de la phosphorylation de l'inhibiteur de l'oxoglutarate déshydrogénase (OdhI) dans la production de l-glutamate10,11. Plus récemment, la protéomique par spectrométrie de masse de C. glutamicum a montré l'influence des conditions de production de l-glutamate sur la succinylation et l'acétylation des protéines métaboliques de C. glutamicum, dont OdhI12.

Il existe actuellement deux principales approches protéomiques appelées bottom-up et top-down. En bref, dans l'approche ascendante, les protéines sont clivées par une protéase (généralement la trypsine) et les peptides suivants sont analysés par spectrométrie de masse, tandis que dans la procédure descendante, les protéines sont examinées sous leurs formes intactes13. En conséquence de la digestion par les protéases, les informations de plusieurs régions protéiques peuvent être perdues dans les approches ascendantes, y compris les PTM. De plus, dans cette approche, l'identité des protéines est déduite sur la base de l'identification des peptides, ce qui peut entraîner une ambiguïté dans les cas où les peptides peuvent appartenir à plus d'une protéine13. En revanche, l'approche descendante permet l'identification de la séquence complète des protéines. De plus, l'analyse de formes intactes de protéines permet l'identification de protéoformes, définies comme différentes formes de protéines dérivées d'un même gène14. Ces protéoformes peuvent être générées par substitution de résidus d'acides aminés, clivage protéolytique, épissage alternatif et plusieurs types de PTM15. De plus, différentes protéoformes de la même protéine peuvent avoir des fonctions différentes et affecter les processus biologiques d'un organisme16. La puissance de la protéomique descendante a été appliquée à d'autres bactéries17. Par exemple, la protéomique descendante d'Escherichia coli et l'identification des protéoformes ont été réalisées18. Malgré la preuve de la pertinence des PTM dans le métabolisme de C. glutamicum, aucune étude protéomique descendante n'a été publiée à ce jour. Ici, nous avons effectué la première analyse protéomique descendante de C. glutamicum, en utilisant une approche tolérante aux précurseurs pour identifier et révéler les PTM et les protéoformes.

Comme prévu, une large gamme de masses moléculaires protéoformes a pu être observée dans les protéines intracellulaires pré-fractionnées, mais GELFrEE a été efficace pour séparer les grandes protéoformes des formes plus petites (Fig. 1A). Les fractions 0, 1, 2, 3, 4, 5, 7, 9 et 11 présentaient des protéoformes inférieures à 50 kDa et, pour cette raison, ont été choisies pour une analyse LC-MS/MS ultérieure. Malgré la présence manifeste de protéines dans la plage de 30 à 50 kDa, comme le montre SDS-PAGE (Fig. 1A), l'analyse LC – MS a détecté des protéoformes principalement inférieures à 30 kDa (Fig. S1 supplémentaire). Le nombre réduit de protéoformes observées supérieures à 30 kDa peut être dû à des défis connus pour l'identification de grandes protéoformes dénaturées telles que la réduction du rapport signal sur bruit se produisant avec l'augmentation du poids moléculaire de la protéoforme19.

SDS-PAGE des fractions GELFrEE et profil global des déplacements de masse identifiés (Δm). (A) SDS-PAGE des fractions résultant de GELFrEE (représentées par les nombres) et de l'échantillon pré-fractionné (T). (B) Différence des masses précurseurs observées et théoriques (décalages de masse, Δm) PrSMs count histogram, où les dix Δm les plus fréquents sont mis en évidence dans différentes couleurs. Le bac a été fixé à 1 et les limites x à -500 Da et 500 Da.

L'analyse protéomique descendante de C. glutamicum a généré 5127 correspondances de spectre de protéoformes (PrSM), fournissant l'identification de 1125 protéoformes différentes liées à 273 protéines différentes (tableau 1 supplémentaire). Environ 65% (177 protéines) du nombre total de protéines et 47% des PrSM (2423 PrSM) ont été identifiés avec des déplacements de masse (Δm), des différences de masse entre la masse de précurseur attendue et la masse de précurseur observée, ce qui suggère la présence de PTM. Les PTM putatifs ont été annotés dans le tableau supplémentaire 1 en utilisant l'ensemble de la base de données Unimod, cependant, ces informations doivent être utilisées avec prudence, car les spectres n'ont pas été vérifiés manuellement et le logiciel a pris en compte les déplacements de masse arrondis pour les comparaisons, générant une tolérance d'environ 0,5 Da. Il existe des logiciels disponibles pour la visualisation des spectres et une évaluation plus approfondie des PTM, notamment ProSight Lite20 et TopMSV21. L'analyse de tous les PrSM avec Δm a révélé une grande diversité de Δm, suggérant la présence de différents PTM (Fig. 1B).

Certains des Δm les plus fréquents identifiés ici ont également été signalés comme étant très présents dans Escherichia coli par le biais d'une protéomique ascendante utilisant une stratégie d'identification impartiale22. Chez C. glutamicum, les déplacements de masse les plus fréquemment identifiés étaient de 16 Da (oxydation putative, 10,15 % des PrSM modifiés), -18 Da (déshydratation putative, 2,97 % des PrSM modifiés) et 32 Da (double oxydation possible, 1,32 % des PrSM). PrSM modifiés). Fait intéressant, la proportion de correspondances de spectre de peptides (PSM) identifiées par E. coli avec -18 Da (3,8 %) et 32 Da (0,8 %) Δm était très similaire à celles trouvées dans cette étude. En revanche, la proportion de PSM identifiés avec 16 Da (24%) Δm dans E. coli était supérieure à celle de C. glutamicum. Cependant, il convient de mentionner que le nombre élevé de PrSM identifiés avec 15 Da Δm (6, 11% des PrSM modifiés) peut être causé par une mauvaise identification du 16 Da Δm, comme nous le verrons plus en détail dans les prochains sujets.

Les protéines identifiées avec Δm ont été analysées à l'aide de l'application String Cytoscape, après avoir regroupé les protéines en fonction de leurs nœuds d'interaction, chaque cluster a été soumis à une analyse de surreprésentation et les termes les plus représentatifs étaient liés à différents termes d'ontologie génique tels que les complexes contenant des protéines, l'activité de transfert d'électrons et domaine CYTH (CyaB, thiamine triphosphatase), métabolisme de la pyrimidine, hélice transmembranaire, biosynthèse des métabolites secondaires et domaine thiorédoxine. De plus, huit PrSM ribosomiques présentaient deux Δm, indiquant la présence d'au moins deux PTM simultanées (Fig. S2 supplémentaire).

Au-delà de l'annotation fonctionnelle, nous avons analysé le nombre d'acétylation N-terminale et certains Δm fréquemment identifiés : 16 Da, 15 Da, 28 Da, 266 Da, -18 Da et 32 Da (Fig. 2A). Ces Δm suggèrent la présence d'oxydation (UnimodAC : 35, Δm = 15,994915 Da), de désamidation suivie d'une méthylation (UnimodAC : 528, Δm = 14,999666 Da), de formylation (UnimodAC : 122, Δm = 27,994915 Da), de dodécylsulfate de sodium ( SDS) adduits23, déshydratation (UnimodAC : 23, Δm = −18,010565 Da) et persulfure (UnimodAC : 421, Δm = 31,972071 Da). Le déplacement de masse de 28 Da peut également correspondre à une di-méthylation (Unimod : 36, Δm = 28,031300 Da). Bien qu'il soit difficile de différencier la formylation de la di-méthylation, le nombre plus élevé de Δm proche de 27, 99 Da et 27, 98 Da (tableau supplémentaire 2) incline l'inférence vers les événements de formylation. La localisation des résidus d'acides aminés du déplacement de masse de 28 Da n'a pas été possible sans ambiguïté, comme le montre l'absence de ce déplacement de masse sur la figure 2B. Une raison possible à cela est que les événements de formylation suggérés ont été identifiés principalement à l'extrémité N-terminale des protéines, et son affectation était toujours entre quelques résidus N-terminaux de la protéine, comme dans le cas de la protéine MscL (Fig. 7). Lorsque l'attribution du déplacement de masse était dans plus d'un résidu d'acide aminé, l'information n'a pas été tracée pour éviter toute ambiguïté. Les événements d'oxydation suggérés liés au 16 Da Δm sont en outre étayés par un grand nombre de résidus de méthionine modifiés par ce déplacement de masse (Fig. 2B). En revanche, le 15 Da Δm semble être parfois mal interprété, puisque le résidu le plus fréquemment identifié avec cette modification était aussi la méthionine. Cependant, certains résidus d'acide glutamique ont été identifiés avec ce Δm, ce qui suggère qu'une désamidation suivie d'une méthylation peut encore être présente dans certains cas, mais est facilement confondue avec des oxydations (Fig. 2B). Le déplacement de masse de 32 Da identifié dans certaines protéines pourrait être lié au persulfure PTM, cependant, cette modification se produit dans la cystéine et l'acide aspartique, et aucun de ceux-ci n'a pu être observé dans les résidus identifiés sans ambiguïté (Fig. 2B). Une autre possibilité serait deux oxydations, soutenues par les résidus de méthionine identifiés avec ce déplacement de masse. D'autre part, la possibilité d'une modification du persulfure ne doit pas être exclue, principalement dans les protéines dans lesquelles le résidu d'acide aminé modifié n'a pas pu être identifié sans ambiguïté. L'oxydation des protéines peut avoir une grande importance dans les processus biologiques, cependant, il est important de noter qu'elle peut également être un artefact causé par la manipulation des échantillons24. De plus, plusieurs Δm valent environ 266 Da, suggérant la présence d'adduits issus du dodécylsulfate de sodium (SDS). La présence d'artefacts SDS a également été signalée dans une analyse protéomique intacte d'E. coli et a été suggérée comme étant causée par une élimination incomplète du détergent25. En ce qui concerne le -18 Da Δm, il peut résulter d'événements de déshydratation et a été principalement identifié dans les résidus de sérine (Fig. 2B). Ces déplacements de masse prédominants peuvent également être liés à d'autres PTM putatifs, tels que l'oxydation de la tyrosine en 2-aminotyrosine (UnimodAC : 342, Δm = 15,010899 Da) pour les déplacements de masse de 15 Da. Ces possibilités peuvent être observées séparément pour chaque PrSM identifié dans le tableau supplémentaire 1. L'acétylation N-terminale était la PTM la plus fréquemment identifiée (Fig. 2A); en revanche, le déplacement de masse de 42 Da, qui suggère l'acétylation de la lysine (UnimodAC : 1, Δm = 42,010565 Da) n'a pas été fréquemment détecté (tableau 2 supplémentaire). Lors de l'identification des protéoformes, l'acétylation N-terminale a été utilisée comme modification variable. Par conséquent, les protéoformes avec une acétylation de la lysine près du N-terminal sans fragments pour expliquer le déplacement de masse de 42 vers un résidu de lysine pourraient être confondues avec une acétylation N-terminale.

Nombre de PrSM identifiés et d'accessions protéiques des modifications les plus fréquentes et rapport des résidus identifiés sans ambiguïté de chaque déplacement de masse. (A) Nombre de correspondances de spectre de protéoformes (PrSM) et de protéines identifiées avec les déplacements de masse les plus fréquents et l'acétylation N-terminale. (B) Rapport entre le nombre de PrSM d'un résidu d'acide aminé modifié par chaque déplacement de masse (Δm) et le total des PrSM identifiés avec le même Δm. Par exemple, le nombre de méthionine identifié avec un déplacement de masse de 16 Da (41 PrSM)/nombre de tous les résidus identifiés avec 16 Da Δm (85 PrSM) = 48 % (représenté par la barre vert clair au-dessus du (M) dans le x axe).

L'analyse de la surreprésentation des protéines appartenant aux six modifications les plus fréquentes a permis d'identifier des termes liés aux protéines ribosomales, prédominantes dans les protéines avec Δm de -18 Da, 15 Da, 16 Da et les protéines acétylées N-terminales (Fig. 3). Les protéines ribosomiques procaryotes sont décrites comme étant généralement méthylées et acétylées26. En revanche, les Δm de 28 Da et 266 Da étaient surreprésentés pour les termes liés aux protéines membranaires. De plus, les protéines identifiées avec un déplacement de masse de 28 Da ont montré une surreprésentation du système de sécrétion et de l'exportation de protéines (Fig. 3).

Analyse de la surreprésentation des protéines en fonction des modifications identifiées et des déplacements de masse. Les codes d'accession des protéines de chaque modification ou déplacement de masse ont été soumis séparément à une analyse de surreprésentation sur DAVID par rapport à toutes les protéines codées du génome de C. glutamicum. Le FDR résultant, représentant le score d'enrichissement, et le pourcentage, représentant la proportion de protéines identifiées par rapport à toutes les protéines présentes dans l'ensemble de gènes associé, ont été tracés à l'aide de la représentation graphique à bulles ggplot2.

Nous avons identifié 13 protéines qui présentaient plus de 15 protéoformes et la plupart d'entre elles étaient ribosomiques (Fig. S3 supplémentaire). De plus, en considérant des protéines avec plus de 9 protéoformes, l'annotation des composants cellulaires a également révélé des protéines membranaires (Fig. S3 supplémentaire). Malgré le grand nombre de protéoformes, il convient de mentionner que certaines d'entre elles peuvent être stimulées par des adduits SDS. Par exemple, les protéoformes de la protéine ribosomique 50S L7/L12 (Q8NT28) ont été identifiées avec Δm de 266 Da, 532 Da et 401 Da, représentant probablement l'ajout d'un adduit SDS, de deux adduits SDS et de deux adduits SDS plus la perte du résidu méthionine initiateur. La présence d'adduits de SDS dans les protéines n'est pas souhaitable, cependant, l'identification de ces protéines est importante pour éviter les erreurs d'identification et pour attribuer des protéines qui n'étaient identifiables que par des formes d'adduction25.

Afin de contribuer avec des données plus précises concernant les processus biotechnologiques et métaboliques de C. glutamicum, certains PrSM liés ou potentiellement impliqués dans ces fonctions ont été caractérisés manuellement par l'inspection des spectres MS1 et MS2 (tableau 1).

La protéine du système de sécrétion (SecG) (Fig. 4A) et le canal mécanosensible à grande conductance (MscL) (Fig. S4 supplémentaire) ont été identifiés avec des déplacements de masse de 28 Da. Les fragments PrSMs de ces protéoformes présentaient des ions supportant l'identification d'un déplacement de masse de 28 Da, toujours près de l'extrémité N-terminale, et les erreurs de masse des fragments contenant ce Δm étaient extrêmement faibles. Un exemple d'inspection MS1 et MS2 est démontré avec SecG (Q8Z469) (Fig. 4A). Dans cette figure, le grand nombre d'ions b soutenant le déplacement de masse de 27,9883 (b4, b5, b6, b7, b8, b9, b10, b11 et b12) représenté par les lignes bleues dans la séquence protéique est montré, et il peut On voit que le déplacement de masse est localisé dans une région très étroite de trois résidus d'acides aminés, en raison des plusieurs ions b contenus dans cette région.

PrSM de la protéine membranaire d'exportation de protéines SecG (Q9Z469) et de la métalloendopeptidase putative mepB (Q8NS24). Dans la région supérieure des deux images (A et B), on peut voir la séquence de la protéine identifiée, où les sites possibles du Δm sont représentés par des résidus mis en évidence sur fond bleu et les fragments appariés sont représentés par des lignes bleues entre les résidus d'acides aminés. Dans la région inférieure, le MS1 et la fenêtre d'isolement du précurseur identifié sont représentés (côté droit de chaque figure) ainsi que la représentation de masse du spectre MS2 attaché à l'erreur de masse des fragments appariés. (A) Inspection du déplacement de masse de 28 Da identifié dans SecG, où nous avons pu voir que 12 fragments (tous des ions b) soutiennent l'identification du déplacement de masse de 27,9883 près du N-terminal. L'erreur de masse d'une grande partie de ces fragments était proche de 0 ppm, comme illustré au bas de l'image. (B) Inspection de la protéoforme clivée mepB (site de clivage représenté par le crochet rouge), qui montre un grand nombre de fragments soutenant la protéoforme clivée (tous les ions b) avec une erreur de masse proche de 0 ppm.

Le déplacement de masse de 28 Da près de l'extrémité N-terminale de ces protéines suggère la présence d'une formylation N-terminale (Unimod : 122, Δm = 27,994915 Da) dans les protéoformes identifiées. Des preuves récentes ont suggéré la formylation N-terminale de la méthionine comme signal de dégradation des protéines. Ce mécanisme a été supposé être un contrôle de la qualité de la traduction des protéines chez les bactéries27. Les PrSM formylées SecG et MscL mentionnées ci-dessus ont été identifiées avec la présence de méthionine N-terminale. Ceci suggère un possible mécanisme de dégradation des protéines membranaires, dont certaines ont des applications biotechnologiques prometteuses. Par exemple, la protéine SecG fait partie de la voie d'exportation de la protéine Sec. Il existe un intérêt croissant pour la capacité de C. glutamicum à exprimer et à sécréter des protéines hétérologues d'intérêt biotechnologique4,28. De plus, MscL et MscS sont des canaux mécanosensibles, connus pour réagir au stress osmotique. Un autre canal mécanosensible de C. glutamicum (MscCG ; P42531) joue un rôle majeur dans l'efflux de l-glutamate29.

La protéomique descendante est efficace pour identifier les protéoformes clivées. Par exemple, mepB, une protéine membranaire apparentée à la métalloendopeptidase (Q8NS24) a été identifiée par une partie de sa séquence avec une masse précurseur de 14,464 kDa. Cette masse correspond à la perte de 97 résidus d'acides aminés de sa région N-terminale (Fig. 4B). En revanche, un site de clivage mepB était supposé se situer entre Ala43 et Ala44, après un peptide signal putatif ou une hélice transmembranaire30. De plus, selon pfam (https://pfam.xfam.org/), mepB possède un domaine appartenant à la famille des métallopeptidases M23 (MEROPS) [130–226]. Un membre bien caractérisé de MEROPS est la protéine LytM de Staphylococcus aureus, une métallopeptidase impliquée dans l'autolyse31. Il a été démontré que le clivage dans la chaîne N-terminale provoque l'activation de son activité peptidase32. De plus, les protéines MEROPS ont une spécificité pour les régions de polyglycine de peptidoglycane, certaines avec une activité de métabolisme de la paroi cellulaire suggérée33. En accord, le gène mepB de C. glutamicum a été décrit comme faisant partie du régulon MtrAB, un système à deux composants impliqué dans l'osmorégulation et le contrôle du métabolisme de la paroi cellulaire34. Bien qu'il ne soit pas clair si mepB est sécrété ou lié à la membrane, il a été suggéré que son activité se produirait de manière extracitoplasmique30. Compte tenu de cela, C. glutamicum mepB peut avoir un rôle important dans le métabolisme de la paroi cellulaire et/ou l'intégrité de la sécrétion de protéines hétérologues, et son activité est probablement régulée par le clivage de son N-terminal.

C. glutamicum est largement utilisé dans la production industrielle d'acides aminés, en particulier le l-glutamate, qui est produit en millions de tonnes par an35. Le cycle de l'acide tricarboxylique (TCA) est une étape importante dans la production de l-glutamate par C. glutamicum. Il est bien établi que la diminution de l'activité du complexe 2-oxoglutarate déshydrogénase (ODHC) se produit dans des conditions qui induisent la production de l-glutamate36,37. De plus, l'activité de l'ODHC s'est avérée être régulée par le statut de phosphorylation de l'inhibiteur de l'oxoglutarate déshydrogénase (OdhI, Q8NQJ3). Ainsi, la protéoforme phosphorylée d'OdhI est incapable d'interagir avec l'ODHC, tandis que l'OdhI non phosphorylé interagit avec l'ODHC en inhibant la conversion du 2-oxoglutarate en succinyl-CoA11 (figure 5A). De plus, la diminution de l'activité de l'ODHC entraîne une production accrue de l-glutamate à partir du 2-oxoglutarate37 (Fig. 5A). De manière congruente, le statut de phosphorylation d'OdhI est affecté par des méthodes qui induisent la production de l-glutamate11.

Représentation des interactions OdhI connues et putatives avec l'ODHC et son impact sur la production de l-glutamate. (A) Interaction d'OdhI et d'ODHC entravée par la phosphorylation d'OdhI. L'absence du groupe phosphate sur OdhI entraîne son interaction et l'inhibition de l'ODHC (représenté par le symbole rouge), et le flux vers la production de l-glutamate est amélioré (représenté par la grande flèche du 2-oxoglutarate au l-glutamate)11, 37. (B) Représentation des effets métaboliques possibles et des interactions protéiques affectées par les protéoformes OdhI décrites dans cette étude : Δm de 70 Da (représenté par le symbole étoile) et clivage dipeptidique N-terminal (représenté par les lettres SD sur OdhI). L'effet des protéoformes identifiées sur la fonction OdhI reste incertain, mais les mécanismes potentiellement affectés sont représentés par l'inhibition de l'ODHC (boîte violette ; amélioration de la production de L-glutamate symbolisée par la grande flèche), ou l'activation de l'ODHC (boîte verte ; diminution de L -production de glutamate symbolisée par la ligne avec un point). Les deux hypothèses peuvent influencer la production de l-glutamate. Inhibiteur de l'oxoglutarate déshydrogénase OdhI, complexe oxoglutarate déshydrogénase ODHC.

Dans cette étude, sept protéoformes d'OdhI ont été identifiées. Certains d'entre eux semblaient être causés par la préparation de l'échantillon ou le processus d'ionisation, comme l'oxydation (Δm = 16 Da) et la déshydratation (Δm = −18 Da). A l'inverse, deux protéoformes ont été identifiées avec une pertinence biologique potentielle: l'une avec un clivage N-terminal de trois résidus et une autre avec Δm de 70 Da (Fig. S5 supplémentaire). Bien que ces deux protéoformes aient été identifiées avec confiance par TopPic, un faible nombre de fragments correspondants couvrait les régions modifiées, ce qui a réduit notre confiance quant à leurs identifications, principalement concernant leur emplacement dans la séquence. En revanche, en accord avec l'une des protéoformes identifiées, une analyse protéomique ascendante dans une étude préliminaire menée par notre groupe a suggéré la présence de Δm de 70 Da dans le peptide N-terminal d'OdhI (données non présentées).

Récemment, le déplacement de masse de 70 Da a été identifié dans la protéine exprimée hétérologue GM-CSF dans le système Escherichia coli. Cette modification a été supposée être le résultat du crotonaldéhyde formé pendant le stress oxydatif par la peroxydation lipidique. L'aldéhyde réagit avec l'extrémité N-terminale de la protéine ou les résidus de lysine, ce qui donne un Δm de 70 Da38. Un autre PTM possible pour ce déplacement de masse est la butyrylation de la lysine (UnimodAC : 1289, Δm = 70,041865 Da). Dans la présente étude, le site exact de la modification entraînant le déplacement de masse de 70 Da dans OdhI n'a pas pu être identifié en raison de la complexité des spectres et de la fragmentation limitée par MS/MS. Par conséquent, d'autres modifications telles que les additions de 5 groupes méthyle (14 Da) et l'acétylation (42 Da) suivie d'une formylation (28 Da) ne pouvaient pas être exclues. Comme mentionné ci-dessus, l'inactivation de l'ODHC résulte de l'interaction de l'OdhI non phosphorylé et de la sous-unité OdhA de l'ODHC. La phosphorylation de T14 OdhI inhibe cette interaction, entraînant l'activation de l'ODHC10. OdhI a un domaine associé à la tête de fourche (FHA) responsable de la reconnaissance d'un résidu phosphothréonine. De plus, ce domaine est la région qui interagit avec la sous-unité OdhA de l'ODHC, entraînant son inactivation. De plus, il a été démontré que la phosphorylation du résidu thréonine OdhI provoque des changements drastiques dans sa conformation, conduisant à une auto-inhibition de sa fonction, activant par conséquent ODHC39. Plus récemment, il a été rapporté que la succinylation de K142 affecte également l'interaction OdhI-ODHC, entravant l'inhibition de l'ODHC avec des impacts sur la production de l-glutamate de C. glutamicum12,40.

De plus, comme un site d'acétylation à K52 d'OdhI a également été décrit12,40, nous avons étudié une telle modification en plus de la formylation N-terminale (27,9949 Da + 42,0106 Da) comme cause possible de la production de la protéoforme 70 Da OdhI. Cependant, ces modifications ont entraîné une perte considérable de pics de fragments correspondants (données non présentées). Il est donc peu probable que cela ait été à l'origine d'un tel déplacement de masse. De plus, la région suggérée pour le 70 Da Δm est proche du site de phosphorylation T14 connu d'OdhI, ce qui soulève par conséquent la question de savoir si cela pourrait affecter son interaction avec l'ODHC. La phosphorylation d'OdhI à T14 est principalement catalysée par C. glutamicum PknG10. Compte tenu de la capacité de reconnaissance du domaine OdhI FHA de sa phosphothréonine et de la proximité de ce site de phosphorylation avec la protéoforme 70 Da Δm, cette modification peut affecter l'inhibition d'OdhI de l'ODHC, entraînant son activation ou son inactivation (Fig. 5B). Un mécanisme possible est l'obstruction de la phosphorylation d'OdhI par la présence du PTM 70 Da, permettant l'interaction du domaine FHA et par conséquent l'inhibition de l'ODHC (Fig. 5B, encadré violet). Une autre hypothèse est que la modification de 70 Da d'OdhI, même ayant un résidu phosphorylé T14, interfère avec la reconnaissance du domaine FHA de la phosphothréonine, entraînant l'inhibition de l'ODHC par OdhI (Fig. 5B, encadré violet). De plus, le déplacement de masse de 70 Da peut même se comporter de manière similaire au résidu phosphorylé, induisant le changement conformationnel d'OdhI, l'inhibant et activant l'ODHC (Fig. 5B, encadré vert). Il est moins probable que la troncature du tripeptide N-terminal provoque des effets similaires, mais son influence dans OdhI ne peut être écartée (Fig. 5B). De plus, ces altérations peuvent influencer la production de l-glutamate dans ces bactéries, en conséquence de la régulation de l'ODHC (Fig. 5B). Malgré ces effets potentiellement pertinents des protéoformes putatives d'OdhI, d'autres études doivent être réalisées pour étudier l'importance et la validité de ces modifications dans la fonction d'OdhI.

Une autre protéine pertinente pour le processus de production de glutamate est la protéine contenant le domaine associé aux métaux lourds (HMA) (Q8NL68, HMADP). Son transcrit correspondant a été identifié comme régulé positivement dans une série de conditions de surproduction de glutamate, mais sa fonction dans ce processus reste incertaine41. Ici, nous avons identifié trois protéoformes différentes de cette protéine. L'un d'eux présentait un Δm de −2 Da (Fig. S6 supplémentaire), suggérant la présence d'une liaison disulfure (UnimodAC : 2020, Δm = −2,015650 Da), une substitution de résidu d'acide aminé (UnimodAC : 1217, Δm = −2,015650 Da, Val- > Pro ou UnimodAC : 1145, Δm = −1,997892 Da, Met- > Glu) ou didéhydro (UnimodAC : 401, Δm = −2,015650 Da) dans la région modifiée. De plus, plusieurs PrSM ont été identifiés avec Δm d'env. 30 jours. L'inspection de ses spectres a permis de confirmer ce déplacement de masse, mais il est plus probable qu'il résulte de deux PTM, l'un de 14 Da et l'autre de 16 Da (Fig. S6 supplémentaire), correspondant éventuellement à la méthylation et à l'oxydation, respectivement. De plus, une enveloppe isotopique a pu être détectée à proximité de cette protéoforme identifiée (Δm = 30 Da) avec la masse intacte de la modification -2 Da de HMADP (Fig. S6 supplémentaire, précurseur en bleu).

Les deux modifications putatives des protéoformes HMADP sont proches l'une de l'autre dans la séquence protéique (Fig. S6 supplémentaire). De plus, aucune protéoforme canonique n'a pu être identifiée. Ceux-ci suggèrent que la présence de méthylation peut affecter la formation de liaisons disulfure. La séquence HMA se retrouve dans les protéines bactériennes conférant une résistance aux métaux lourds toxiques42. Pour clarifier la fonction HMADP de C. glutamicum, la séquence de la protéine Q8NL68 a été comparée aux protéomes de référence UniprotKB plus la base de données Swiss-Prot avec des paramètres par défaut dans Uniprot, ce qui a entraîné une similitude avec les protéines chaperon de cuivre et les protéines de transport/détoxification des métaux lourds (tableau supplémentaire 3). Il a été démontré que les transcrits du système à deux composants sensible au cuivre, CopRS, étaient régulés positivement chez C. glutamicum lors de l'induction par la pénicilline de la production d'acide glutamique43. Récemment, il a été démontré que le cuivre peut induire la production d'acide glutamique par C. glutamicum, mais en quantité moindre par rapport aux traitements typiques, tels que la pénicilline ou la limitation de la biotine44. Malgré cela, le rôle du HMADP dans la production de L-glutamate reste incertain, mais il semble être une protéine liée à la réponse au stress, et il peut donc être régulé ou réguler d'autres protéines par le biais de PTM associés au stress oxydatif.

Des valeurs de Δm moins courantes ont été observées dans une peroxiredoxine (Q8NMS6). Une protéoforme avec un déplacement de masse de 154 Da a été identifiée et une acétylation N-terminale a également été détectée (Fig. S7 supplémentaire). L'inspection du spectre MS/MS nous a permis d'identifier des fragments qui soutiennent le déplacement de masse de 154 Da, cependant, la N-acétylation n'a pas pu être réduite à une région de séquence plus courte, ce qui ne permet pas de savoir s'il s'agissait d'une série d'événements de méthylation ou bien une acétylation (Fig. S7 supplémentaire). En considérant un seul PTM, le déplacement de masse de 154 Da peut être causé par trois événements : ajout de glycérophosphate (UnimodAC : 419, Δm = 154,003110 Da), de décanoyl (UnimodAC : 449, Δm = 154,135765 Da) ou de 4-oxo-2- nonénal (ONE) (UnimodAC : 721, Δm = 154,099380 Da). La modification de la protéine ONE est un produit de peroxydation lipidique, causé par des interactions d'espèces réactives avec les lipides membranaires, ce qui suggère que cette protéine peut être localisée près de la membrane cellulaire de C. glutamicum. Cette molécule peut être ajoutée aux résidus d'acides aminés nucléophiles45. En observant la région de modification proposée, la présence de ONE sur le site suggéré est peu probable, cependant, près de cet emplacement se trouvent trois sites de modification possibles, C51, K48 et C46 (Fig. S7 supplémentaire). Cette peroxiredoxine a été décrite comme une peroxiredoxine Q jouant un rôle important dans la réponse au stress oxydatif et capable de réduire le H2O2, le t-BOOH, l'hydroperoxyde de cumène et le peroxynitrite. Fait intéressant, le C46 proposé pour subir le déplacement de masse de 154 Da est la cystéine catalytique de cette peroxiredoxine46. Cela suggère que cette modification peut avoir un impact important sur son activité catalytique, et par conséquent dans plusieurs réponses au stress oxydatif de C. glutamicum. De plus, les protéines impliquées dans la régulation du stress oxydatif sont souvent sensibles aux modifications oxydatives en tant que processus de régulation de l'activité redox dans la cellule24. Cette preuve soutient le déplacement de masse de 154 Da en tant que modification ONE de la peroxiredoxine de C. glutamicum. Cependant, d'autres possibilités ne peuvent pas être écartées. Une autre protéoforme de peroxirédoxine avec un Δm de 186 Da soutient l'identification du déplacement de masse de 154 dans cette protéine et est probablement causée par un deuxième PTM dans sa séquence d'environ 32 Da. En accord, à proximité du précurseur fragmenté pour l'identification de la protéoforme 186 Da Δm, il existait une enveloppe isotopique correspondant à la perte d'environ 32 Da (Fig. S7 supplémentaire). Ceci suggère la présence d'un PTM de 32 Da en plus de la modification putative ONE. Les différences de masse de 32 Da sont généralement dues à deux oxydations dans différentes méthionines, mais les méthionines de cette séquence protéique sont plus proches du C-terminal, où plusieurs fragments ont été identifiés sans ce déplacement de masse. Une autre possibilité de ce déplacement de masse serait une dihydroxylation de la cystéine (UnimodAC : 425, Δm = 31,989829 Da). Il y a deux cystéines près de la région modifiée (Fig. S7 supplémentaire). Bien que le pKa de la cystéine libre soit d'environ 8,6, la présence de résidus chargés positivement près de la cystéine la diminue de 3 à 4 unités, favorisant l'oxydation de son groupe thiol47. En accord, il existe une arginine (R54) et une lysine (K47) à proximité de C51. De plus, le C51 est le résidu de résolution et a été suggéré comme étant très important dans le processus catalytique de cette peroxiredoxine46. Deux oxydations de cystéines entraînent la formation d'acide sulfinique, qui est une modification irréversible et un signal de dégradation des protéines47. Il y a donc de fortes chances que la protéine peroxirédoxine de C. glutamicum subisse des modifications oxydatives qui pourraient réguler son activité et son intégrité. De plus, la modification suggérée par une peroxydation ONE suggère un rôle possible de cette protéine dans la réparation de la membrane cellulaire.

Une autre thiorédoxine (Q8NLG6, trxB1), décrite comme thiol-disulfure isomérase et thiorédoxines, a été identifiée par deux protéoformes, toutes deux avec un clivage N-terminal de 26 résidus d'acides aminés. Fait intéressant, une protéoforme a été identifiée avec un déplacement de masse d'environ -2 Da dans une région proche de deux cystéines (Fig. S8 supplémentaire), suggérant la formation d'une liaison disulfure. Une autre protéoforme a été identifiée avec un Δm de 29, 88 Da avec une possibilité ambiguë de modifications (Fig. S8 supplémentaire), telles que deux oxydations plus une liaison disulfure, ou une méthylation suivie d'une oxydation. De plus, les deux protéoformes ont été identifiées par des spectres MS/MS de bonne qualité avec plusieurs fragments représentant les deux formes modifiées (Fig. S8 supplémentaire). Il a été démontré que cette thiorédoxine répondait au stress disulfure, régulé par le facteur sigma SigM chez C. glutamicum48. Les thiorédoxines sont connues pour agir comme un système de réparation des résidus de cystéine oxydée, à travers son motif CxxC. Ses résidus de cystéine subissent une oxydation, formant une liaison disulfure, produisant la forme réduite des résidus de cystéine dans la protéine cible47. La présence d'un -2 Da Δm identifié près de ce motif de trxB1 renforce qu'il s'agit d'une liaison disulfure. De plus, l'identification des protéoformes oxydées et réduites d'une thiorédoxine indique la possibilité d'études comparatives pour quantifier ces protéoformes et estimer le statut redox de la cellule.

L'analyse protéomique descendante du cheval de bataille industriel Corynebacterium glutamicum a révélé plusieurs nouveaux PTM putatifs de cette bactérie liés à différents processus biologiques. Plus précisément, 1125 protéoformes ont été identifiées, à partir de 273 protéines. De plus, les protéines membranaires et les protéines impliquées dans la traduction semblent fortement sensibles aux PTM. Des protéines pertinentes pour les processus biotechnologiques et métaboliques ont été identifiées par de nouvelles protéoformes, ce qui peut impliquer de nouvelles stratégies de régulation. Par exemple, la protéine OdhI est impliquée dans la production d'acides aminés et a été identifiée par une nouvelle protéoforme suggérant une butyrylation putative ou une peroxydation du crotonaldéhyde, qui peut affecter son inhibition de l'ODHC, influençant ainsi la production de glutamate. La protéine endoprotéinase mepB a également été identifiée avec une nouvelle protéoforme, le clivage de 93 résidus d'acides aminés de son N-terminal, suggérant un mécanisme non décrit de son activation chez C. glutamicum avec des effets possibles sur le métabolisme de la paroi cellulaire. La protéine membranaire SecG, une sous-unité du système de sécrétion protéique, avait une formylation N-terminale putative, suggérant une dégradation de la signalisation avec des conséquences possibles sur la sécrétion protéique. Une autre protéine membranaire a été identifiée avec une formylation N-terminale putative, MscL, qui peut influencer l'efflux de métabolites. Une peroxirédoxine a été identifiée avec une modification putative ONE près de son résidu catalytique de cystéine, suggérant un rôle dans les réponses au stress oxydatif. Une autre protéine de réponse au stress a été identifiée avec un clivage N-terminal, qui peut influencer la réponse au stress disulfure. La protéine HMADP, impliquée dans les conditions de production de glutamate et le transport/détoxification des métaux, a été identifiée par deux protéoformes, l'une avec une liaison disulfure putative et l'autre avec une méthylation et une oxydation putatives, suggérant des effets possibles sur la production de glutamate et/ou la détoxification des métaux. L'influence de ces protéoformes dans les processus biologiques de C. glutamicum devrait être validée et étudiée plus avant. Par exemple, une étude récente a utilisé le génie génétique de C. glutamicum OdhI, introduisant des résidus d'acides aminés mimiques, pour étudier l'influence de l'acétylation et de la succinylation d'OdhI sur son interaction avec ODHC40. Une autre possibilité serait une analyse comparative couplant la protéomique quantitative descendante avec la métabolomique, en observant les différences d'abondance des protéoformes corrélées aux changements d'abondance des métabolites.

C. glutamicum ATCC 13032 a été cultivé dans de la gélose trypsique au soja (17 g/L de digestion pancréatique de caséine, 3 g/L de digestion papaïque de soja, 5 g/L de NaCl, 2,5 g/L de K2HPO4, 2,5 g/L de monohydrate de glucose, 1,5 g/L de gélose) et la pré-culture a été effectuée pendant une nuit dans un bouillon de soja trypsique sous agitation à 170 tr/min à 30 °C. Ensuite, la pré-culture a été utilisée pour inoculer trois flacons contenant du milieu CGXII [20 g/L de (NH4)2SO4, 5 g/L d'Urée, 40 g/L de glucose, 1 g/L de KH2PO4, 1 g/L L de K2HPO4, 0,25 g/L de MgSO4.7H2O, 42 g/L de MOPS, 10 mg/L de CaCl2, 10 mg/L de FeSO4.7H2O, 10 mg/L de MnSO4.7H2O, 1 mg/L de ZnSO4.7H2O, 0,2 mg/L de CuSO4, 0,02 mg/L de NiCl2.6H2O, 0,2 mg/L de biotine, 0,03 mg/L d'acide protocatéchuique]49 [densité optique de départ (DO) = 1,0]. Les échantillons ont été cultivés pendant 36 h sous une agitation de 170 tr/min à 30 °C. Les mesures de croissance ont été évaluées par DO600 à l'aide d'un spectrophotomètre CLARIOstar (BMG LABTECH, Allemagne).

Les cultures de C. glutamicum ont été récoltées et centrifugées à 12 000 xg pendant 10 min à 21 °C. Les culots ont été lavés avec du milieu CGXII moins glucose, en remettant en suspension le culot et en centrifugeant à 12 000 x g pendant 10 min à 21 °C. Les cellules ont ensuite été remises en suspension dans un tampon de lyse (Tris-HCl 100 mM, DTT 2 mM, SDS 4 %, cOmplete™ EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail de Roche, Bâle, Suisse), suivi d'une rupture physique par macération dans de l'azote liquide. Après macération, la solution a été centrifugée à 20 000 × g pendant 15 min à 21 ° C pour séparer les particules insolubles, et le surnageant avec les protéines intracellulaires solubles a été stocké à -80 ° C jusqu'à utilisation ultérieure. Les protéines ont ensuite été quantifiées par Qubit™ (Invitrogen). Un échantillon regroupé a été préparé en utilisant des quantités de protéines égales de chaque réplicat et 500 µg de l'échantillon regroupé ont été fractionnés par électrophorèse de piégeage de fraction liquide éluée sur gel - GELFrEE50, à l'aide d'une cartouche maison avec 12 % de gel de résolution et 4 % de gel d'empilement. Tout d'abord, l'échantillon a été dilué dans un tampon d'échantillon 2 × (Tris – HCl 0,125 M, SDS 4%, glycérol 20%, DTT 0,1 M, bleu de bromophénol 0,01%), puis il a été soumis à une électrophorèse à l'aide d'un tampon courant (Tris – HCl 0,025 M, Glycine 0,192 M, SDS 0,1 %) et un courant constant de 10 mA. Les fractions ont été recueillies en fonction du temps (en minutes) après élution au bleu de bromophénol (0 min). Les collectes suivantes ont été les suivantes : 1, 2, 3, 4, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 20, 25, 30, 45, 60, 75, 90 et 120 min. La gamme de masse moléculaire des protéines de chaque fraction a été évaluée par SDS-PAGE51. Les fractions de GELFrEE ont ensuite été soumises à une précipitation au méthanol/chloroforme/eau pour l'élimination du SDS52. En bref, quatre volumes de méthanol ont été ajoutés aux fractions, suivis de l'ajout de 1 volume de chloroforme et de 3 volumes d'eau, avec 30 s de vortex après l'inclusion de chaque solution. Après addition d'eau et vortex, les solutions ont été soumises à une centrifugation à 20 000 × g pendant 10 min à 21 ° C, entraînant la formation de deux couches, avec des protéines flottant entre elles. Ensuite, la couche supérieure a été retirée, en prenant soin d'éviter de perturber le culot de protéines, et 3 volumes de méthanol ont été ajoutés, suivis d'un mélange doux et d'une centrifugation à 20 000 x g pendant 10 min à 21 °C. Ensuite, le surnageant a été jeté, suivi d'un second lavage avec 3 volumes de méthanol comme décrit précédemment, et le culot résultant a été séché dans une hotte biologique à flux laminaire. Après séchage, les granulés ont été remis en suspension dans 5 % d'acétonitrile et 0,1 % d'acide formique et stockés à -80 °C avant LC-MS/MS.

Trois répliques techniques des fractions GELFrEE 0, 1, 2, 3, 4, 5, 7, 9 et 11 ont été soumises à une analyse descendante sur un système nano-UHPLC Dionex Ultimate 3000 couplé au spectromètre de masse Orbitrap Elite™ (Thermo Scientific, Brême, Allemagne) (LC-MS/MS). Des colonnes analytiques (30 cm, 75 µM ID) et pièges (4 cm, 100 µM ID) garnies de PLRPS 1000 A, 5 µM (Agilent, Californie, USA) ont été utilisées pour la séparation en phase inverse. Dans la colonne analytique, une pointe d'environ 1 cm a été tirée à l'aide d'un instrument P-2000 (Sutter, Californie, USA), pour être utilisée comme émetteur dans le spectromètre de masse. Les deux colonnes ont été maintenues à température ambiante, contrôlées à environ 22°C. Les échantillons ont été chargés à l'aide d'un débit de 3 µL/min pendant 10 min, dans des conditions isocratiques d'acétonitrile à 5 % et d'acide formique à 0,1 %, puis un gradient sous un débit de 0,230 µL/min a été utilisé pour éluer les protéoformes de la colonne pour l'analyse MS . Le gradient était composé des solutions A (acide formique 0,1 %) et B (acétonitrile, acide formique 0,1 %) et a été créé par : 5 % B (0–10 min), 20 % B (10–55 min), 55 % B (55–60 min), 85 % B (60–80 min) et 5 % B (80–90 min). Les acquisitions ont été effectuées pendant le gradient de 90 min en mode positif, et les 2 ions les plus abondants ont été fragmentés par dissociation collisionnelle à haute énergie (HCD) appliquant une énergie de collision normalisée de 25, en utilisant deux étapes, avec une largeur d'énergie de collision de 10, résultant en deux fragmentations séparées d'ions avec une énergie de collision normalisée de 20 et 30, et analyse de tous les fragments résultants ensemble dans l'Orbitrap. La largeur d'isolement des précurseurs était de 25 m/z, en utilisant une durée d'exclusion dynamique de 30 s. La dissociation induite par la source (SID) a été utilisée avec 15 eV dans MS1 et le premier MS2, tandis que pour le deuxième ion le plus intense, elle a été fixée à 35 eV. Les résolutions étaient de 240 000 et 120 000 pour MS1 et MS2, respectivement. Les données de protéomique de spectrométrie de masse ont été déposées auprès du Consortium ProteomeXchange via le référentiel partenaire PRIDE53 avec l'identifiant de jeu de données PXD038038.

Les fichiers thermo raw ont été convertis au format MzML à l'aide de l'outil MSConvert54. L'identification et la caractérisation des protéoformes ont été effectuées à l'aide de l'outil logiciel de la suite TopPic, version 1.455. En bref, les spectres ont été déconvolués à l'aide de TopFD avec des paramètres par défaut suivis d'identifications par rapport à un protéome de référence C. glutamicum ATCC 13032 (11-2020), obtenu auprès d'UniProt (https://www.uniprot.org/). Deux décalages de masse entre -500 Da et 500 Da ont été autorisés dans l'identification et les formes N-terminales ont été définies comme "NONE" (Aucune modification), "NME" (excision N-terminale de la méthionine), "NME-ACETYLATION" (N -excision de la méthionine terminale et acétylation N-terminale), et "M-ACETYLATION" (acétylation N-terminale). Une stratégie de taux de fausses découvertes a été adoptée avec une base de données de leurres, entraînant l'identification des seules protéoformes avec un FDR inférieur à 1 % au niveau des correspondances du spectre des protéoformes (PrSM). La caractérisation et l'annotation des protéoformes ont été suivies d'une interprétation visuelle des fichiers TopMSV21. L'évaluation MW des protéines détectées et les temps de rétention ont été effectués à l'aide de VisioProt-MS56.

Les données d'identification des protéoformes ont été analysées dans R 4.0.2 (R Core Team 2020) à l'aide des packages tidyverse57 et ggplot258. En bref, le nombre de décalages de masse identifiés (Δm) a été compté et la fréquence des Δm les plus courants a été définie sur la base de valeurs arrondies. Ensuite, le nombre de résidus d'acides aminés modifiés par chaque Δm a été défini. L'annotation fonctionnelle et l'analyse de la surreprésentation ont été effectuées à l'aide de l'application String Cytoscape59,60 et DAVID61. L'interprétation visuelle des termes DAVID surreprésentés a également été réalisée à l'aide du langage informatique R grâce à la création d'un graphique à bulles avec les outils présents dans ggplot2.

Les fichiers bruts de spectres de masse sont disponibles via les archives de la base de données Proteomics IDEntifications (PRIDE, https://www.ebi.ac.uk/pride/archive/, ID : PXD038038).

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Ce travail a été soutenu par la Coordination pour le Perfectionnement des Personnels de l'Enseignement Supérieur (CAPES), le Financier d'Etudes et de Projets (FINEP) et la Fondation d'Appui à la Recherche du District Fédéral (FAP-DF, Processus N. : 00193.00001484/2021-91 et 0193001195 /2016) .

Laboratoire de chimie et biochimie des protéines, Département de biologie cellulaire, Institut de biologie, Université de Brasilia, Brasilia, Brésil

Reynaldo Magalhães Melo, Jaques Miranda Ferreira de Souza, Wagner Fontes, Marcelo Valle de Sousa, Carlos André Ornelas Ricart & Luis Henrique Ferreira do Vale

Laboratoire de biochimie végétale, Département de botanique, Institut de biologie, Université de Brasilia, Brasilia, Brésil

Thomas Christopher Rhys Williams

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RMM a effectué la croissance bactérienne et préparé l'échantillon pour la spectrométrie de masse. RMM et TCRW ont analysé les données. JMFS, WF, MVS et LHFV ont effectué la maintenance du spectromètre de masse et l'injection d'échantillons. CAOR, RMM, TCRW et LHVF ont conçu les expériences. Tous les auteurs ont révisé le manuscrit.

Correspondance à Luis Henrique Ferreira do Vale.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

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Réimpressions et autorisations

Melo, RM, de Souza, JMF, Williams, TCR et al. Révéler les protéoformes de Corynebacterium glutamicum par protéomique descendante. Sci Rep 13, 2602 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-29857-6

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Reçu : 07 décembre 2022

Accepté : 11 février 2023

Publié: 14 février 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s41598-023-29857-6

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