La lipoprotéine de la paroi cellulaire CD1687 agit comme une protéine de liaison à l'ADN pendant le désoxycholate

npj Biofilms et Microbiomes volume 9, Numéro d'article : 24 (2023) Citer cet article

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La capacité des pathogènes bactériens à établir des infections récurrentes et persistantes est fréquemment associée à leur capacité à former des biofilms. Les infections à Clostridioides difficile ont un taux élevé de récidives et de rechutes et on suppose que les biofilms sont impliqués dans sa pathogénicité et sa persistance. La formation de biofilm par C. difficile est encore mal comprise. Il a été montré que des molécules spécifiques telles que le déoxycholate (DCA) ou le métronidazole induisent la formation de biofilms, mais les mécanismes impliqués restent insaisissables. Dans cette étude, nous décrivons le rôle de la lipoprotéine CD1687 de C. difficile lors de la formation de biofilm induite par le DCA. Nous avons montré que l'expression de CD1687, qui fait partie d'un opéron au sein du groupe de gènes CD1685-CD1689, est contrôlée par plusieurs sites de départ de la transcription et certains sont induits en réponse au DCA. Seul CD1687 est requis pour la formation de biofilm et la surexpression de CD1687 est suffisante pour induire la formation de biofilm. En utilisant l'analyse RNAseq, nous avons montré que CD1687 affecte l'expression des transporteurs et des voies métaboliques et nous avons identifié plusieurs partenaires de liaison potentiels par test pull-down, y compris les protéines extracellulaires associées au transport. Nous avons ensuite démontré que CD1687 est exposé en surface dans C. difficile et que cette localisation est nécessaire pour la formation de biofilm induite par le DCA. Compte tenu de cette localisation et du fait que C. difficile forme des biofilms riches en eDNA, nous avons confirmé que CD1687 se lie à l'ADN de manière non spécifique. Nous émettons donc l'hypothèse que CD1687 est un composant de la réponse en aval au DCA conduisant à la formation de biofilm en favorisant l'interaction entre les cellules et la matrice du biofilm en se liant à l'ADNe.

Les infections gastro-intestinales constituent un problème majeur de santé publique. Dans les pays à revenu élevé, l'anaérobie sporulé Gram positif Clostridioides difficile est la principale cause de diarrhée nosocomiale et de colite chez les adultes recevant des traitements antibiotiques1,2. De plus, les infections à C. difficile (ICD) peuvent être persistantes, ce qui constitue un défi majeur dans la prise en charge des ICD après anti-C. traitement antibiotique difficile. Les ICD récurrentes surviennent chez plus de 20 % des patients qui reçoivent des antibiotiques pour traiter leur premier épisode d'ICD et ce taux augmente après de nouveaux épisodes3,4. Les causes des récidives ne sont pas totalement élucidées. La récidive peut être causée soit par une réinfection avec une nouvelle souche, soit par une rechute avec la même souche, ce qui suggère que C. difficile peut persister dans le tractus gastro-intestinal5. Les rechutes étaient initialement corrélées à la capacité de C. difficile à sporuler pendant l'infection et à résister au traitement antibiotique6,7. Cependant, on suppose également que les rechutes sont associées à la persistance de C. difficile sous forme de biofilm8,9. Les infections persistantes et chroniques causées par différents agents pathogènes sont connues pour être associées à la formation de biofilm10. On estime qu'au moins 60 % de toutes les infections bactériennes nosocomiales et chroniques sont associées au biofilm11. À l'appui de cette hypothèse, il a récemment été démontré que C. difficile intégrait des biofilms formés par le microbiote colique et que ce biofilm agissait comme un réservoir de persistance et de récidive dans un modèle de laboratoire de CDI9.

Les biofilms sont des communautés structurées de micro-organismes associés à des surfaces et enfermés dans une matrice extracellulaire autoproduite, qui varie selon les espèces bactériennes12. C. difficile peut former des biofilms en tant qu'espèce unique ou avec d'autres bactéries sur diverses surfaces abiotiques et plusieurs systèmes in vitro9,13,14,15. De plus, C. difficile peut intégrer des communautés multi-espèces in vivo lors d'une infection murine, suggérant sa capacité à intégrer des biofilms muqueux16. De plus, C. difficile peut former des structures de type biofilm inégales riches en glycanes dans un modèle de souris mono-associée17. Bien que C. difficile puisse intégrer des biofilms multi-espèces dans le tractus gastro-intestinal, les connaissances sur la biologie de la formation de biofilms de C. difficile en réponse à l'environnement gastro-intestinal sont limitées. Au cours d'une infection, les agents pathogènes rencontrent plusieurs facteurs environnementaux, notamment la présence d'antibiotiques, de sels biliaires, de pression osmotique et de diverses sources de nutriments, et ceux-ci sont connus pour être des signaux importants pour la formation de biofilm pendant la colonisation18,19. Fait intéressant, C. difficile serait confronté à différents défis pendant la dysbiose car il modifie l'environnement nutritionnel, le métabolisme des sels biliaires et les stress osmotiques et oxydatifs/nitrosatifs20. Chacun de ces facteurs pourrait induire la formation de biofilm. Par exemple, des concentrations sous-inhibitrices d'antibiotiques utilisés pour traiter l'ICD améliorent la formation de biofilm in vitro21,22. De plus, nous avons récemment démontré que des concentrations sous-inhibitrices du désoxycholate de sel biliaire secondaire (DCA) améliorent la formation de biofilm de C. difficile15. Dans le biofilm induit par le DCA, les cellules végétatives sont protégées de la toxicité du DCA ainsi que des antibiotiques et des peptides antimicrobiens15. Nous avons montré que les biofilms induits par le DCA se forment en raison d'une adaptation métabolique et d'une reprogrammation qui dépendent des nutriments disponibles et des métabolites excrétés. Dans l'ensemble, le pyruvate excrété est essentiel pour l'induction de la formation de biofilm23.

En plus des facteurs environnementaux induisant la formation de biofilm, il a été démontré que plusieurs facteurs cellulaires, y compris les composants de surface cellulaire et les régulateurs, influencent la formation de biofilm par C. difficile24. Parmi les gènes qui ont été régulés positivement en réponse au DCA, un gène codant pour une lipoprotéine (CD1687) est essentiel à la formation de biofilm en réponse au DCA15. Le but de cette étude était de caractériser le rôle de CD1687 lors de la formation de biofilm par C. difficile en réponse au DCA. Nous avons démontré que CD1687 est exposé et actif à la surface des bactéries et qu'il se lie à l'ADN in vitro. Ceci suggère que CD1687 agit comme une protéine ancrant les cellules à l'ADN extracellulaire (eDNA) présent dans la matrice du biofilm.

Dans des expériences transcriptomiques précédentes, nous avons observé que la majorité des gènes du cluster CD1685-CD1689 étaient régulés positivement dans le biofilm induit par le DCA de 48 h formé par la souche C. difficile 630∆erm15,23. Cependant, l'inactivation de CD1687 mais pas de CD1688 a empêché la formation de biofilm induite par le DCA. Pour vérifier que les gènes CD1685-CD1689 formaient un opéron, des expériences de RT-PCR ont été réalisées avec de l'ARN extrait de cellules cultivées dans des conditions induisant un biofilm (BHISG avec 240 µM de DCA). Nous avons observé un transcrit unique couvrant CD1685 à CD1689 suggérant la présence d'au moins un ARNm polycistronique à ce locus (Fig. 1a). Nous avons ensuite effectué qRT-PCR pour confirmer que les cinq gènes étaient régulés positivement à 48 h en présence de DCA et seule une petite différence dans les changements de pli a été observée (Figure 1a supplémentaire).

a.RT-PCR réalisée avec les amorces EA043 et EA027 (tableau supplémentaire 1) à partir de diverses matrices d'acides nucléiques. L'ADNc a été obtenu à l'aide de l'amorce EA027 avec de l'ARN total extrait de biofilms de 48 h cultivés dans du BHISG additionné de DCA (240 µM). b 5'RACE résulte de l'amplification de l'ADNc poly-guanylé obtenu respectivement avec les amorces EA021 et EA018 (Tableau complémentaire 1), puis les amorces P1686 ou P1687 ainsi que l'amorce d'amplification universelle (AAP) du kit 5'RACE . L'ARN a été extrait de cultures cellulaires de 48 h cultivées dans des conditions induisant un biofilm (BHISG + 240 µM DCA) ou des conditions non induisant un biofilm (BHISG). c Organisation du cluster CD1685-CD1689, emplacement des amorces utilisées pour la RT-PCR et des amplicons des résultats 5'RACE utilisant les amorces P1686 ou P1687 (les tailles des amplicons ont été prédites à partir du TSS identifié par Soutourina et al. (2020 ) et Fuchs et al. (2021). TSS : site de départ transcriptionnel ; ADNc : ADN complémentaire ; ADNg : ADN génomique. Les transferts en a et b proviennent des mêmes expériences et n'ont pas été traités.

Lors de l'examen de nos expériences RNAseq précédentes, nous avons observé un biais de cartographie des lectures de séquençage favorisant CD1687, CD1688 et CD1689 (Figure 1b supplémentaire). Fait intéressant, des analyses récentes ont prédit trois sites de départ de transcription (TSS) pour le locus CD1685-CD1689 : un en amont du gène CD1685 (TSS1), un en amont du gène CD1686 (TSS2) et un dans la séquence codante de CD1686 (TSS3)25 ,26 (fig. 1c). Pour confirmer l'existence de multiples TSS, des expériences 5'-RACE ont été réalisées avec de l'ARN total extrait de cellules cultivées pendant 48 h dans du BHISG avec DCA (c'est-à-dire induisant un biofilm) ou sans DCA (c'est-à-dire non induisant un biofilm). Les transcriptions inverses initiales ont été réalisées avec deux amorces annelant soit la séquence codante de CD1686 (P1686), soit la séquence codante de CD1687 (P1687) (Fig. 1b, c). En l'absence de DCA, un seul amplicon a été observé, qui est associé au TSS à l'intérieur de CD1686. Cet amplicon était détectable lorsque l'amorce P1686 était utilisée mais pas avec l'amorce P1687. En présence de DCA, nous avons observé des amplicons correspondant aux trois TSS prédits avec l'une ou l'autre des amorces (P1686 ou P1687) et deux amplicons supplémentaires ont été détectés avec P1687. Cela suggère que ces deux TSS supplémentaires (TSSa et TSSb; Fig. 1c) sont actifs en présence de DCA et l'un d'entre eux (TSSa) semble être le plus actif de tous les TSS (Fig. 1b). Chaque amplicon a été séquencé (tableau supplémentaire 2) et l'emplacement de TSS1, TSS2 et TSS3 correspondait étroitement à leur emplacement prévu. Cependant, la forte variation des séquences pour TSSa et TSSb a rendu difficile l'identification de leur emplacement exact. Dans l'ensemble, la transcription de l'opéron CD1685-CD1689 est initiée à partir de plusieurs TSS en présence de DCA, suggérant que plusieurs facteurs sont intégrés pour réguler l'expression de l'opéron CD1685-1689 afin de refléter l'état de la population bactérienne.

Nous avons précédemment inactivé CD1687 en utilisant le système Clostron15 mais cette approche est connue pour avoir certaines limites. Pour confirmer que seul CD1687 était nécessaire à la formation de biofilm, la suppression de CD1686, CD1687 et CD1688-CD1689 a été générée (Figure 2a supplémentaire). Comme observé précédemment, seule la suppression de CD1687 a affecté négativement la formation de biofilm et la complémentation restaure le phénotype (Figure supplémentaire 2bc). Fait intéressant, la suppression de CD1686 a supprimé TSS3, TSSa et TSSb suggérant que TSS1 et/ou TSS2 sont suffisants pour la transcription de CD1687 en présence de DCA entraînant la formation de biofilm.

Étant donné que le CD1687 est nécessaire à la formation de biofilm induite par le DCA et précédemment localisé dans la fraction de la paroi cellulaire15, nous avons émis l'hypothèse que le CD1687 est une protéine de détection du DCA. Pour tester cette hypothèse, nous avons vérifié la capacité du CD1687 à interagir directement avec le DCA en utilisant la résonance plasmon de surface. Nous avons montré que CD1687 peut interagir avec le DCA (Figure 3 supplémentaire). Cependant, la constante de dissociation est élevée (Kd de 1,65 ± 0,58 mM), et la stoechiométrie estimée de l'interaction est de 5 ± 1 molécules de DCA pour une protéine CD1687, ce qui implique que l'interaction n'est pas spécifique.

Fait intéressant, nous avons observé une augmentation de la formation de biofilm en présence et, dans une certaine mesure, en l'absence de DCA lorsque le mutant ∆1687 a été complété par un CD1687 inductible à base de plasmide (pDIA6920) (Figure 2C supplémentaire). Bien que l'augmentation ne soit pas significative, elle suggère que le CD1687 pourrait induire la formation de biofilm en l'absence de DCA. Pour tester cette hypothèse, pDIA6920 a été introduit dans la souche sauvage et sa capacité à former un biofilm en l'absence de DCA a été évaluée avec et sans ajout de l'inducteur ATC. Lorsque CD1687 était surexprimé, un biofilm plus fort était détectable à 24 h et 48 h (Fig. 2). Pris ensemble, nos résultats suggèrent que l'expression de CD1687 est essentielle pour la formation de biofilm qui ne nécessite pas de DCA pour son activité.

La formation de biofilms a été testée 24h ou 48h après inoculation en BHISG +/- ATC (100 ng/mL) avec la souche sauvage (630Δerm) contenant soit un vecteur vide contrôle (pDIA6103) soit le vecteur permettant l'expression de CD1687 sous le promoteur inductible Ptet (pDIA6920). Chaque point de données représente un réplicat biologique indépendant composé de 2 à 4 réplicats techniques. La boîte à moustaches utilisée pour représenter les données quantitatives représente les quartiles médian, minimum, maximum et supérieur et inférieur. Les astérisques indiquent la signification statistique avec un test ANOVA unidirectionnel suivi d'un test de comparaison multiple de Tukey (ns : non significatif ; ****p < 0,0001).

Le CD1687 étant essentiel à la formation de biofilm induite par le DCA et sa surexpression pouvant induire la formation de biofilm en l'absence de DCA, nous avons cherché à identifier des gènes dont l'expression est modifiée en présence de CD1687 lors du processus de formation du biofilm. Pour ce faire, nous avons réalisé deux analyses transcriptomiques : l'une comparant le sauvage et le mutant ∆1687 cultivé en présence de DCA pendant 24h, et la seconde comparant le sauvage contenant soit le plasmide inductible CD1687 (pDIA6920) soit un vecteur vide, tous deux cultivés en l'absence de DCA et en présence d'ATC comme inducteur pendant 24 h.

Un total de 527 gènes présentaient une expression différentielle significative avec un facteur de variation <0, 5 ou> 2 dans la souche de type sauvage par rapport au mutant ∆1687 dans des conditions induisant un biofilm (+DCA) (Fig. 3). En présence de DCA, CD1687 semble réguler principalement à la baisse la réticulation de la paroi cellulaire (vanY2Y3) ainsi que plusieurs régulateurs non caractérisés (Figure 4 supplémentaire, Tableau supplémentaire 3). Il semble y avoir une modification des transporteurs membranaires pouvant entraîner une augmentation de l'importation d'acides aminés à chaîne ramifiée, du fer et une modification du transport des sucres (tableau supplémentaire 3). En termes de métabolisme, les cellules passent de l'utilisation du succinate (CD2338-CD2344), de la voie Wood-Ljungdahl et de la biosynthèse des acides aminés aromatiques à la fermentation de l'acétoïne, de la leucine, des acides aminés à chaîne ramifiée et de la glycine (Figure 4 supplémentaire , tableau supplémentaire 3).

Diagramme de Venn des gènes régulés de manière différentielle dans les deux expériences de transcriptomique réalisées dans cette étude (tableau supplémentaire 4).

Lorsque CD1687 était surexprimé, 809 gènes étaient exprimés de manière différentielle, 343 gènes étaient régulés positivement et 466 étaient régulés négativement (Fig. 3). Comme décrit dans la figure supplémentaire 4, les changements dans l'expression des gènes indiquent un changement dans les transporteurs, le métabolisme et la régulation. Plus précisément, l'expression de plusieurs transporteurs de sucre est augmentée alors que l'expression des transporteurs d'acides aminés à chaîne ramifiée, de méthionine, d'alanine et de glycine est régulée à la baisse (tableau supplémentaire 3). En termes de métabolisme, les gènes impliqués dans l'utilisation de l'acétoïne, les fermentations de Stickland impliquant des acides aminés aromatiques ou la leucine, la voie de Wood-Ljungdahl et la voie des pentoses phosphates sont régulés positivement ainsi que ceux impliqués dans la biosynthèse de plusieurs acides aminés tels que l'histidine, l'isoleucine , valine et cystéine (tableau supplémentaire 3). L'opéron dltABCD est régulé positivement suggérant une augmentation de la D-alanylation des acides teichoïques (dltABCD). Fait intéressant, nous avons noté que le groupe de gènes codant pour le flagelle et les gènes associés à la sporulation étaient régulés positivement.

Lorsque nous avons comparé les deux analyses transcriptomiques, peu de gènes se chevauchaient entre les deux analyses. Seuls 69 gènes ont changé dans le même sens alors que 47 gènes ont été régulés dans le sens opposé (Fig. 3). Les 1220 gènes restants n'étaient exprimés de manière différentielle que dans l'une ou l'autre condition (Fig. 3). Les gènes qui ont été régulés dans les deux conditions comprennent ceux impliqués dans la synthèse de la cystéine (cysE, cysK), l'utilisation de la leucine dans la fermentation de Stickland (hadABCI), la fermentation de l'acétoïne (acoABCL), les protéines de la paroi cellulaire (cwp9, cwp12), certains transporteurs (alsT transportant l'alanine ou glycine, rbsK transportant le ribose) et régulation (sinRR'). Dans l'ensemble, cela suggère que CD1687 induit une réorganisation métabolique, y compris celles qui se produisent en réponse au DCA qui conduit à la formation de biofilm23.

Cependant, ces changements ne correspondent pas entièrement à nos analyses précédentes23. Nous avons précédemment observé que le DCA provoque la régulation à la hausse du gène impliqué dans les fermentations de butanoate, de lactate et d'acétate, un changement dans les fermentations Stickland de l'utilisation d'acides aminés aromatiques à l'utilisation d'acides aminés à chaîne ramifiée et de glycine, et la régulation à la baisse des gènes impliqués dans la glycolyse, la consommation de glucose et la sporulation23. Ces changements n'ont pas été observés lorsque le CD1687 était surexprimé, ce qui suggère que le CD1687 n'est pas impliqué dans ces processus ou n'intervient pas dans la réponse immédiate au DCA. CD1687 fait probablement partie de la réponse en aval et peut interagir avec d'autres protéines pour favoriser ces changements.

Étant donné que CD1687 est une protéine de paroi cellulaire15 qui n'a pas de domaine transmembranaire mais probablement ancrée à la membrane de surface cellulaire via une ancre myristoyle27, nous avons émis l'hypothèse que CD1687 induit des changements transcriptionnels en transmettant des signaux externes en interagissant avec des protéines membranaires. Pour trouver ces protéines potentielles, nous avons effectué un essai déroulant en utilisant des extraits bruts de cellules de C. difficile surexprimant un CD1687 marqué à l'hexahistidine C-terminal dans BHISG sans DCA (tableau supplémentaire 5). Ils ont été comparés à des extraits témoins collectés à partir d'un mutant de C. difficile ∆1687 avec le vecteur vide dans les mêmes conditions. Parmi les 43 protéines identifiées uniquement dans les échantillons de test et non dans les échantillons de contrôle, qui comprenaient la protéine CD1687 (tableau supplémentaire 5), quatre devraient être des protéines membranaires et inclure un composant du transporteur de sucre (CD2667) et un symporteur de sodium ( CD2693). Nous avons également identifié quatre protéines appartenant à la grande famille des protéines de liaison aux solutés associées aux transporteurs ABC et à une nucléotide phosphodiestérase (CD0689). Ces cinq protéines pourraient être impliquées dans le transport du signal et la réponse cellulaire menant à l'adaptation dans différentes conditions environnementales28,29. Parmi les protéines membranaires, nous avons également trouvé une lipoprotéine putative (CD0747) et une protéine de la famille LCP (LytR-CpsA-Psr) (CD2766) impliquées dans l'assemblage des polysaccharides de la paroi cellulaire30. Nous avons noté qu'un seul gène codant pour les partenaires protéiques (CD0037) était régulé positivement dans les deux transcriptomes (tableau supplémentaire 5), qui est généralement localisé dans le cytoplasme. Étant donné que la plupart des protéines membranaires identifiées par l'expérience pull-down sont des protéines de paroi cellulaire impliquées dans le transport membranaire, il est possible que CD1687 affecte directement le transport de différents nutriments et correspond à l'effet observé dans nos transcriptomes.

Le CD1687 ayant été détecté dans la fraction de paroi cellulaire15, nous nous sommes demandé si le CD1687 était exposé à la surface cellulaire. Pour vérifier cela, nous avons effectué une analyse par microscopie à épifluorescence de la souche C. difficile 630Δerm et de ses dérivés en utilisant des anticorps polyclonaux de lapin dirigés contre CD1687. Lorsqu'il a été cultivé 48 h dans du BHISG avec ou sans DCA, aucun signal n'a été observé chez le mutant ∆1687 confirmant la spécificité de notre anticorps (Fig. 4 et Figure supplémentaire 5). Pour la souche de type sauvage, nous avons observé un signal faible lorsqu'elle est cultivée en l'absence de DCA, confirmant que cette protéine est exprimée à de faibles niveaux dans des conditions n'induisant pas de biofilm. En présence de DCA, le signal était plus fort en présence de DCA, bien que l'expression de CD1687 n'était pas homogène dans la population. En revanche, le signal pour CD1687 est homogène dans la population de la souche complémentée ∆1687 (Fig. 4 et Figure supplémentaire 5). Étant donné que les cellules n'ont pas été perméabilisées au cours de l'expérience et que le PFA n'affecte pas de manière significative la permabilité de la membrane, nous avons conclu que le CD1687 est exporté vers la paroi cellulaire et exposé à la surface de la cellule.

Une analyse par microscopie à épifluorescence in situ a été réalisée sur des biofilms de 48 h cultivés dans du BHISG + ATC (100 ng/mL) en présence ou en l'absence de DCA (240 µM), comme indiqué. Les souches testées étaient la souche sauvage (630Δerm) portant le vecteur contrôle pDIA6103 et avec la souche Δ1687 portant le plasmide avec un CD1687 inductible (pDIA6920) ou le plasmide contrôle (pDIA6103). L'ADN est coloré avec du DAPI (bleu) et le CD1687 est marqué avec des anticorps de lapin anti-CD1687 spécifiques détectés avec un anticorps anti-lapin de chèvre conjugué au TexasRed (rouge). Les images sont représentatives de trois répliques biologiques et ont été prises avec un microscope inversé Nikon Eclipse Ti (Nikon, Japon). Barre d'échelle : 10 µm.

Sur la base de la localisation cellulaire de CD1687, nous nous sommes demandé si l'ajout des anticorps anti-CD1687 pendant la croissance pouvait empêcher la formation de biofilm induite par le DCA. Comme le montre la figure 5a, l'ajout des anticorps polyclonaux anti-CD1687 aux cellules cultivées dans des conditions induisant un biofilm (BHISG + 240 µM DCA) a fortement inhibé la formation de biofilm de manière dose-dépendante. Aucun effet inhibiteur n'a été observé lorsqu'un anticorps non spécifique non publié a été utilisé à la concentration la plus élevée d'anti-CD1687 qui a inhibé la formation de biofilm (données non présentées). De plus, la croissance bactérienne n'a pas été affectée par les anticorps, quelle que soit la concentration utilisée dans les tests de biofilm (Fig. 5b). Par conséquent, l'inhibition de la fonction extracellulaire de CD1687 empêche la formation de biofilm, indiquant à la fois que CD1687 est exposé à la surface cellulaire et que sa présence à la surface de la paroi cellulaire est essentielle pour la formation de biofilm induite par le DCA.

a La formation de biofilm de la souche 630Δerm a été testée 48 h dans du BHISG avec des cultures de DCA (240 µM) en présence de différentes concentrations d'anticorps de lapin anti-CD1687 (0,05 mg/mL à 0,2 mg/mL). b Cinétique de croissance (DO600nm) du WT (630Δerm) en milieu BHISG avec PBS ou DCA additionné de différentes concentrations d'anticorps de lapin anti-CD1687 (0,05 mg/mL à 0,2 mg/mL). Ac : anticorps ; nsAb : anticorps non spécifique. c La structure prédite alphafold2 de CD1687 montre un peptide signal N-terminal S (rouge) connecté au domaine α bêta (violet) par un peptide de liaison (vert), avec un autre domaine β bêta similaire (jaune) dans la région C-terminale . d 48 h des biofilms se forment par diverses souches Δ1687 complétées par un vecteur vide (pDIA6103) ou des plasmides surexprimant le CD1687 complet (pDIA6920) ou le CD1687 tronqué dépourvu de l'un des deux domaines supprimés (pDIA7242 et pDIA7243, tableau supplémentaire 1) cultivés dans BHISG avec ATC (100 ng/mL) et DCA (240 µM). Chaque point de données représente un réplicat biologique indépendant composé de 2 à 4 réplicats techniques. Les boîtes à moustaches utilisées pour représenter les données quantitatives représentent les quartiles médian, minimum, maximum et supérieur et inférieur. Les astérisques indiquent la signification statistique avec un test ANOVA à un facteur suivi d'un test de comparaison multiple de Dunnett (a) (ns : non significatif ; **p < 0,01) ou d'un test de comparaison multiple de Tukey (d) (ns : non significatif ; *** *p < 0,001).

Pour avoir un aperçu de la structure-fonction de CD1687, nous avons utilisé le logiciel AlphaFold232 pour prédire la structure protéique 3D de CD1687. Comme le montre la figure 5c, CD1687 possède un peptide signal N-terminal en hélice alpha et deux domaines bêta putatifs. Pour rechercher d'éventuelles fonctions des domaines bêta, la structure putative de CD1687 a été analysée dans la base de données Ekhidna via le serveur Dali33, mais aucune fonction n'a été détectée. Étant donné que la fonction de CD1687 pouvait être attribuée à l'un des deux domaines bêta, nous avons complété le mutant ∆1687 en surexprimant CD1687 avec l'un ou l'autre des deux domaines retirés et en cultivant ces souches dans des conditions induisant un biofilm (BHISG + 240 µM DCA. Complémentation du mutant n'a pas été observé, ce qui indique que C. difficile a besoin des deux domaines bêta du CD1687 pour former des biofilms induits par le DCA (Fig. 5d).

Comme nous n'avons pas identifié de fonction potentielle à partir de la structure du CD1687, nous avons cherché à déterminer si le CD1687 avait une activité de liaison à l'ADN, comme observé pour les lipoprotéines de Staphylococcus aureus qui favorisent la formation de biofilm dépendant de l'ADNe34. Étant donné que la matrice du biofilm de C. difficile est principalement composée d'eDNA15, nous avons testé la capacité de CD1687 à se lier à l'ADN en effectuant un test de décalage d'électromobilité (EMSA). Lorsque la protéine CD1687 purifiée a été incubée avec le plasmide pUC9 d'ADN d'E. coli ou un amplicon généré par PCR produit à partir d'ADN de C. difficile (à partir d'une séquence dans la région de CD1438), nous avons observé que la migration de l'ADN était décalée par le la présence du CD1687 et l'augmentation de la concentration de CD1687 sont corrélées à une plus grande rétention (Fig. 6a, b). Cependant, nous n'avons pas observé de décalage lorsque le CD1687 était inactivé par la chaleur ou si la BSA était utilisée comme contrôle à la concentration la plus élevée de CD1687 qui décalait les fragments d'ADN. Pour tester si CD1687 permet l'ancrage de la bactérie à l'ADNe, nous avons effectué une expérience de liaison à l'ADN en utilisant des bactéries C. difficile entières (Fig. 6d). Nous avons lié de manière covalente le même amplicon utilisé dans EMSA (Fig. 6b) à une plaque de microarray avant d'ajouter la souche ∆1687 pDIA6920 (Tableau supplémentaire 1) produisant ou non CD1687. Nous avons ensuite compté les bactéries liées à l'ADN après avoir ajouté la DNAse I dans les puits (Fig. 6d). Nous avons constaté que les bactéries adhéraient davantage à l'ADN dans les puits lorsque le CD1687 était produit que lorsque l'ADN ou le CD1687 était absent (Fig. 6c). Par conséquent, avec cette expérience et les résultats de l'EMSA, nous concluons que CD1687 peut se lier à l'eDNA de manière non spécifique. Cette activité de liaison permet probablement à C. difficile de s'ancrer à l'eDNA dans le biofilm.

Le test de décalage de mobilité électrophorétique (EMSA) a été réalisé avec un plasmide pUC9 d'E. coli ou un ADN b de C. difficile (amplicon PCR de 450 pb) mélangé à diverses concentrations de CD1687 (jusqu'à 16 µM), avec 16 µM d'inactivé par la chaleur ( HI) CD1687 ou BSA utilisé comme contrôle. c UFC de C. difficile mesurées à partir du test d'adhésion. La souche Δ1687 pDIA6920 a été utilisée exprimant ou non CD1687 en réponse à ATc comme décrit en (d). Schéma du test d'adhérence. Nous avons comparé l'adhésion de bactéries exprimant CD1687 ou non dans des puits contenant ou non de l'ADN lié par covalence. Ce schéma a été réalisé avec biorender.com. La boîte à moustaches utilisée pour représenter les données quantitatives représente les quartiles médian, minimum, maximum et supérieur et inférieur. Chaque point de données représente une réplique biologique indépendante. Les astérisques indiquent une signification statistique avec un test ANOVA unidirectionnel suivi du test de comparaison multiple de Dunnett (**p < 0,01 ; ***p < 0,001). Les transferts en a et b proviennent des mêmes expériences et n'ont pas été traités.

Dans cette étude, nous avons confirmé que seul CD1687 dans le cluster CD1685-CD1689 était nécessaire pour la formation de biofilm induite par le DCA, ce qui nécessitait la localisation de CD1687 à la surface cellulaire.

En fait, cette protéine est détectée dans la paroi cellulaire15 ainsi qu'à la surface des cellules (Figs. 4 et 5a) mais elle a été détectée et décrite comme une lipoprotéine ancrée à la membrane27. La petite taille de la protéine et sa structure prédite impliquent que cette protéine devrait être plus proche de la membrane que de la surface de la paroi cellulaire. Étant donné que CD1687 peut être facilement récupéré à partir de la fraction de paroi cellulaire, cela suggère qu'il existe des modifications post-traductionnelles encore non décrites sur CD1687 qui cliveraient son ancre myristoyle, permettant à la protéine de se lier à la paroi cellulaire. Nous avons noté qu'il existe une hétérogénéité significative en réponse au DCA pour l'expression et la localisation de CD1687 à la surface cellulaire dans la population, comme observé par microscopie (Fig. 4 et Figure supplémentaire 5). Cela expliquerait le niveau transcriptionnel relativement faible du cluster de gènes CD1685-CD1689 au niveau de la population15. Fait intéressant, plus CD1687 est exprimé de manière homogène dans la population cellulaire, plus le biofilm formé est important (Fig. 4, Figure supplémentaire 2c). À notre connaissance, l'hétérogénéité d'expression des composants critiques du biofilm n'a pas encore été signalée chez C. difficile. L'hétérogénéité phénotypique des biofilms est bien caractérisée chez plusieurs autres espèces bactériennes, ce qui entraîne une diversification phénotypique et une division du travail dans une population bactérienne clonale35. Par exemple, une sous-population de cellules synthétise la matrice des exopolysaccharides lors de la formation du biofilm chez B. subtilis36. L'hétérogénéité phénotypique a été décrite dans les cellules planctoniques de C. difficile et cela a affecté l'expression du flagelle et des toxines37. Dans ce cas, l'hétérogénéité est contrôlée par un événement spécifique de recombinaison de l'ADN médié par RecV38 et le facteur Rho39. De plus, la morphologie des colonies de C. difficile est également soumise à une hétérogénéité phénotypique entraînant des changements dans la physiologie et la pathogenèse bactériennes et cela se produit par la variation de phase de l'expression du système de transduction du signal CmrRST40,41.

Étant donné que CD1687 forme un opéron avec un système de régulation à deux composants (CD1688-1689) et que CD1687 est une protéine de la paroi cellulaire, nous avons d'abord émis l'hypothèse que CD1687 était impliqué dans la transduction du signal conduisant à des modifications transcriptionnelles en réponse au DCA. Cependant, le CD1687 ne s'est pas lié au DCA, ce qui élimine le rôle putatif du CD1687 en tant que protéine de détection du DCA. De plus, à l'exception de la sporulation, les gènes régulés par CD168842 ont un chevauchement limité suggérant que CD1687 peut ne pas faire partie de la cascade de signalisation CD1688-CD1689. Ceci est cohérent avec l'absence de CD1689 et CD1688 dans notre essai déroulant. Cependant, plusieurs protéines de liaison au soluté et protéines associées au transporteur ont été isolées dans un test pull-down. Ceci et l'analyse transcriptionnelle fournissent la preuve que CD1687 influence le métabolisme de C. difficile. À l'appui de cela, les régulateurs (Spo0A, CodY et SinRR ') qui gèrent les priorités métaboliques pendant les phases de croissance ont été régulés de manière différentielle lorsque CD1687 était surexprimé43,44,45. De plus, l'expression du gène codant pour la toxine et ceux impliqués dans la sporulation ont également été affectés et ces processus sont connus pour être dépendants de l'état métabolique de C. difficile. Lorsque nous avons comparé les gènes régulés de manière différentielle en l'absence de CD1687 dans des conditions induisant du DCA à ceux régulés de manière différentielle lorsque le CD1687 était surexprimé en l'absence de DCA, il n'y avait que 69 gènes communs, qui comprenaient des gènes impliqués dans différentes voies métaboliques et le transport. Cependant, ces changements dans les gènes associés au métabolisme ne se chevauchent pas avec nos analyses précédentes sur l'expression génique lors de la formation de biofilm induite par le DCA23, ce qui suggère que le CD1687 ne fait pas partie de la réponse immédiate au DCA et joue probablement un rôle dans la réponse en aval. Pris ensemble, nos données suggèrent que le CD1687 aide à réorganiser les priorités métaboliques en réponse au DCA, mais cette hypothèse à elle seule n'explique pas le rôle du CD1687 dans la formation du biofilm sans DCA. Par conséquent, CD1687 peut avoir des rôles supplémentaires.

Fait intéressant, de nombreuses protéines présentes à la surface des cellules bactériennes interagissent avec l'ADNe présent dans la matrice du biofilm, ce qui contribue à l'organisation et à la stabilité structurelle du biofilm46. Il a déjà été démontré que les lipoprotéines membranaires interagissent directement avec l'eDNA et participent à l'architecture du biofilm. Chez S. aureus, plusieurs lipoprotéines attachées à la membrane interagissant avec l'ADNe de la matrice du biofilm ont été identifiées comme favorisant la formation du biofilm de S. aureus34. Ici, nous avons confirmé que CD1687 interagit in vitro avec l'ADN de manière non spécifique à la fois avec la protéine purifiée et les bactéries produisant CD1687, dont le niveau de production est suffisant pour augmenter l'adhésion bactérienne à l'eDNA. Ces résultats appuient l'hypothèse selon laquelle CD1687 agit comme une protéine de liaison à l'ADNe lors de la formation du biofilm en créant des points d'ancrage pour l'ADNe à la surface de la cellule. Semblable à notre observation avec CD1687, la surexpression des protéines de liaison à l'ADNe dans S. aureus a entraîné une rétention accrue de l'ADNe de surface et une biomasse de biofilm améliorée. Cependant, la suppression des lipoprotéines de S. aureus a eu un impact minimal sur la formation du biofilm, mais l'augmentation de la porosité du biofilm indique que les interactions de la lipoprotéine avec l'ADNe contribuent à la structure globale du biofilm. Contrairement à la lipoprotéine trouvée dans S. aureus, une délétion ou une inactivation de CD1687 a aboli la formation de biofilm34. Le CD1687 interagissant avec l'eDNA semble être un élément essentiel de la formation de biofilm induite par le DCA. D'autres structures peuvent également interagir avec l'eDNA. Récemment, il a été démontré que deux sous-unités mineures (PilW et PilJ) du T4P de C. difficile interagissent directement avec l'eDNA pour favoriser la formation de biofilm47. Aucune des sous-unités n'a de motif de liaison à l'ADN prédit comme observé avec CD1687. Le T4P est une structure qui favorise la formation de biofilm en l'absence48,49 ou en présence de DCA23. En présence de DCA, PilW est régulé positivement mais n'est pas nécessaire à la formation de biofilm15,23. De plus, le gène pilW était régulé différemment dans notre transcriptome ; régulé positivement dans le WT vs Δ1687 avec analyse DCA (significativement mais en dessous du seuil) et régulé négativement dans le CD1687 surexprimé vs WT sans analyse DCA. Par conséquent, le CD1687 et le T4P peuvent avoir un rôle complémentaire et l'absence de liaison à l'ADNe par l'un de ces composants peut modifier le comportement de C. difficile lors de la formation du biofilm.

Malgré le rôle potentiel de CD1687 en tant que protéine de liaison à l'ADNe et dans le métabolisme, nous ne pouvons pas exclure que la surexpression de CD1687 modifie les propriétés de la paroi cellulaire par les interactions de CD1687 avec d'autres protéines et transporteurs membranaires (tableau supplémentaire 5). Ces interactions pourraient être détectées par différents capteurs, ce qui activerait une boucle de rétroaction pour modifier la paroi cellulaire et la composition des protéines de surface cellulaire. Par exemple, l'opéron dltABCD était régulé positivement lorsque CD1687 était surexprimé en l'absence de DCA. Les protéines DltABCD sont responsables de la D-alanylation des acides teichoïques, qui modifie les charges électriques de la paroi et de la surface cellulaire50. La surexpression de CD1687 a également affecté la morphologie cellulaire ; en réponse au DCA, les cellules exprimant des niveaux élevés de CD1687 présentent une distorsion de taille et de forme réduite (Fig. 4 et Figure supplémentaire 5). Dans l'ensemble, la surexpression de CD1687 peut avoir des effets en aval sur la physiologie de C. difficile et ces changements peuvent contribuer à la formation de biofilm.

Enfin, notre hypothèse est que le mécanisme de formation du biofilm en présence de DCA est différent du mécanisme lorsque le DCA est absent et que le CD1687 est surexprimé. En présence de DCA, nous savons que C. difficile passe par une réorganisation métabolique23 et, sur la base de nos données, CD1687 aiderait avec les priorités métaboliques pour une adaptation à long terme. Une fois qu'il y a suffisamment d'ADNe, CD1687 interagirait avec la liaison eDNA et servirait de point d'ancrage. Lorsque CD1687 est surexprimé indépendamment du DCA, il augmente l'homogénéité de la localisation de surface de CD1687 dans la population et sert de sites d'ancrage multiples pour l'eDNA, ce qui donne un biofilm fortement adhérent. Comme observé chez S. aureus, d'autres lipoprotéines peuvent se lier à l'ADNe chez C. difficile et plusieurs sont régulées positivement en réponse à DCA23. Contrairement aux lipoprotéines caractérisées chez S. aureus, la lipoprotéine CD1687 a probablement une fonction critique dans le métabolisme en réponse au DCA et les autres lipoprotéines ne fournissent pas de redondance fonctionnelle. Cela met en évidence l'importance de CD1687 dans la promotion de la formation de biofilm. D'autres recherches seront nécessaires pour comprendre le rôle et la contribution de ces autres lipoprotéines au biofilm.

Les souches bactériennes et les plasmides utilisés dans cette étude sont répertoriés dans le tableau supplémentaire 1C. difficile ont été cultivées en anaérobie (5 % H2, 5 % CO2, 90 % N2) dans du milieu TY (30 g/L de tryptone, 20 g/L d'extrait de levure) ou dans du milieu BHISG (BHI avec 0,5 % (p/v) de levure extrait, 0,01 mg/mL de cystéine et 100 mM de glucose) et complété par de la céfoxitine (250 μg/ml), de la D-cyclosérine (8 μg/ml) et du thiamphénicol (15 μg/ml) si nécessaire. De plus, 100 ng/mL d'anhydrotétracycline (ATC) ont été ajoutés pour induire le promoteur Ptet des dérivés du vecteur pRPF185 dans C. difficile. Les souches d'E. coli ont été cultivées dans un bouillon LB additionné de chloramphénicol (15 µg/mL) et d'ampicilline (100 µg/mL).

Des cultures d'une nuit de C. difficile cultivées dans du milieu TY avec des antibiotiques appropriés ont été diluées à 1/100 dans du BHISG frais contenant les suppléments souhaités (240 µM DOC, 100 ng/mL ATC ou les deux). Selon le test, les cultures diluées ont ensuite été aliquotées soit avec 1 mL par puits dans des plaques à 24 puits (plaques traitées pour culture tissulaire en polystyrène, Costar, États-Unis) soit avec 200 µL dans des plaques à 96 puits (polystyrène noir pour culture tissulaire- plaques traitées, Greiner Bio One, Autriche). Les plaques ont été incubées à 37 °C dans un environnement anaérobie pendant 48 h. La biomasse du biofilm a été mesurée dans les plaques à 24 puits en utilisant une méthode établie15. Pour les dosages de biofilm dans des plaques à 96 puits utilisées pour la microscopie, le milieu usé a été soigneusement retiré par pipetage et 200 µL de PBS additionné de 4 % de paraformaldéhyde (PFA) ont été ajoutés. Les plaques ont été incubées pendant une heure à température ambiante et le milieu a ensuite été soigneusement retiré par pipetage avant d'ajouter du PBS pendant 48 h à 4 ° C. Dans tous les tests, un milieu stérile a été utilisé comme contrôle négatif et comme blanc pour les tests.

La délétion du gène dans C. difficile a été réalisée comme décrit dans Peltier et al.51. Les régions en amont et en aval des gènes d'intérêt ont été amplifiées par PCR à l'aide de paires d'amorces décrites dans le tableau supplémentaire 1. Les fragments de PCR et pDIA675451 linéarisé ont été mélangés et assemblés à l'aide de Gibson Assembly (NEB, France) et transformés par choc thermique dans E. coli NEB 10β souche. Les constructions plasmidiques ont été vérifiées par séquençage et les plasmides avec les bonnes séquences ont été transformés dans E. coli HB101 (RP4). Les souches résultantes ont été utilisées comme donneurs dans un essai de conjugaison avec les souches pertinentes de C. difficile. Des mutants de délétion ont ensuite été obtenus en utilisant une contre-sélection comme décrit dans Peltier et al.51.

Les souches de C. difficile ont été cultivées en anaérobiose pendant 48 h dans des cultures BHISG de 20 ml avec ATC dans des tubes. Les cellules et les biofilms ont été récoltés par centrifugation (10 min ; 14 000 × g ; 4 °C) et lavés dans un tampon phosphate froid (50 mM ; pH = 7,0 ; 4 °C). Les cellules ont ensuite été remises en suspension dans 1 ml du même tampon phosphate contenant le domaine catalytique purifié de l'endolysine CD27L (3 µg/mL) et la suspension a été incubée 1 h à 37 °C pour lyser les cellules bactériennes. Les extraits totaux ont ensuite été vortexés pendant 1 min et utilisés pour un essai pull-down avec des billes de Ni-NTA comme décrit ci-dessous pour la purification de CD1687 à partir de l'expression d'E. coli. Cinq répliques biologiques de chaque condition ont été utilisées dans le test déroulant (tableau supplémentaire 5).

La souche E. coli Bli5 contenant un plasmide dérivé de pET20 portant le gène CD1687 (tableau supplémentaire 1) a été utilisée pour surexprimer la protéine CD1687 marquée à l'hexa-histidine sans son peptide signal. Les cellules ont été cultivées pendant une nuit à 37 ° C dans du LB additionné de glucose (1 % p/v) et d'antibiotiques (ampicilline 100 µg/mL et chloramphénicol 15 µg/mL). La culture d'une nuit a été transférée (1/100) dans 1 L du même milieu et incubée à 37 °C. Une fois que la culture a atteint une DO600nm de 0,5, de l'IPTG a été ajouté (concentration finale 0,1 mM) et la culture a été incubée pendant 3 h supplémentaires. Les cellules ont ensuite été récoltées par centrifugation (5000 × g, 10 min, 4 ° C) et le culot a été lavé avec du PBS froid. Après centrifugation, le surnageant a été jeté et le culot résultant a été congelé à -20 °C. Le culot a ensuite été remis en suspension dans 15 mL de tampon de lyse (phosphate de sodium 50 mM pH = 8,0 ; NaCl 300 mM) et soniqué. Après centrifugation (5000 × g, 10 min, 4 °C), le surnageant a été récupéré et mélangé avec des billes de Ni-NTA et incubé une heure à 4 °C. Les billes ont ensuite été transférées dans une colonne d'élution et lavées avec un tampon de lavage (50 mM de phosphate de sodium pH = 8,0 ; 300 mM de NaCl ; 10 mM d'imidazole). Les protéines ont été éluées avec 2 ml de tampon phosphate de sodium (50 mM, pH = 8,0) additionné de 300 mM de NaCl et d'un gradient d'imidazole allant de 50 mM à 500 mM. Les protéines éluées ont été analysées par Western immunoblot et les fractions contenant le CD1687 ont été dialysées dans du tampon TAE (Tris-base (20 mM); acide acétique (10 mM); EDTA (0,5 mM); pH = 8,5) à l'aide d'unités de dialyse Slide-A-Lyzer (Thermo Fisher Scientific, États-Unis). Pour produire des anticorps polyclonaux anti-CD1687, deux lapines (New Zealand White) ont reçu quatre injections de 50 µg de CD1687(His6) purifié (0,5 mL d'antigène avec 0,5 mL d'adjuvant complet de Freund à J0, J14, J28 et J42 ) avec la société Covalab (France). Les anticorps ont été purifiés à J53 de l'immunisation.

Toutes les expériences ont été réalisées sur un instrument Biacore T200 (Cytiva, USA) équilibré à 25 °C dans du tampon TAE (base Tris 20 mM, acide acétique 10 mM, EDTA 0,5 mM, pH = 8,5). CD1687(His6) (100 µg/ml) a été capturé pendant 600 s à 2 µl/min sur une puce de capteur NTA chargée de NiCl2, atteignant une densité de surface de 1 000 à 1 200 RU (unités de résonance ; 1RU ≈ 1 pg/mm2). Le DCA (16–2000 µM) a ensuite été injecté à 10 µl/min pendant 120 s, simultanément sur la surface du CD1687 et sur une puce de référence vide à partir de laquelle les signaux non spécifiques ont été soustraits.

Les protéines ont été réduites en utilisant du TCEP 5 mM pendant 30 min à température ambiante. L'alkylation des ponts disulfure réduits a été réalisée en utilisant 10 mM d'iodoacétamide pendant 30 min à température ambiante dans l'obscurité. Les protéines ont ensuite été digérées en deux étapes, d'abord avec 250 ng r-LysC Mass Spec Grade (Promega) pendant 4 h à 30 ° C, puis les échantillons ont été dilués en dessous de 2 M d'urée avec 100 mM Tris HCl pH 8,5 et 500 ng Sequencing Grade Modified Trypsin a été ajouté pour la seconde digestion pendant une nuit à 37 °C. La protéolyse a été stoppée par l'ajout d'acide formique (AF) à une concentration finale de 5 %. Les peptides résultants ont été nettoyés à l'aide de cartouches AssayMAP C18 sur la plateforme AssayMAP Bravo (Agilent) selon les instructions du fabricant. Les peptides ont été concentrés à sec et remis en suspension dans 2 % d'acétonitrile (ACN) et 0,1 % de FA juste avant l'injection LC-MS.

L'analyse LC-MS/MS a été réalisée sur un spectromètre de masse Q ExactiveTM Plus (Thermo Fisher Scientific) couplé à un Proxeon EASY-nLC 1200 (Thermo Fisher Scientific). 500 ng de peptides ont été injectés sur une colonne C18 de 37 cm faite maison (particules de 1,9 μm, taille des pores de 100 Å, ReproSil-Pur Basic C18, Dr. Maisch GmbH, Ammerbuch-Entringen, Allemagne). L'équilibrage de la colonne et le chargement des peptides ont été effectués à 900 bars dans du tampon A (0,1 % FA). Les peptides ont été séparés avec un gradient en plusieurs étapes de 3 à 6 % de tampon B (80 % ACN, 0,1 % FA) en 5 min, 6 à 31 % de tampon B en 80 min, 31 à 62 % de tampon B en 20 min à une débit de 250 nL/min. La température de la colonne a été fixée à 60°C. Les données MS ont été acquises à l'aide du logiciel Xcalibur en utilisant une méthode dépendante des données. Les scans MS ont été acquis à une résolution de 70 000 et les scans MS/MS (première masse fixe 100 m/z) à une résolution de 17 500. La cible AGC et le temps d'injection maximal pour les balayages d'enquête et les balayages MS/MS ont été fixés à 3E6, 20 ms et 1E6, 60 ms, respectivement. Une sélection automatique des 10 ions précurseurs les plus intenses a été activée (Top 10) avec une exclusion dynamique de 30 s. La fenêtre d'isolement a été fixée à 1,6 m/z et l'énergie de collision normalisée fixée à 27 pour la fragmentation HCD. Nous avons utilisé un taux de sous-remplissage de 1,0 % correspondant à un seuil d'intensité de 1,7E5. Les états de charge des ions précurseurs non attribués ainsi que les états chargés 1, 7, 8 et > 8 ont été rejetés et la correspondance des peptides a été désactivée.

Les données brutes acquises ont été analysées à l'aide du logiciel MaxQuant version 2.1.1.052 à l'aide du moteur de recherche Andromeda53,54. Les spectres MS/MS ont été recherchés dans la base de données C.difficile 630 (3957 entrées).

Toutes les recherches ont été effectuées avec l'oxydation de la méthionine et l'acétylation N-terminale des protéines comme modifications variables et la carbamidométhylation de la cystéine comme modification fixe. La trypsine a été sélectionnée comme protéase permettant jusqu'à deux clivages manqués. La longueur minimale du peptide a été fixée à 7 acides aminés et la masse peptidique a été limitée à un maximum de 4600 Da. Le taux de fausses découvertes (FDR) pour l'identification des peptides et des protéines a été fixé à 0,01. La tolérance du peptide de recherche principal a été fixée à 4,5 ppm et à 20 ppm pour la tolérance de correspondance MS/MS. Les deuxièmes peptides ont permis d'identifier les événements de co-fragmentation. Un seuil de taux de fausses découvertes de 1 % a été appliqué aux niveaux des peptides et des protéines. Les données de protéomique de spectrométrie de masse ont été déposées auprès du Consortium ProteomeXchange via le référentiel partenaire PRIDE avec l'identifiant de jeu de données PXD038282. L'analyse statistique des données protéomiques a été réalisée comme décrit précédemment55. En bref, quatre répliques biologiques ont été acquises par condition. Pour mettre en évidence des protéines significativement différentiellement abondantes entre deux conditions, des analyses différentielles ont été menées via le pipeline d'analyse de données suivant : (1) suppression des protéines contaminantes inverses et potentielles ; (2) ne conserver que les protéines ayant au moins deux valeurs quantifiées dans l'une des deux conditions comparées pour limiter les erreurs d'identification et assurer un minimum de réplicabilité ; (3) transformation log2 des intensités restantes des protéines ; (4) normaliser les intensités par centrage médian dans les conditions grâce à la fonction normalizeD du package R DAPAR56, (5) écarter les protéines sans aucune valeur dans l'une des deux conditions comparées : car elles sont quantitativement présentes dans une condition et absentes dans une autre , elles sont considérées comme des protéines différentiellement abondantes et (6) effectuant une analyse statistique différentielle sur celles-ci en exigeant un facteur de variation minimum de 2 entre les conditions et en utilisant un test LIMMA t57,58 combiné à une correction adaptative de Benjamini-Hochberg des valeurs de p grâce à la fonction adjust.p du package R cp4p59. La méthode robuste de Pounds et Cheng a été utilisée pour estimer la proportion de véritables hypothèses nulles parmi l'ensemble des tests statistiques60. Les protéines associées à une valeur p ajustée inférieure à un niveau de FDR de 1 % ont été considérées comme des protéines significativement différentiellement abondantes. Enfin, les protéines d'intérêt sont donc les protéines qui ressortent de cette analyse statistique complétées par celles qui sont quantitativement absentes d'une condition et présentes dans une autre.

Les cellules ont été cultivées dans des plaques à 24 puits et 10 puits par plaque ont été utilisés pour produire un réplicat pour une condition. Pour les conditions de biofilm, le surnageant a été éliminé en retournant la plaque et les biofilms ont été soigneusement lavés deux fois puis remis en suspension dans 3 mL de PBS. Dans d'autres conditions, toute la population bactérienne a été collectée et les cellules ont été récoltées par centrifugation (10 min, 8000 × g, 4 ° C) et remises en suspension dans 1 ml de PBS. Les suspensions cellulaires dans du PBS ont finalement été centrifugées (10 min, 8000 × g, 4 ° C) et les culots ont été congelés à -80 ° C jusqu'à leur utilisation ultérieure. L'extraction de l'ARN total des bactéries et le test PCR qRT ont été effectués comme décrit dans Saujet et al.43.

L'analyse du transcriptome pour chaque condition a été réalisée à l'aide de 4 préparations d'ARN indépendantes. Les bibliothèques ont été construites à l'aide du kit Illumina Stranded Total RNA Prep Ligation with RiboZero Plus (Illumina, USA). L'étape de ribodéplétion a été réalisée à l'aide de sondes spécifiques synthétisées spécifiquement pour cibler les séquences ribosomales de C. difficile (tableau supplémentaire 1). Après ribodéplétion, les banques ont été préparées selon les recommandations du fournisseur. Le séquençage de l'ARN a été réalisé sur la plateforme Illumina NextSeq 2000 en utilisant 67 bases pour une cible de 10 M de lectures par échantillon.

Seuls les CD1687 fraîchement purifiés de E. coli ont été utilisés dans ces tests. Le CD1687 (de 0,5 µM à 16 µM) a été incubé avec de l'ADN (pUC9 ou produit de PCR) dans 10 µl de tampon phosphate de sodium (50 mM ; pH = 8,0) pendant 30 min à température ambiante. Les échantillons ont été chargés et migrés sur des gels d'agarose tamponnés TAE (1 % p/v) pendant 90 min à 100 V. Des contrôles ont été effectués avec CD1687 dénaturé à 100 °C pendant 15 min avant le test. Les gels ont été colorés avec du bromure d'éthidium et des photos ont été prises avec un Amersham ImageQuant 800 (Cytiva). Le plasmide pUC9 a été préparé à partir d'E. coli en utilisant le kit de plasmide Nucleospin (Macherey-Nagel, Allemagne) et l'amplicon PCR utilisé a été généré en utilisant C. difficile 630Δerm comme matrice d'ADN et des amorces ciblant la région de CD1438 (tableau supplémentaire 1) . L'ADNg a été extrait de la culture cellulaire à l'aide du kit DNeasy Blood & Tissue (QIAGEN, Pays-Bas).

Une 5'RACE a été réalisée en utilisant le kit 5' RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends, version 2.0 (Invitrogen, USA). En bref, l'ADNc a été généré par transcription inverse à partir d'un extrait d'ARN total suivi d'une dégradation de l'ARN. La queue dC a ensuite été réalisée avec l'ADNc et l'ADN à queue dC résultant a été utilisé comme matrice dans la PCR comme décrit dans les instructions du kit. Les produits de PCR ont été analysés par électrophorèse sur gel d'agarose (agarose à 1 % dans du tampon TAE). Pour identifier les sites de début de transcription, les produits de PCR ont été insérés dans le kit de vecteur facile pGEM-T comme décrit par le fabricant (Promega, USA). Les inserts ont ensuite été amplifiés par PCR et les produits de PCR résultants ont été séquencés.

Pour la microscopie, des biofilms de 48 h ont été générés dans des plaques à 96 puits (noir, Greiner) comme décrit ci-dessus, lavés et 50 μl des anticorps polyclonaux anti-CD1687 dilués dans du PBS (400 ng/mL) ont ensuite été ajoutés à chaque puits et incubés une nuit à 4°C. Les puits ont été soigneusement lavés deux fois avec du PBS suivi de l'ajout d'une solution contenant du DAPI (dilution 1/1000) et des anticorps secondaires (chèvre anti-lapin conjugué au Texas Red ; dilution 1/5000 ; Invitrogen, cat : T-2767) dans PBS. Les plaques ont été incubées à température ambiante pendant 2 h. Les puits ont ensuite été soigneusement lavés avec du PBS et 200 μl de PBS frais ont été ajoutés pour l'acquisition des données. Les images ont été prises avec le microscope inversé Nikon Eclipse Ti (Nikon, Japon).

Un amplicon de 433 pb modifié à une extrémité avec une amine C6 et correspondant à la région du gène CD1438 a été utilisé pour revêtir de manière covalente une plaque 96 puits DNA-BIND Surface (Corning, USA) selon les directives du fabricant. En bref, 100 µL d'une solution d'amplicon à 250 nM préparée dans le tampon de liaison (tampon phosphate de sodium 50 mM pH = 8,5 ; EDTA 1 mM) ont été placés dans les puits et la plaque a été incubée pendant une nuit à 4 °C. Les puits témoins ont été réalisés en utilisant uniquement le tampon de liaison. Ensuite, les puits ont été lavés trois fois avec 200 µL de PBS et la plaque a été introduite dans la chambre anaérobie. Des cultures en phase exponentielle de la souche Δ1687pDIA6920 (tableau supplémentaire 1) cultivée dans du BHISG et des antibiotiques appropriés avec ou sans l'inducteur ATc, ont été diluées à une DO (600 nm) de 0,5 et 200 µL de ces suspensions bactériennes ont été placées dans les puits d'ADN -plaque revêtue. La plaque a été incubée en anaérobiose à 37 ° C pendant 20 min, puis lavée deux fois avec du BHISG avant d'ajouter 200 µL de BHISG contenant 25 µg de DNAse I dans chaque puits. La plaque a été incubée en anaérobiose pendant 20 min à 37 ° C et les bactéries ont été comptées à partir de la suspension sur des plaques de gélose BHI. L'amplification par PCR pour obtenir l'amplicon modifié a été réalisée avec l'ADN chromosomique de C. difficile 630Δerm avec des amorces ciblant la région de CD1438 (tableau supplémentaire 1).

Les tests de biofilm, le test de liaison bactérie-ADN et la RT-qPCR ont été analysés à l'aide d'un test ANOVA unidirectionnel suivi d'un test de comparaison multiple de Tukey ou d'un test de comparaison multiple de Dunnett.

De plus amples informations sur la conception de la recherche sont disponibles dans le résumé des rapports de recherche sur la nature lié à cet article.

Les données RNA-Seq générées dans cette étude sont disponibles dans le NCBI-GEO avec le numéro d'accession GSE218475. Les données de protéomique de spectrométrie de masse ont été déposées auprès du Consortium ProteomeXchange via le référentiel partenaire PRIDE avec l'identifiant de jeu de données PXD038282.

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Ce travail a été financé par l'Institut Pasteur, le "Biologie Intégrative des Maladies Infectieuses Emergentes" (LabEx IBEID) financé dans le cadre du "Programme Investissements d'Avenir" du Gouvernement Français et l'ANR DifBioRel AAPCE5. EA est doctorant de l'Université Paris-Cité. LH est doctorant de Sorbonne Université.

Institut Pasteur, Université Paris-Cité, UMR-CNRS 6047, Laboratoire Pathogenèse des Bactéries Anaérobies, F-75015, Paris, France

Émile Auria & Bruno Dupuy

Institut Pasteur, Université Paris-Cité, INSERM UMR1222, Unit of Antibodies in Therapy and Pathology, Paris, France

Lise Hunault

Sorbonne Université, INSERM, CNRS, Centre d’Immunologie et des Maladies Infectieuses (CIMI-Paris), F-75013, Paris, France

Lise Hunault

Plateforme de Biophysique Moléculaire, Institut Pasteur, CNRS UMR3528, Paris, France

Patrick Angleterre

Plateforme Technologique Biomics, Institut Pasteur, Paris, France

Marc Monot & Juliana Pipoli Da Fonseca

Plateforme Proteomic, Institut Pasteur, Paris, France

Mariette Matondo & Magalie Duchateau

Département de biochimie, microbiologie et immunologie, Université de la Saskatchewan, Saskatoon, SK, Canada

Yannick DN Tremblay

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EA et BD ont conçu l'étude et les expériences ; EA, LH, PE, JPF, MD et BD ont réalisé des expériences ; M.Monot et M.Matondo ont fourni une assistance pour les analyses transcriptomiques et protéomiques, respectivement ; EA et BD ont rédigé et édité le manuscrit ; PE, M.Monot, MD, M.Matondo et YDT ont aidé à l'écriture et à l'édition ; Tous les auteurs ont lu et approuvé le manuscrit final.

Correspondance à Bruno Dupuy.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

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Auria, E., Hunault, L., England, P. et al. La lipoprotéine de la paroi cellulaire CD1687 agit comme une protéine de liaison à l'ADN lors de la formation de biofilm induite par le désoxycholate chez Clostridioides difficile. npj Biofilms Microbiomes 9, 24 (2023). https://doi.org/10.1038/s41522-023-00393-5

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Reçu : 06 décembre 2022

Accepté : 27 avril 2023

Publié: 11 mai 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s41522-023-00393-5

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