La pangénomique du champignon Amanita phalloides et des Agaricales révèle une évolution dynamique des gènes de toxines dans une gamme invasive

The ISME Journal (2023)Citer cet article

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Le champignon vénéneux européen Amanita phalloides (le "chapeau de la mort") envahit la Californie. On ne sait pas si les métabolites secondaires toxiques des capsules mortelles évoluent à mesure qu'elles envahissent. Nous avons développé un pipeline bioinformatique pour identifier les gènes MSDIN qui sous-tendent la toxicité et sondé 88 génomes de la capsule mortelle d'une population californienne invasive et de l'aire de répartition européenne, découvrant une diversité jusque-là insoupçonnée de MSDIN composée à la fois d'éléments de base et d'éléments accessoires. Chaque individu mortel possède une suite unique de MSDIN, et les gènes de toxine sont significativement différenciés entre les échantillons californiens et européens. Les gènes MSDIN sont maintenus par une forte sélection naturelle et le profilage chimique confirme que les gènes MSDIN sont exprimés et donnent des phénotypes distincts ; notre profilage chimique a également identifié un nouveau peptide MSDIN. Les gènes de toxines sont physiquement regroupés dans les génomes. Nous contextualisons nos découvertes en sondant les MSDIN dans les génomes de tout l'ordre des Agaricales, révélant que la diversité des MSDIN est née d'expansions indépendantes de familles de gènes entre les genres. Nous rapportons également la découverte d'un MSDIN chez une Amanita en dehors du clade des "Amanitas létales". Enfin, l'identification d'un gène MSDIN et de son gène de traitement associé (POPB) chez Clavaria fumosa suggère que l'origine des MSDIN est plus ancienne qu'on ne le soupçonnait auparavant. L'évolution dynamique des MSDIN souligne leur potentiel de médiation des interactions écologiques, impliquant les MSDIN dans l'invasion en cours. Nos données modifient la compréhension de l'histoire évolutive des champignons vénéneux, soulignant des parallèles frappants avec les toxines animales évoluées de manière convergente. Notre pipeline fournit une feuille de route pour explorer les métabolites secondaires dans d'autres basidiomycètes et permettra la prospection de médicaments.

Une énorme littérature scientifique caractérise les mécanismes écologiques et évolutifs permettant le succès d'organismes introduits dans de nouveaux environnements [1, 2]. La recherche a été utilisée pour guider l'atténuation des dommages écologiques et économiques résultant des invasions biologiques [3]. Cependant, la biologie de l'invasion s'est concentrée principalement sur les espèces végétales [4] et animales [5]. Gladieux et al. [6] spéculent que les invasions fongiques peuvent être plus courantes que les invasions végétales ou animales, suggérant la nature discrète de la recherche sur les champignons. Pendant ce temps, les champignons envahissants ont dévasté les forêts [7], poussé plusieurs amphibiens et chauves-souris à la quasi-extinction [8, 9] et causé des maladies humaines [10]. Mais on sait relativement peu de choses sur les traits permettant le succès des champignons invasifs non pathogènes (mutualistes et décomposeurs) dans de nouveaux environnements.

Les métabolites secondaires (MS) fongiques, distincts des métabolites primaires, semblent être des médiateurs des interactions écologiques [11]. Les SM sont communs à de nombreux champignons et façonnent les niches des espèces en favorisant la compétition [12,13,14], en influençant la gamme d'hôtes [15, 16] et en protégeant contre les facteurs de stress environnementaux [17,18,19]. Jusqu'à récemment, on pensait que les profils SM définissaient les espèces, avec relativement peu ou pas de variation au sein d'une espèce, mais de nouvelles données suggèrent que des adaptations locales peuvent se manifester dans des schémas spécifiques à la population de diversité SM intraspécifique [20]. Les SM spécifiques à la population influencent les aires de répartition géographiques des espèces et informent les inférences macroévolutives [20]. La plupart des recherches sur les SM fongiques ciblent les ascomycètes. Alors que les champignons sont connus pour leur chimie, en particulier leur capacité à provoquer des hallucinations et des empoisonnements, les histoires de vie complexes, la génétique et les défis techniques de la manipulation des basidiomycètes ont empêché le développement d'outils pour cataloguer la diversité des champignons SM et limité les descriptions de leur histoire évolutive.

Le "chapeau de la mort" Amanita phalloides (Vail. ex Fr.) Link est un basidiomycète ectomycorhizien infâme et venimeux originaire d'Europe et introduit ailleurs, y compris en Amérique du Nord et en particulier en Californie [21, 22]. Les champignons ectomycorhiziens peuvent modifier la dynamique compétitive entre les espèces végétales [23], modifier la structure de la communauté du sol [24], faciliter l'homéostasie des métaux [25] et influencer le cycle des nutriments [26]. Les conséquences écologiques potentielles de l'expansion de l'aire de répartition du bonnet mortuaire en Californie restent inconnues, mais son abondance [27] et les empoisonnements souvent mortels associés à son champignon [28] conduisent de nombreux auteurs à l'identifier comme envahissant [29]. Les facteurs contribuant à la propagation et au succès des champignons ectomycorhiziens non indigènes ont été identifiés sur la base de modèles de succession primaire [30], mais la question de savoir si les interactions compétitives ou défensives avec la biodiversité indigène facilitent également la propagation reste non étudiée. Les interactions interspécifiques sont souvent médiatisées par les SM; chez les plantes, les SM peuvent avoir des effets particulièrement prononcés dans la gamme envahissante d'une espèce, offrant de « nouvelles armes » lorsqu'ils sont en concurrence avec des organismes indigènes « naïfs » [31, 32]. On ne sait pas si différentes populations d'A. phalloides utilisent ou exploitent des armes.

Quelques-uns des composés qui sous-tendent la toxicité notoire d'A. phalloides sont identifiés, notamment l'α-amanitine, la phalloïdine et la phallacidine [33]. Ces toxines sont des constituants d'une classe de SM récemment découverte nommée "MSDIN", basée sur le motif "leader" d'acides aminés conservé Met-Ser-Asp-Ile-Asn. Les gènes MSDIN codent pour des peptides courts (35 à 36 acides aminés), synthétisés par les ribosomes et modifiés après la traduction (RiPP) [34]. Une prolyl oligopeptidase (POPB) spécifique à MSDIN clive les parties leader et "suiveuse" conservées de la pro-protéine MSDIN, ce qui donne un "noyau" cyclisé qui devient ou est le produit final [35]. Alors que la cyclisation de divers peptides centraux MSDIN a été démontrée par analyse chimique (par exemple, Zhou et al. [36]), la cyclisation est souvent déduite directement des données de séquence basées sur les motifs leader et suiveur hautement conservés. Emblématique de la littérature SM, la recherche sur les MSDIN s'est concentrée sur l'identification de nouvelles séquences de différentes espèces à l'aide d'un seul ou d'un petit nombre de génomes de référence ; on sait peu de choses sur la diversité de ces gènes au sein des espèces. À ce jour, nous savons que le gène MSDIN codant pour l'α-amanitine se propage de manière discontinue à travers les Agaricales, que l'on ne trouve que dans les genres Galerina, Lepiota et Amanita [33]. Plusieurs auteurs infèrent le transfert horizontal de gènes pour expliquer la distribution discontinue des gènes MSDIN [33, 37]. Cependant, des questions subsistent quant à l'importance relative de la transmission horizontale et verticale dans l'histoire évolutive des gènes (revue par Walton [33]). L'identification récente de gènes supplémentaires impliqués dans la biosynthèse de l'α-amanitine suggère qu'une espèce ancestrale différente, encore non identifiée, pourrait également être impliquée dans les origines des MSDIN [38]. Alors que l'α-amanitine est le seul MSDIN produit par l'espèce Galerina [39, 40], la famille de gènes MSDIN s'est étendue dans le genre Amanita, ce qui a donné lieu à des dizaines de MSDIN uniques trouvés dans différentes espèces [34, 41, 42, 43]. On suppose que les MSDIN assurent la défense contre les insectes, les nématodes et d'autres animaux [33]. Cependant, le manque d'informations sur la diversité intraspécifique de ces composés empêche l'expérimentation écologique ciblée nécessaire pour expliquer l'histoire naturelle et la diversification des MSDIN chez Amanita.

Nous avons cherché à établir le potentiel des produits géniques MSDIN pour façonner les interactions dans une population invasive de Californie (CA) en développant un pipeline bioinformatique pour automatiser l'identification des gènes MSDIN, en demandant spécifiquement : (1) Les génomes des individus californiens d'A. phalloides codent-ils chacun la même suite de MSDINS, sinon, comment le pangénome MSDIN est-il structuré et existe-t-il des gènes principaux et accessoires ? (2) Les gènes de toxines sont-ils maintenus par sélection naturelle ? (3) L'expansion de la famille de gènes MSDIN est-elle antérieure à la spéciation d'Amanita spp. et comment l'expansion a-t-elle façonné la distribution physique des MSDIN au sein des génomes ? Nous avons également utilisé des analyses chimiques pour confirmer la production de produits MSDIN bien connus et pour rechercher de nouveaux peptides MSDIN, en soulignant que les produits du gène MSDIN sont exprimés et traduits, ce qui donne des phénotypes et des composés mesurables ayant le potentiel de médier les interactions écologiques.

Les champignons d'A. phalloides ont été échantillonnés de manière intensive à partir d'une seule population envahissante à Point Reyes National Seashore, Californie, États-Unis (n = 68) et à partir de populations indigènes à travers l'Europe (n = 20), pour un total de 88 génomes (tableau S1) . Les champignons ont été collectés entre 1978 et 2015, la plupart des échantillonnages étant concentrés en 2014 et 2015 (tableau S1). Nous avons également collecté des champignons putativement identifiés comme Amanita thiersii et Amanita foetens au Kansas (A. thiersii) et en Argentine (A. foetens), et nous avons utilisé ces génomes dans des analyses comparatives et comme témoins. Nous avons numéroté les champignons collectés de 1 à 90 (par exemple, 1mAP, 2mAP). Nos numéros correspondent aux numéros AmanitaBASE utilisés dans d'autres publications générées par le laboratoire Pringle [44] (tableau S1). Un seul champignon (7mAP; tableau S1) avec un assemblage de très mauvaise qualité a été utilisé dans les analyses initiales des gènes MSDIN, mais il a été retiré des analyses ultérieures (l'assemblage 7mAP était complet à 10% tel que mesuré par les BUSCO, et les prochains assemblages les plus pauvres d'A. phalloïdes étaient complets à 72,1, 91 et 92 %, respectivement).

Les ADN génomiques ont été extraits et séquencés à l'aide d'une plate-forme HiSeq2500 (Illumina) en mode rapide avec des lectures appariées de 251 pb comme décrit par Wang et al. [45]. Un seul isolat (72mAP) a également été séquencé avec une plateforme PacBio RS II Sequel pour des lectures longues (N50 = 6310 bp) et des données utilisées pour assembler le génome de référence [45]. Les SNP ont été appelés (Wang et al. [45]) à l'aide du pipeline GATK [46] (tableau S1), en suivant les meilleures pratiques (https://gatk.broadinstitute.org/hc/en-us/articles/360035535932-Germline- short-variant-discovery-SNPs-Indels-). Les SNP ont ensuite été filtrés en dur à l'aide de paramètres définis dans le flux de travail GATK pour les organismes non modèles (https://gatk.broadinstitute.org/hc/en-us/articles/360035890471), en particulier : QD < 2,0 || FS > 60,0 || QM < 40,0|| MQRankSum < −12,5 || ReadPosRankSum < −8,0 pour les SNP ; et QD < 2,0 || PE > 200,0 || ReadPosRankSum < −20,0 pour les indels. Des champignons appartenant à la même genette (clones produits par un seul individu mycélien) ont été identifiés comme décrit dans Wang et al. [45]. En bref : les clones ont été identifiés en utilisant deux approches différentes, la première impliquant une matrice de distance euclidienne résultant de SNP filtrés et la seconde basée sur des analyses de parenté (Wang et al. [45]). De plus, un seul isolat (1mAP) traité dans des travaux antérieurs, mais non utilisé en raison de problèmes de séquence de mauvaise qualité (qui n'étaient pas évidents dans nos efforts), a été corrigé par clone sur la base des relations phylogénétiques identifiées ici (Fig. 1). Les deux approches ont identifié les mêmes individus génétiques, ou genettes [45].

Les relations phylogénétiques entre 38 spécimens d'A. phalloides, un Amanita thiersii et un Amanita foetens sont représentées dans un arbre à maximum de vraisemblance construit à l'aide de SNP pangénomiques. Les cases colorées indiquent la présence d'un allèle MSDIN tel que défini par une séquence "core" spécifique. Les locus représentant des allèles, ou des groupes d'allèles, à un emplacement physique spécifique dans un génome sont séparés par des colonnes vides. Les nombres supérieurs à un indiquent des locus dupliqués codant pour des allèles identiques. Dans le génome de référence de haute qualité, nous avons validé trois duplications (voir Méthodes supplémentaires), mais nous n'avons pas pu valider les duplications dans d'autres génomes et des erreurs d'assemblage sont possibles. Pour cette raison, nous avons regroupé les trois loci dupliqués du génome de référence (*) pour fournir une congruence avec d'autres duplications putatives (mais non résolues). Si une séquence centrale était déduite des données SNP, sa valeur de comptage était définie sur un même si elle n'était pas trouvée dans l'assemblage du génome. La détermination des "connus" au bas de la figure est basée sur des rapports antérieurs de séquences centrales MSDIN ou sur la caractérisation de produits chimiques. Les noms de locus (en texte noir) sont basés sur l'allèle présent dans l'assemblage du génome de référence (voir 72mAP en gras). Le nom d'un seul locus non trouvé dans le génome de référence (FILAPIIP) a été choisi par ordre alphabétique. Le panneau au-dessus de la carte thermique indique les différences de fréquences alléliques entre les individus californiens (en rouge) et européens (en orange). Des différences significatives dans les fréquences alléliques à chaque locus sont basées sur l'analyse de la variance moléculaire. Les locus AFPHFYVPP, FFPIVFSPP, FIFPPFFIPP et SFFFPIP n'ont pas été inclus dans les analyses de fréquence allélique en raison de l'incertitude de certains appels (voir Résultats). † Ces séquences MSDIN sont associées à des produits matures avec une bioactivité caractérisée comme des toxines. De gauche à droite : phallacidine (AWLVDCP), phalloïdine (AWLATCP), β-amanitine (IWGIGCDP) et α-amanitine (IWGIGCNP).

Les adaptateurs et les séquences de faible qualité ont été coupés des lectures brutes à l'aide de BBMap v38.32 [47]. Les lectures ajustées ont été assemblées à l'aide de SPAdes v3.5.0 [48]. Les tentatives d'annotation des gènes MSDIN dans les génomes à l'aide de logiciels existants ont échoué, même lorsque les annotateurs de gènes ont été formés sur des ensembles de MSDIN connus. Par conséquent, nous avons développé notre propre pipeline pour identifier nos gènes d'intérêt.

Pour identifier les séquences MSDIN dans les assemblages du génome, nous avons créé un pipeline bioinformatique personnalisable. Les inférences résultantes de la présence/absence de MSDIN à partir des données d'assemblage ont été validées sur la base des données d'alignement, comme décrit ci-dessous. En bref, un ensemble de séquences MSDIN connues a été utilisé dans une recherche initiale de génomes tBLASTn [49] (tableau S2). Les hits avec des valeurs e inférieures à 100, un seuil cohérent avec une étude publiée [43], ont été traduits dans tous les cadres de lecture et scannés pour des motifs de type MSDIN à l'aide de MAST formé sur des motifs leader et suiveur identifiés avec MEME [50]. Les protéines où des motifs de séquence leader ont été trouvés en amont des motifs suiveurs et où MEME a déterminé une valeur e inférieure à 100, ont été conservées pour une analyse plus approfondie. Tous les introns possibles (y compris les introns GC-AG non canoniques) ont été identifiés et les protéines résultantes ont été filtrées en fonction des caractéristiques connues des gènes MSDIN (comme détaillé par Walton [33]; Méthodes supplémentaires). Notre pipeline est composé d'une série de scripts autonomes et facilement personnalisables disponibles dans les documents supplémentaires. Notre pipeline trouve tous les gènes MSDIN précédemment identifiés dans des génomes bien étudiés (voir Méthodes supplémentaires).

Cependant, comme stratégie pour permettre l'identification de nouveaux MSDIN, nous avons choisi des paramètres de pipeline bioinformatiques tels que des séquences "de type MSDIN" ont également été incluses dans les sorties. Finalement, nous avons exclu trois séquences de type MSDIN trouvées dans les génomes d'Agrocybe cylindracea (le nom de cette espèce est conservé par souci de cohérence avec le NCBI mais est maintenant connu sous le nom de Cyclocybe cylindracea) et Mycena chlorophos d'une analyse plus approfondie. Ces séquences sont tombées à la valeur de coupure minimale de notre pipeline et les relations phylogénétiques avec la séquence MSDIN connue et l'absence de POPB dans les génomes correspondants suggèrent qu'elles ne sont pas, en fait, des MSDIN (Résultats supplémentaires; Fig. S1).

Pour éviter les problèmes associés aux erreurs d'assemblage ou à la fragmentation, tous les appels de présence/absence de MSDIN ont été validés à l'aide de méthodes basées sur l'alignement. Les fichiers générés par notre pipeline MSDIN identifient les régions MSDIN dans les génomes cibles, ce qui nous permet de créer des sous-ensembles de données d'alignement. Nous avons aligné les lectures de tous les génomes d'A. phalloides sur le génome de référence à l'aide de BWA MEM [51]. La profondeur de lecture aux locus MSDIN a été déterminée à l'aide de BEDTools [52]. Pour les alignements sans délétions à grande échelle, nous avons réinséré des indels et des SNP (de Wang et al. [45]) dans les séquences génomiques de référence en utilisant SAMTools faidx [53] et vcf-consensus de VCFTools [54]. Les séquences résultant de la réinsertion des SNP/indels ont ensuite été comparées aux résultats d'assemblage. Dans les cas où la présence d'un MSDIN était fortement étayée par des données d'alignement mais que la séquence n'était pas assemblée, nous avons déduit une erreur d'assemblage et déduit des MSDIN directement à partir des résultats d'alignement. Lorsque des écarts ont été trouvés entre les résultats d'alignement et d'assemblage, nous avons visualisé les alignements pertinents aux côtés des alignements non affectés à l'aide de l'IGV [55]. Les divergences entre les données d'assemblage et d'alignement ont été le plus souvent expliquées par l'apparition d'un SNP hétérozygote qui a abouti à deux séquences MSDIN possibles où les SPAdes [48] n'ont assemblé qu'un seul allèle. Au niveau d'un petit sous-ensemble de loci, plusieurs SNP hétérozygotes n'ont pas été mis en phase par un logiciel d'appel de variantes (c'est-à-dire non associés à l'un ou l'autre chromosome homologue dans le dikaryon). Dans ces cas, nous avons confirmé manuellement le phasage des SNP en visualisant tous les alignements (corrigés par clone), toujours en utilisant l'IGV [55].

Lorsqu'un locus MSDIN n'était pas présent dans le génome de référence, nous avons aligné les lectures de tous les génomes sur le génome avec le nouveau MSDIN et l'assemblage de la plus haute qualité (tel que déterminé par le score BUSCO). Dans ces cas, nous avons vérifié le lieu comme décrit ci-dessus. Cependant, comme ces cas étaient rares, les SNP n'ont pas été appelés à nouveau et à la place, les variantes ont été déduites manuellement grâce à la visualisation des données d'alignement dans l'IGV [55]. Dans de rares cas, nous avons observé un désalignement des lectures entre des locus très étroitement liés, généralement lorsqu'un locus correspondant dans un isolat aligné n'était pas présent dans la référence.

La réinsertion des SNP dans le génome de référence a fourni des preuves solides de la cooccurrence des MSDIN au même locus. La structure du locus a été validée par des alignements à grande échelle de contigs (détaillé dans les méthodes supplémentaires). Le locus AFPHFYVPP n'a pas été assemblé dans le génome de référence à lecture longue mais était évident dans son assemblage en utilisant uniquement des lectures courtes (72 mAP). Les locus étaient généralement nommés en fonction des allèles trouvés dans le génome de référence. Cependant, le locus FILAPIIP n'a pas été trouvé dans le génome de référence et son nom a été choisi par ordre alphabétique.

Le regroupement physique des MSDIN a été évalué à l'aide d'une expression binomiale pour évaluer la distribution des MSDIN. De plus, nous avons effectué un test de permutation pour comparer les distances observées entre les locus MSDIN à une distribution aléatoire, comme détaillé dans les méthodes supplémentaires. Les corrélations entre les distances physiques et génétiques ont été calculées avec le test de corrélation de Pearson mis en œuvre dans R. Nous avons visualisé la distribution des MSDIN parmi les individus A. phalloides en utilisant les packages R ggplot2 [56], ggtree [57] et ggtreeExtra [58].

Pour fournir un contexte phylogénétique à nos résultats, nous avons téléchargé les 249 génomes d'Agaricales (représentant 163 espèces) disponibles auprès du NCBI le 22 novembre 2021 (tableau S3). Un ensemble d'orthologues à copie unique conservés à travers les champignons (OrthoDB v9) a été identifié dans tous les génomes à l'aide de BUSCO [59]. Nous avons aligné les séquences BUSCO en utilisant MAFFT v7.475 [60] avec le paramètre "-auto". Les alignements résultants ont été ajustés à l'aide de trimAl v1.2 avec le paramètre "-automate1" et utilisés pour construire des arbres à vraisemblance maximale avec IQ-TREE v1.6.2 [61] après avoir testé le modèle le mieux ajusté à l'aide du paramètre "-mset" contraint dans les modèles compatibles RAxML. Le cas échéant, l'amorçage a été effectué dans IQ-TREE en utilisant 1 000 répliques de l'approximation d'amorçage ultra-rapide. Une phylogénie consensuelle des arbres BUSCO a été déduite avec ASTRAL [62]. Nous avons utilisé un graphique UpSet généré avec UpSetR [63] pour comparer les séquences de base MSDIN entre les espèces, en ajoutant des données de Luo et al. [38] pour identifier les différences et les chevauchements (tableaux S2 et S4). Nous avons établi des relations phylogénétiques entre les isolats d'A. phalloides, d'A. thiersii et d'A. foetens utilisés ici à partir de données de SNP bialléliques filtrées qui ont été éclaircies de sorte qu'aucun SNP n'était à moins de 1 kb à l'aide de VCFtools [54]. Ce sous-ensemble de SNP a été traité à l'aide de IQ-TREE comme décrit ci-dessus.

Les gènes POPB codent pour une enzyme nécessaire à la modification post-traductionnelle des pro-protéines MSDIN, et pour les identifier, nous avons obtenu un ensemble de séquences de protéines POPB et POPA (POPA est un gène étroitement apparenté qui n'a pas d'impact sur la maturation MSDIN) du NCBI (Fig. .S2 et Tableau S5). Nous avons utilisé tBLASTn pour identifier les régions cibles dans tous les génomes d'Agaricales, en basant l'identification sur tous les résultats (y compris les alignements très courts) avec des valeurs e inférieures à 0,01. Nous avons extrait les 6 ko flanquant de chaque côté de chaque hit (12 ko au total ; moins si nous rencontrions la fin d'un contig associé) à l'aide de SAMtools faidx [53]. Nous avons identifié des gènes candidats dans les régions cibles à l'aide d'AUGUSTUS v3.4.0 [64] avec des modèles de gènes Laccaria bicolor prédéfinis et en utilisant des signaux protéiques à partir de séquences POPA et POPB connues (tableau S5). Toutes les protéines trouvées dans les régions cibles ont de nouveau été interrogées avec des séquences POPA et POPB connues à l'aide de BLASTp. Les 10 meilleurs hits POPA et POPB (tels que triés par score de bits et selon la disponibilité, un maximum de 20 séquences) de chaque génome ont été analysés : ces séquences protéiques ont été alignées avec des séquences POPA et POPB connues à l'aide de MAFFT, coupées à l'aide de trimAl et des relations phylogénétiques parmi eux ont été déterminés à l'aide de l'arbre IQ, comme détaillé ci-dessus. Les phylogénies résultantes ont été inspectées manuellement et la présence de POPB a été déduite lorsqu'une séquence candidate a formé un clade monophylétique avec d'autres séquences POPB connues.

Sur la base de données bioinformatiques préliminaires, trois spécimens européens (5mAP, 9mAP et 29mAP) et trois californiens (21mAP, 23mAP et 75mAP) A. phalloides ont été sélectionnés pour représenter autant de diversité MSDIN que possible. Un petit échantillon de chaque champignon séché a été broyé en une poudre fine. Chaque échantillon a été extrait avec 10 ml de méthanol à 100 % et passé à travers un papier filtre. Les extraits ont été réduits à sec à l'air, pesés et remis en suspension dans du méthanol à 100 % à une concentration finale de 1 mg/mL.

L'UHPLC-HRMS a été réalisée sur un système UHPLC Thermo Scientific Vanquish connecté à un spectromètre de masse Thermo Scientific Q Exactive Hybrid Quadripôle-Orbitrap fonctionnant en mode d'ionisation positive. Une colonne Waters Acquity UPLC BEH-C18 (2,1 × 100 mm, 1,7 μm) a été utilisée avec de l'acétonitrile (0,1 % d'acide formique) et de l'eau (0,1 % d'acide formique) à un débit de 0,2 mL/min. Une méthode de gradient de criblage a été mise en œuvre comme suit : Démarrage à 10 % organique pendant 5 min, suivi d'une augmentation linéaire à 90 % organique sur 20 min, une autre augmentation linéaire à 98 % organique pendant 2 min, maintien à 98 % organique pendant 5 min , redescendant à 10 % organique pendant 3 min, et se maintenant à 10 % organique pendant les 2 dernières minutes, pour un total de 37 min. Dix microlitres de chaque échantillon ont été injectés dans le système pour l'analyse. Trois toxines MSDIN bien connues, l'α-amanitine, la phalloïdine et la phallacidine, ont été identifiées en comparant les profils aux normes achetées auprès de Cayman Chemical (Ann Arbor, MI, États-Unis). La quantification absolue de ces trois composés a été calculée par rapport à une courbe étalon (0,1–10 ppm).

Les analyses génétiques des populations ont utilisé un ensemble de données corrigées par clone pour identifier les modèles démographiques. Nous avons calculé les statistiques D et de diversité de Tajima dans des fenêtres de 500 pb à partir de données d'alignement à l'aide du package PopGenome R [65]. La différenciation du contenu en gènes MSDIN entre l'Europe et la Californie a été calculée avec l'Analyse de la Variance MOléculaire (AMOVA) dans GENALEX [66]. L'isolement génétique entre les échantillons européens et californiens a ensuite été validé à l'aide d'une analyse discriminante des composants principaux (DAPC) exécutée dans le package poppr R [67].

Pour mesurer les rapports dN/dS, nous avons aligné les séquences de nucléotides MSDIN à l'aide de MAFFT et construit des phylogénies avec IQ-TREE en utilisant les paramètres décrits ci-dessus. Les alignements de séquences ont été reformatés à l'aide de Pal2Nal [68]. Nous avons ensuite estimé un seul rapport dN/dS sur des phylogénies entières en utilisant PAML [69].

Notre pipeline bioinformatique de recherche de MSDIN et la validation manuelle ultérieure ont identifié 2940 séquences MSDIN à partir de 88 génomes d'A. phalloides (tableau S1) représentant 43 séquences d'acides aminés MSDIN uniques (telles que définies par la région centrale du MSDIN qui devient le peptide mature) (tableau S2 ). Treize des séquences MSDIN uniques sont nouvelles (Fig. 1; Tableau S2). Deux de ces nouvelles séquences (FLPPFLP et IWGKGCDP) ont été trouvées chez un seul individu et ne sont pas clairement associées à un locus spécifique ; nous avons exclu les deux des analyses ultérieures. En utilisant la correction de clone, nous avons regroupé des génomes identiques ou presque identiques en un seul point de données [45]. Dans l'ensemble de données corrigé par clone, nous avons identifié un total de 1308 séquences MSDIN chez 38 individus d'A. phalloides (Fig. 1). Le nombre de séquences MSDIN uniques trouvées chez ces 16 individus européens et 22 individus californiens variait de 25 à 32 avec une médiane de 29. Le pangénome MSDIN d'A. dans certains isolats seulement) MSDIN. Deux des MSDIN du génome accessoire ont été trouvés chez tous les individus sauf un (Fig. 1). Les génomes assemblés étaient complets à 94,1 % en moyenne, mais étaient fragmentés en une moyenne de 42 500 contigs (tableau S1). Le nombre de MSDIN trouvés n'était pas positivement corrélé à l'exhaustivité des génomes (Fig. S3).

Les 41 séquences MSDIN uniques ont été cartographiées sur 31 locus distincts. Chaque locus code un à trois allèles (Fig. 1). Trente de ces locus ont été trouvés dans le génome de référence (tableau S6). Nous avons nommé les loci en fonction de l'allèle présent dans l'assemblage du génome de référence (voir le texte noir au bas de la figure 1 ; méthodes supplémentaires). Trois MSDIN, IWGIGCDP (β-amanitine), AWLATCP (phalloïdine) et LIQRPFAP (non caractérisé), ont chacun été trouvés à deux locus distincts (dupliqués) dans le génome de référence. Cependant, les assembleurs de génome que nous avons utilisés regroupent généralement des allèles identiques en une seule séquence. En effet, même des allèles étroitement apparentés (mais différents, c'est-à-dire hétérozygotes) n'étaient parfois évidents qu'à partir des données SNP. Inversement, il est possible qu'une variation de séquence près des MSDIN dans les noyaux dicaryotes fasse apparaître deux séquences identiques du même locus dans les assemblages sous la forme de deux allèles distincts. Bien que nous ayons pu valider les duplications de IWGIGCDP, AWLATCP et LIQRPFAP dans le génome de référence de haute qualité (voir Méthodes supplémentaires), il n'a pas été possible de valider les duplications d'autres MSDIN dans d'autres génomes. Pour ces raisons, nous avons choisi une approche conservatrice et avons regroupé ces trois locus dupliqués, en soulignant que la présence de plus d'une copie d'un allèle dans un assemblage (c'est-à-dire le "nombre" d'une séquence spécifique) suggère une duplication non résolue ( Fig. 1).

De plus, les loci FFPIVFSPP et FIFPPFFIPP sont physiquement très proches et semblent souvent coder les mêmes allèles, ce qui soulève des inquiétudes quant à la cartographie non spécifique des données. Un alignement non spécifique des lectures de AFPHFYVPP a parfois été observé lors de l'alignement sur le génome de référence, car dans le génome de référence, ce locus est manquant (voir Méthodes supplémentaires). De même, une duplication du locus SFFFPIP non présent dans la référence a soulevé des inquiétudes quant à notre capacité à résoudre les séquences SFFFPIP (voir les isolats avec un nombre de trois allèles, Fig. 1). Pour éviter les erreurs d'interprétation associées à ces duplications présumées non résolues, nous n'avons pas inclus FFPIVFSPP, FIFPPFFIPP, AFPHFYVPP ou SFFFPIP dans les analyses ultérieures. Alors que nos résultats commencent à démêler la structure du locus des MSDIN, des technologies émergentes à lecture longue seront nécessaires pour résoudre complètement ces séquences étroitement liées.

Les collections californiennes et européennes sont génétiquement distinctes, ce qui suggère qu'aucun site européen échantillonné ici n'est la source des capsules mortelles envahissantes que nous avons échantillonnées en Californie (Fig. S4). Pour clarifier si les différences dans les fréquences des allèles du génome accessoire entre les spécimens natifs et invasifs reflètent des histoires évolutives différentes, nous avons utilisé AMOVA pour tester la partition significative de la variance génétique au niveau des locus MSDIN. La fréquence des allèles MSDIN était significativement différenciée dans tous les loci (p = 0, 001, ΦPT = 0, 31). Les comparaisons individuelles ont identifié quatre loci significativement différenciés (p < 0,005 après correction par comparaison multiple), chacun ayant un ΦPT > 0,24 (Fig. 1). Les séquences centrales IFLVFPIPP, LPILPIPPLP, GVILIIP, GFFPPFFFPP et FFLIVFFPP ne se trouvent que dans les spécimens européens. Conformément aux effets fondateurs potentiels dans la population californienne invasive, aucune séquence MSDIN n'est unique à la Californie. Cependant, certains allèles se trouvent plus fréquemment en Californie, par exemple l'allèle IVGILGLP du locus IIGILLPP est l'allèle dominant en Californie mais est relativement rare parmi les spécimens européens (voir graphique à barres en haut de la Fig. 1). Il est peu probable que l'Europe soit une seule population panmictique [21], et davantage de collections sont nécessaires pour clarifier comment les fréquences d'allèles MSDIN dans la gamme invasive ont changé par rapport à la ou les populations sources actuellement inconnues en Europe.

Les peptides MSDIN sont notoires en raison de l'extrême toxicité de quelques peptides courants et/ou de leurs dérivés. Les toxines mortelles comprennent l'α-amanitine (IWGIGCNP), la β-amanitine (IWGIGCDP), la phalloïdine (AWLATCP) et la phallacidine (AWLVDCP) [33]. Les gènes codant pour ces peptides sont des constituants hautement conservés du pangénome (Fig. 1). Les profils LC – MS / MS de six extraits démontrent clairement que chacun des champignons correspondants avait synthétisé de l'α-amanitine, de la phalloïdine et de la phallacidine, bien que les quantités relatives différaient d'un échantillon à l'autre (Fig. S5). On ne sait pas si les différences génétiques entre les champignons ont un impact sur la variation de la production de toxines, mais les variables écologiques et développementales contribuent aux quantités de toxines trouvées dans les sporocarpes (revues par Walton et al. [33]). Un produit MSDIN chimiquement non décrit, le cycloamanide G (GFFPPFFFPP), a également été identifié dans les extraits du champignon 5mAP échantillonné en Italie (Fig. S6). Cette séquence correspondait exactement à un gène accessoire nouvellement identifié (Fig. 1). Pour des raisons de simplicité et de cohérence avec les travaux antérieurs [33], nous appelons tous les composés MSDIN ayant une biogenèse commune des "cycloamanides", même si les modifications post-traductionnelles placent parfois les produits MSDIN matures dans différentes classifications chimiques.

Les comparaisons des MSDIN entre les genres et au sein d'A. phalloides révèlent que les gènes de la toxine sont en cours de sélection. Une forte sélection purificatrice agissant sur la séquence centrale de l'α-amanitine est évidente dans les comparaisons entre les genres (Fig. 2). Au sein d'A. phalloides, des régions leader et suiveuses hautement conservées suggèrent également une sélection purificatrice, tandis que des régions centrales très variables peuvent refléter une sélection diversifiée (Fig. 2). Nous ne pouvons pas exclure une évolution neutre comme moteur de diversification dans la région centrale du MSDIN car ses sites informatifs étaient saturés dans tous les alignements. Nous n'avons pas testé la sélection agissant sur les séquences centrales MSDIN individuelles au sein d'A. phalloides car les rapports dN/dS ne sont pas monotones de manière fiable au sein des espèces (examiné par [70]). La sélection peut également être déduite des mesures au niveau de la population du spectre de fréquence du site. Cependant, notre stratégie d'échantillonnage s'est concentrée sur la contextualisation de la diversité d'une seule population californienne dans l'étendue de la diversité européenne. En raison des différences d'échantillonnage entre la Californie et l'Europe, nous hésitons à interpréter les estimations du D de Tajima associées à des loci MSDIN spécifiques relevant de fenêtres individuelles de 500 pb (bien que nous présentions ces valeurs dans les résultats supplémentaires et la figure S7). De futures études spécifiquement conçues pour aborder les modèles de sélection sont nécessaires pour offrir des preuves solides des tendances que nous identifions à des locus individuels. Les modèles à l'échelle du génome dans la distribution de toutes les fenêtres glissantes montrent un changement positif dans la distribution du D de Tajima dans la population californienne. Le changement peut indiquer la perte d'allèles rares après un événement fondateur et suggérer qu'il n'y a pas eu assez de temps pour que la croissance démographique récupère les allèles rares. Une médiane proche de zéro du D de Tajima à partir d'échantillons européens est cohérente avec l'équilibre génétique. La distribution des mesures D de Tajima à l'échelle du génome (Fig. S7) soutient l'histoire naturelle d'une population californienne introduite et d'une population européenne indigène, bien que les influences liées à l'échantillonnage et démographiques ne puissent pas être entièrement exclues (par exemple, un échantillonnage inégal dans une structure de population non réalisée peut entraîner des changements positifs dans le D de Tajima - une explication que nous trouvons peu probable pour notre échantillonnage géographiquement limité en Californie ; Fig. S7, Résultats supplémentaires) [21].

Des lettres plus grandes dans le logo de la séquence correspondent à une plus grande fréquence du résidu d'acide aminé spécifique sur un site donné. Nous avons déduit la sélection agissant sur les parties leader, centrale et suiveuse des MSDIN et sur des séquences entières à l'aide des rapports dN/dS (affichés au-dessus des logos) tels que calculés dans PAML. Nous n'avons pas été en mesure de mesurer la sélection agissant sur les séquences centrales d'A. phalloides (en bas, au milieu) car les sites informatifs sont saturés dans cette région très diversifiée.

Les séquences MSDIN possèdent un très faible nombre de codons efficaces par rapport aux autres gènes du génome de référence d'A. phalloides (Fig. S8), et une hypothèse suggère que la sélection agissant sur les gènes MSDIN a optimisé les codons MSDIN [71]. Cependant, les schémas des gènes MSDIN ne reflètent pas systématiquement les schémas de biais des codons à l'échelle du génome (Fig. S8) et nous suggérons qu'il pourrait y avoir d'autres explications. L'utilisation différentielle des codons peut permettre la corégulation des gènes [72] et peut contribuer à la diversité des séquences d'acides aminés résultantes en augmentant les taux de mutation [73]. Cette dernière fonction a été suggérée pour les peptides cycliques de venins d'escargots coniques [74]. Des travaux supplémentaires sont nécessaires pour clarifier l'importance de l'utilisation des codons dans les séquences MSDIN.

Pour documenter la distribution physique des MSDIN résultant de l'expansion de la famille de gènes MSDIN chez Amanita spp. nous avons d'abord utilisé des fenêtres de 100 ko pour scanner le génome de référence d'A. phalloides. Nous avons identifié deux fenêtres contenant chacune deux lieux MSDIN, trois fenêtres contenant trois lieux chacune et deux fenêtres contenant six lieux chacune (tableau S6). Dans l'ensemble, les locus MSDIN sont physiquement regroupés (expression binomiale, p <0, 000001). Nous avons comparé la distance moyenne observée entre les loci MSDIN à une distribution randomisée et les loci MSDIN confirmés sont significativement plus proches les uns des autres que ce qui peut être expliqué par le hasard (p <0, 001) (Fig. 3). De plus, les séquences MSDIN codées à des locus physiquement regroupés sont plus étroitement liées les unes aux autres qu'aux séquences à des locus plus éloignés, c'est-à-dire que nous trouvons une corrélation significative entre les distances génétiques et physiques en utilisant à la fois des séquences codantes complètes (p < 0,001 r = 0,6) et les séquences d'intron seules (p = 0,002, r = 0,49) (Fig. 3).

un arbre de vraisemblance maximale illustrant les relations génétiques entre les séquences centrales MSDIN de quatre genres telles que déterminées à partir de séquences complètes, y compris l'intron. L'arbre est enraciné au champignon précocement divergent, Clavaria fumosa, pour refléter les relations connues entre les espèces. Les valeurs de prise en charge du bootstrap sont incluses pour un sous-ensemble de nœuds afin de souligner que les topologies au sein du clade contenant Amanita spp. Les MSDIN ne sont pas entièrement résolus. Certaines Amanites spp. ont été omis pour plus de lisibilité. Un ensemble complet de valeurs bootstrap pour les MSDIN de toutes les espèces est présenté à la Fig. S9. Les pointes sont codées par couleur pour correspondre à b Exemple d'une seule région codant plusieurs loci MSDIN qui sont colocalisés dans les génomes A. phalloides et A. subjunquillea. c L'analyse de permutation des distances physiques entre les locus MSDIN chez A. phalloides indique que la distance observée entre les MSDIN (rouge) est significativement inférieure à une distribution nulle (bleu) (p < 0,001 comme indiqué par la ligne pointillée). d Les distances génétiques par rapport à l'ensemble des séquences codant pour le MSDIN (à gauche) ou à l'intron (à droite) sont significativement corrélées aux distances physiques (pour le test de corrélation p < 0,001 r = 0,6, p = 0,002, r = 0,49, respectivement ; pour les lignes les mieux ajustées R2 = 0,414 et R2 = 0,349, respectivement).

Les locus MSDIN d'autres espèces sont également regroupés physiquement. Chez Lepiota venenata, deux nouvelles séquences MSDIN (voir ci-dessous) sont situées à moins de 5 kb l'une de l'autre. Cinq contigs dans A. bisporigera encodaient chacun deux loci MSDIN ou plus dans un rayon de 15 kb, bien que notre capacité à cartographier les loci MSDIN dans ce génome ait été entravée par une fragmentation de séquence étendue. Dans le génome de haute qualité d'Amanita subjunquillea, nous avons identifié quatre régions génomiques avec des loci physiquement regroupés, dont une région codant pour cinq MSDIN dans un rayon d'environ 13 kb. L'alignement des assemblages A. subjunquillea et A. phalloides a révélé que cette région est orthologue à une région d'environ 25 kb dans le génome de référence A. phalloides codant pour six locus MSDIN (Fig. 3). Dans cette région, le locus IRLPPLFLPP de la référence A. phalloides est absent du génome d'A. subjunquillea. Au moins un des deux allèles de ce locus est présent dans tous les isolats d'A. phalloides (Fig. 1). Qu'il y ait une variation intraspécifique de la présence de ce locus chez A. subjunquillea, s'il a été perdu chez A. subjunquillea, ou s'il a évolué chez A. phalloides après la divergence de ces deux lignées, restent des questions ouvertes.

L'analyse phylogénétique des séquences MSDIN d'Amanita spp. et Lepiota suggère une histoire évolutive dynamique. Alors que les séquences codantes peuvent être sujettes à sélection, les séquences d'intron MSDIN sont trop courtes (52-58 bp) pour donner une résolution phylogénétique fiable, nous avons donc choisi d'utiliser des séquences de bout en bout comprenant à la fois des séquences codantes et des introns. Dans cette phylogénie, les MSDIN de différents genres ont formé des groupes discrets (Figs. 3 et S9), suggérant que des expansions de familles de gènes se sont produites indépendamment dans chaque genre. Les séquences groupées d'α-amanitine de L. venenata et G. marginata sont la seule exception au modèle général.

Les génomes de tous les champignons producteurs de MSDIN connus codent pour deux enzymes prolyl oligopeptidase (POP). Le premier gène, POPA, peut être largement distribué parmi les Agaricales et on pense qu'il fonctionne comme un gène de ménage protéolytique (une hypothèse suggérée par Walton [33]). Cependant, les prolyl oligopeptidases trouvées chez Agaricales spp. peut ne pas être orthologue [37]. Le deuxième gène, POPB, n'a été trouvé auparavant que chez les espèces productrices de MSDIN, où il est nécessaire à la maturation de la pro-protéine MSDIN. Nous avons confirmé les orthologues POPB dans tous les génomes disponibles des espèces productrices de MSDIN précédemment identifiées (Fig. 4). Nous avons également identifié un orthologue POPB dans le génome d'Amanita polypyramis (Fig. 4), la première fois qu'un gène POPB a été trouvé dans le genre Amanita mais en dehors du clade monophylétique des "Amanitas mortelles" [33]. De plus, nous avons découvert un gène POPB chez Clavaria fumosa, un champignon Agaricales à divergence précoce. L'analyse phylogénétique a confirmé l'identité de POPA et de POPB chez toutes les espèces où ils ont été trouvés (Fig. S2). Nos analyses révèlent également que certaines espèces ont des ensembles étendus de gènes POP, dont certains sont étroitement liés à POPB (Fig. S2), suggérant l'expansion de la famille des gènes POP comme une autre cible pour les recherches futures. Une petite sous-clade à divergence précoce au sein du plus grand clade POPB contient une seule séquence Amanita brunnescens (Fig. S2). Toutes les autres espèces avec des représentants dans cette sous-clade ont des séquences POPB supplémentaires nichant à l'intérieur du plus grand clade POPB (par exemple, A. phalloides a deux séquences POPB putatives), soulevant des questions sur la fonctionnalité de ces gènes. Des travaux supplémentaires sont nécessaires pour clarifier les fonctions potentielles et l'évolution des gènes POP dans les génomes sans séquences MSDIN.

a Un graphique UpSet illustrant le chevauchement des séquences principales du MSDIN entre les espèces sur la base de nos analyses et des résultats publiés précédemment (tableaux S2 et S4). La taille de l'ensemble reflète le nombre total de séquences centrales MSDIN uniques signalées pour tous les génomes d'une espèce ; les différences dans cette métrique doivent être interprétées avec prudence car les espèces peuvent différer en nombre de génomes disponibles. La taille de l'intersection représente les MSDIN présents dans les espèces marquées d'un ou plusieurs cercles noirs pleins sous chaque colonne (par exemple, Amanita bisporigera a 26 MSDIN non trouvés dans d'autres espèces ; le MSDIN IWGIGCNP (α-amanitin) se trouve dans toutes les espèces sauf Clavaria fumosa et Amanita polypyramis). Les MSDIN identifiés à partir d'études publiées n'ont pas été revalidés. b Relations phylogénétiques des espèces productrices de MSDIN à travers les Agaricales déterminées à partir du consensus de 289 arbres à probabilité maximale de séquences protéiques d'orthologues à copie unique (c'est-à-dire BUSCO). Les longueurs des branches terminales ne sont pas calculées. Tous les nœuds séparant les espèces ont des probabilités postérieures supérieures à 0,93. La présence de l'enzyme de traitement associée à MSDIN, POPB, et le nombre de séquences MSDIN sont représentés dans les anneaux intérieur et extérieur (respectivement). Alors que nous avons recherché 249 génomes pour les MSDIN (tableau S3), l'arbre ne comprend que les familles taxonomiques avec des espèces ayant au moins un MSDIN et un POPB. Les génomes contenant à la fois les gènes MSDIN et POPB sont mis en évidence par une étoile, où la taille de l'étoile reflète également le nombre total de MSDIN trouvé dans chaque espèce. † Ces séquences MSDIN sont associées à des produits matures avec une bioactivité caractérisée comme des toxines. De gauche à droite : phalloïdine (AWLATCP), phallacidine (AWLVDCP), β-amanitine (IWGIGCDP) et α-amanitine (IWGIGCNP). * Le génome d'Amanita brunnescens, une espèce sans MSDIN, code pour une séquence trouvée dans une petite sous-clade POPB à divergence précoce (Fig. S2). Plus de travail est nécessaire pour clarifier si ce gène est fonctionnel.

Conformément à notre découverte des gènes POPB, les génomes d'A. polypyramis et de C. fumosa codent chacun pour un seul MSDIN précédemment non identifié (MSDINATRLP FLPPILP HYAPDDVNYTMLSDSLC et MFDTNDTRVP NWAGFFGWP CSPDTAGDTLNRGKDLC, respectivement) (Fig. 4). Nous considérons l'identification d'un second MSDIN putatif dans le génome d'A. polypyramis (MSNVNATRIP GPRPLAFP FFGDEENNALNCGESLC) comme non concluante en raison d'une séquence de faible qualité dans sa région centrale et suiveuse. Bien que ces deux génomes semblent manquer du gène canonique de l'α-amanitine, son absence apparente peut être causée par des assemblages génomiques incomplets.

Le gène α-amanitine a été signalé comme le seul MSDIN chez L. venenata [40], mais dans son livre, Walton [33] a signalé six gènes MSDIN chez Lepiota subincarnata. Nous avons identifié deux séquences MSDIN supplémentaires (MSDANNTRLP FFVPGLPFPP WTGENADHILARSKDLC et MSDANNTRLP FFAPGLPFPP WTGENADHILARSKDLC) dans le génome de L. venenata publié [40] (Fig. 4), en plus du gène α-amanitine (MDANATRLP IWGIGCNP WTPESVNDTLTKDLS). Ces séquences ont également été identifiées par Luo et al. [38], et en analysant correctement les introns, nos résultats ont résolu les séquences suiveuses. Une quatrième séquence MSDIN (MSDLNNTRLP VVTVLFTPPP WSGESVDHSLTRSKDLC) située à moins de 2 kb de ces séquences n'a été trouvée qu'en augmentant le paramètre de plage d'intron possible de nos scripts de 30 pb. Il n'est pas clair si la longue longueur d'intron de ce MSDIN est biologiquement pertinente ou si ce résultat reflète une erreur de séquençage, car il existe un tronçon d'environ 30 pb de séquence de faible qualité dans les données de séquence correspondantes. Notre découverte souligne l'utilité de notre pipeline automatisé de recherche de MSDIN. Il peut à la fois identifier les MSDIN à grande échelle et reconnaître des séquences jusque-là ignorées.

L'évolution dynamique des gènes de toxine parmi les capsules mortelles en Californie et en Europe suggère que la toxicité et la présence ou l'absence de MSDIN ne sont pas neutres : différents individus possèdent différentes suites de gènes, les gènes entraînent des phénotypes mesurables et au moins certaines séquences (y compris la séquence codant le paradigmatique MSDIN α-amanitine) connaissent une forte sélection naturelle. Les extensions de gamme en cours [75] soulignent un besoin critique de comprendre le rôle écologique des toxines produites par le champignon dans les habitats indigènes et envahis. Notre pipeline bioinformatique de recherche de MSDIN élucide les modèles non seulement au sein d'A. phalloides, mais également à travers les Agaricales, créant une base solide pour les expériences futures, y compris les tests des hypothèses de "libération d'ennemis" [76] et de nouvelles armes [31] .

Des peptides cycliques et des composés structurellement analogues similaires aux toxines présentes dans les capsules mortuaires sont présents dans les venins de plusieurs espèces animales, notamment les escargots coniques, les serpents et les araignées [33], un exemple frappant d'évolution convergente. Chez les animaux, la diversification du venin est souvent attribuée aux pressions sélectives imposées par les sensibilités différentielles de diverses proies à des toxines spécifiques [77, 78], et le nombre de constituants du venin est associé à l'étendue de l'alimentation [79]. Nos données suggèrent une dynamique similaire pour les pressions sélectives agissant sur les gènes MSDIN (Fig. 2). Alors que les régions leader et suiveuse de la famille de gènes MSDIN d'A. phalloides sont soumises à une forte sélection purificatrice, les régions centrales se diversifient. Les régions centrales sont si diversifiées que nous n'avons pas pu aligner les séquences et clarifier si la diversité résulte d'une évolution neutre ou d'une sélection positive. Alors que les séquences centrales en tant que groupe sont diverses, certaines séquences centrales sont conservées à travers les genres (Fig. 4a), par exemple l'α-amanitine. Une forte sélection purificatrice agit clairement sur la séquence codant pour l'α-amanitine (Fig. 2). Les constituants accessoires du génome peuvent être maintenus par des pressions sélectives relativement rares ou réparties de manière incohérente, tandis que les constituants du noyau du génome peuvent refléter des pressions sélectives généralisées trouvées dans la gamme du plafond de la mort. On pense que les fréquences alléliques des gènes codant pour le venin chez les serpents sont adaptatives dans certaines populations, entraînant la diversification du venin en équilibrant la sélection entre les groupes [80]. Nous supposons que la sélection sur les MSDIN résulte de l'interaction entre des produits géniques spécifiques (c'est-à-dire la redondance, la synergie et la densité-dépendance) et l'adaptation aux conditions écologiques locales (par exemple, les populations de fongivores). Cependant, alors que le génome central du MSDIN comprend la plupart des toxines MSDIN notoires, la bioactivité de la plupart des MSDIN centraux et accessoires reste inconnue ; un sous-ensemble de MSDIN peut n'avoir aucune fonction écologique [81]. Tant que la fonction des MSDIN dans la nature ne sera pas définie, une compréhension holistique de leur évolution restera hors de portée.

L'histoire évolutive des MSDIN parmi les champignons Agaricales (Fig. 3 et 4) offre également des parallèles frappants avec l'évolution des noueux, un groupe de composés de type cycloamanide dans les venins d'araignées. On pense qu'un ancêtre commun noueux a subi plusieurs événements de diversification indépendants parmi les espèces d'araignées [82]. De même, le regroupement distinct des séquences MSDIN de différents genres (mais nous notons l'exception des séquences α-amanitine de L. venenata et G. marginata) suggère que la diversification MSDIN s'est produite indépendamment chez Lepiota et Amanita (Fig. 3). La duplication de gènes et la sélection positive subséquente ont été suggérées pour la diversification des noueux [83]. Les gènes MSDIN étroitement liés sont physiquement proches les uns des autres dans les génomes (Fig. 3), ce qui suggère une duplication et une divergence ultérieure comme mécanisme entraînant la génération de nouveaux gènes chez l'Amanite également [84]. L'ancêtre commun du noueux est supposé avoir eu une liaison disulfure conférant une bioactivité puissante [82]. De même, la puissance de l'α-amanitine est attribuée à une liaison tryptathionine entre la cystéine et le tryptophane ; L'α-amanitine est suggérée comme ancestrale de toutes les séquences MSDIN connues [33]. Dans les noueux comme dans les MSDIN, les ponts chimiques ne sont pas présents chez tous les descendants des toxines ancestrales. Nos résultats mettent en évidence les parallèles remarquables entre les champignons et les animaux, illustrant des trajectoires communes dans les histoires évolutives de composés évolués de manière convergente mais structurellement similaires.

Walton (2018) suggère la distribution discontinue des gènes MSDIN à travers Agaricales spp. (Fig. 4) est le résultat d'un transfert horizontal de gènes (HGT), car l'hypothèse alternative d'une perte étendue de gènes est difficile à concilier avec les fortes bioactivités des gènes. Parmi Amanita spp., les gènes MSDIN n'ont été décrits que dans le clade monophylétique de l'Amanite létale [85]. Notre découverte d'un gène POPB et d'un gène MSDIN dans le génome d'A. polypyramis (une espèce en dehors du clade mortel d'Amanita) repousse considérablement le moment auquel les MSDIN ont été transférés à Amanita, ce qui nécessite une inférence supplémentaire de la perte de gène (ou une inférence incomplète). tri de la lignée), ou suggère la présence d'un HGT supplémentaire entre A. polypyramis et un autre organisme. Le MSDIN d'A. polypyramis niche dans le clade Amanita des séquences MSDIN (Fig. 3), ce qui suggère que cette séquence a peut-être évolué quelque temps après le début de l'expansion de la famille des gènes mortels d'Amanita. Le regroupement du MSDIN d'A. polypyramis avec d'autres MSDIN d'Amanita est phylogénétiquement incompatible avec l'histoire évolutive du genre (Fig. 3 et 4), indiquant un événement HGT au sein d'Amanita, bien que nous mettions l'accent sur les valeurs de support bootstrap pour sa position et le de courtes séquences sous-jacentes à la phylogénie laissent ouverte la possibilité que de véritables relations entre ces MSDIN soient conformes à la transmission verticale. Les relations phylogénétiques déduites de la séquence plus longue de la protéine POPB sont compatibles avec la transmission verticale et horizontale au sein du genre, car un transfert vers A. polypyramis aurait pu se produire avant la spéciation du clade mortel de l'amanite (Fig. S2). Les relations phylogénétiques des gènes MSDIN et POPB trouvés chez C. fumosa sont phylogénétiquement compatibles avec notre arbre d'espèces, ce qui suggère que les gènes pourraient avoir des origines plus anciennes qu'on ne le pensait auparavant (Fig. S2). Plus de données sont nécessaires pour clarifier les questions que nos résultats soulèvent sur les histoires évolutives des gènes MSDIN et POP.

Les cycles de vie complexes, la ploïdie et les difficultés techniques associées à la culture et à la manipulation des basidiomycètes en laboratoire ont ralenti le développement d'outils pour identifier les SM des basidiomycètes, empêchant une expérimentation ciblée. Une étude récente du royaume fongique met l'accent sur Basidiomycota en tant que phylum abritant un ensemble unique de composés de type médicamenteux sous-étudiés [86]. Notre pipeline bioinformatique de recherche de MSDIN permet la prospection de médicaments dans une classe auparavant inaccessible de SM spécifique aux basidiomycètes et offre une feuille de route pour le développement de pipelines similaires à l'avenir.

Les données de séquence pour tous les spécimens d'A. phalloides utilisés ici sont mises à disposition par Wang et al. [45]. Les données pour toutes les autres analyses sont déjà publiques et sont référencées de manière appropriée dans le texte avec des détails sur les numéros d'accession spécifiques disponibles dans les documents supplémentaires.

Les scripts associés à notre pipeline bioinformatique de recherche de MSDIN sont également disponibles dans les documents supplémentaires.

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Notre recherche a été rendue possible par le travail de pionnier du Dr Jonathan Walton (1953-2018), et nous lui dédions notre article. Nous sommes également reconnaissants du soutien du programme de formation postdoctorale en toxicologie moléculaire et environnementale de l'Université du Wisconsin à Madison (UW), financé par la subvention NIH T32 ES007015 (attribuée à MTD), des National Institutes of Health R01 2R01GM112739-05A1 à NPK et du Subvention Fulbright US Scholar à AP. Le séquençage génomique a été rendu possible grâce aux fonds d'une subvention RGP0053 du Human Frontier Science Program accordée à l'AP. Cette recherche a été réalisée à l'aide des ressources informatiques et de l'assistance du Centre de calcul à haut débit (CHTC) de l'Université du Wisconsin-Madison du Département d'informatique ; nous sommes particulièrement reconnaissants du soutien attentionné et patient de Christina Koch. Nous sommes reconnaissants à Sarah Friedrich pour son œil attentif et son aide pour le rendu des figures. Le ou les auteurs ont utilisé l'installation de séquençage de l'ADN du Centre de biotechnologie de l'Université du Wisconsin-Madison (identifiant de ressource de recherche - RRID:SCR_017759) pour préparer et séquencer les bibliothèques d'ADN génomique. La mention de noms commerciaux ou de produits commerciaux dans cette publication est uniquement dans le but de fournir des informations spécifiques et n'implique pas de recommandation ou d'approbation par le Département américain de l'agriculture. L'USDA est un fournisseur et un employeur garantissant l'égalité des chances.

Milton T.King

Adresse actuelle : USDA-ARS Cereal Disease Laboratory, St. Paul, MN, États-Unis

Département de microbiologie médicale et d'immunologie, Département de bactériologie, Université du Wisconsin, Madison, WI, États-Unis

Milton T. Drott, Sung Chul Park et Nancy P. Keller

Départements de botanique et de bactériologie, Université du Wisconsin, Madison, WI, États-Unis

Yen-wen Wang, Lynn Harrow et Anne Pringle

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Conceptualisation : MTD, AP. Expérimentation : MTD, SCP, YW. Analyse des données : MTD, SCP. Le financement a été obtenu par AP, MTD et NPK. MTD a écrit le manuscrit avec des révisions de l'AP et des contributions de SCP, YW, LH et NPK. Tous les auteurs ont lu et approuvé la version finale du manuscrit.

Correspondance à Milton T. Drott, Nancy P. Keller ou Anne Pringle.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

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Réimpressions et autorisations

Drott, MT, Park, SC, Wang, Yw. et coll. La pangénomique du champignon Amanita phalloides et des Agaricales révèle une évolution dynamique des gènes de la toxine dans une gamme invasive. ISME J (2023). https://doi.org/10.1038/s41396-023-01432-x

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Reçu : 10 décembre 2022

Révisé : 01 mai 2023

Accepté : 04 mai 2023

Publié: 23 mai 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s41396-023-01432-x

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