L'évolution de la résistance à la chloroquine chez Plasmodium falciparum est médiée par le transporteur putatif d'acides aminés AAT1

Nature Microbiology (2023)Citer cet article

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Les parasites du paludisme décomposent l'hémoglobine de l'hôte en peptides et en acides aminés dans la vacuole digestive pour l'exporter vers le cytoplasme du parasite pour sa croissance : l'interruption de ce processus est au cœur du mode d'action de plusieurs médicaments antipaludiques. Des mutations dans le transporteur de résistance à la chloroquine (CQ), pfcrt, situé dans la membrane de la vacuole digestive, confèrent une résistance à la CQ chez Plasmodium falciparum et affectent généralement également la condition physique du parasite. Cependant, le rôle des autres loci du parasite dans l'évolution de la résistance à la CQ n'est pas clair. Ici, nous utilisons une combinaison de génomique des populations, de croisements génétiques et d'édition de gènes pour démontrer qu'un deuxième transporteur vacuolaire joue un rôle clé dans la résistance et l'évolution compensatoire. Des analyses génomiques longitudinales des parasites gambiens ont révélé des signatures temporelles de sélection sur un variant putatif de transporteur d'acides aminés (pfaat1) S258L, dont la fréquence est passée de 0% à 97% entre 1984 et 2014 en parallèle avec le variant pfcrt1 K76T. Des croisements génétiques parasitaires ont ensuite identifié un locus de trait quantitatif du chromosome 6 contenant pfaat1 qui est sélectionné par traitement CQ. L'édition de gènes a démontré que pfaat1 S258L potentialise la résistance à la CQ mais au prix d'une remise en forme réduite, tandis que pfaat1 F313S, un polymorphisme courant en Asie du Sud-Est, réduit la résistance à la CQ tout en restaurant la remise en forme. Nos analyses révèlent une complexité cachée dans l'évolution de la résistance à la CQ, suggérant que pfaat1 pourrait sous-tendre les différences régionales dans la dynamique de l'évolution de la résistance et moduler la résistance ou la forme physique des parasites en manipulant l'équilibre entre le transport des acides aminés et celui des médicaments.

La résistance aux médicaments chez les agents pathogènes microbiens complique les efforts de contrôle. Par conséquent, la compréhension de l'architecture génétique et de la complexité de l'évolution de la résistance est essentielle pour la surveillance de la résistance et le développement de stratégies de traitement améliorées. Dans le cas des parasites du paludisme, le déploiement de cinq classes de médicaments antipaludiques au cours du dernier demi-siècle a entraîné des balayages sélectifs durs et doux bien caractérisés associés à la résistance aux médicaments, avec à la fois une diffusion mondiale et des origines locales de la résistance entraînant des allèles de résistance aux médicaments dans la gamme de Plasmodium falciparum1,2,3. La monothérapie à la chloroquine (CQ) a joué un rôle central dans un plan ambitieux d'éradication du paludisme au siècle dernier. La résistance à la CQ a été observée pour la première fois en 1957 en Asie du Sud-Est (SEA), puis est arrivée et s'est propagée à travers l'Afrique à partir de la fin des années 1970, contribuant à la fin de cet ambitieux effort mondial d'éradication4.

La résistance à la CQ a été étudiée de manière intensive. Le gène du transporteur de résistance CQ (pfcrt, chromosome (chr.) 7) a été identifié à l'origine à l'aide d'un croisement génétique de P. falciparum réalisé entre un parasite SEA résistant à la CQ et un parasite sud-américain sensible à la CQ généré chez un hôte chimpanzé5,6. Vingt ans de recherches intensives ont révélé le rôle mécaniste du transporteur de résistance à la chloroquine (pfCRT) dans la résistance aux médicaments7,8, sa localisation dans la membrane de la vacuole digestive et sa fonction naturelle de transport de courts peptides de la vacuole digestive vers le cytoplasme9. La CQ tue les parasites en interférant avec la digestion de l'hémoglobine dans la vacuole digestive, empêchant la conversion de l'hème, un sous-produit toxique de la digestion de l'hémoglobine, en cristaux d'hémozoïne inertes. Les parasites porteurs de mutations de résistance à la CQ au pfCRT transportent la CQ hors de la vacuole alimentaire, loin du site d'action du médicament7,8. Le polymorphisme mononucléotidique (SNP) pfcrt K76T est largement utilisé comme marqueur moléculaire de la résistance à la CQ10, tandis que des variantes supplémentaires au sein de pfcrt modulent les niveaux de résistance à la CQ11 et à d'autres médicaments à base de quinoléine12 et déterminent les coûts de remise en forme associés13. Alors qu'il a été démontré que des mutations dans un deuxième transporteur situé dans la membrane de la vacuole alimentaire, le transporteur de résistance multidrogue (pfmdr1), modulent la résistance à la CQ dans certains contextes génétiques14, le rôle d'autres gènes dans l'évolution de la résistance à la CQ reste incertain. Dans cet article, nous avons cherché à comprendre la contribution de loci parasites supplémentaires à l'évolution de la résistance à la CQ en utilisant une combinaison de génomique des populations, de croisements génétiques expérimentaux et d'édition de gènes.

Les données génomiques longitudinales de la population peuvent fournir des preuves convaincantes de l'évolution des locus de résistance aux médicaments15. Nous avons effectué une analyse longitudinale de la séquence du génome entier de 600 génomes de P. falciparum collectés entre 1984 et 2014 en Gambie pour examiner les signatures de sélection sous pression médicamenteuse (tableau supplémentaire 1). Après filtration en utilisant le génotype manquant (<10%) et la fréquence des allèles mineurs (>2%), nous avons retenu 16 385 locus SNP bialléliques de 321 isolats (1984 (134), 1990 (13), 2001 (34), 2008 (75) et 2014 (65)). La mutation pfcrt K76T associée à la résistance à la CQ est passée de 0 % en 1984 à 88 % en 2014. Notamment, il y a également eu un changement rapide de la fréquence des allèles sur chr. 6 : la différenciation la plus forte est observée au niveau d'une mutation S258L dans un transporteur d'acides aminés putatif, pfaat1 (PF3D7_0629500, chr. 6), qui a augmenté au cours de la même période de 0 % à 97 % (Fig. 1a). En supposant un temps de génération (moustique à moustique) de 6 mois pour les parasites du paludisme, ces changements ont été entraînés par des coefficients de sélection de 0,18 pour pfaat1 S258L et de 0,11 pour pfcrt K76T (Extended Data Fig. 1). Les mutations pfaat1 S258L et pfcrt K76T étaient absentes dans 1984 échantillons, mais présentes en 1990, ce qui suggère qu'elles sont apparues et se sont propagées dans une courte fenêtre de temps. pfaat1 et pfcrt ont montré des structures d'haplotype temporelles similaires en Gambie (Extended Data Fig. 2). Celles-ci étaient caractérisées par un remplacement presque complet des haplotypes bien différenciés aux deux locus entre 1984 et 2014. Au cours de cette période, nous avons également observé des changements temporels majeurs dans un autre locus de résistance aux médicaments connu (pfdhfr) (chr. 4)16 (Fig. 1b). Le fait que ces changements rapides de la fréquence des allèles se produisent au niveau de pfcrt, pfaat1 et pfdhfr, mais pas ailleurs dans le génome (Fig. 1b), fournit une preuve sans ambiguïté d'une forte sélection directionnelle.

a, Changement de fréquence des allèles temporels au niveau des SNP codant pour pfaat1 S258L et pfcrt K76T entre 1984 et 2014. La carte et la région élargie de l'Afrique de l'Ouest montrent l'emplacement de la Gambie. b, Signification de la différenciation des haplotypes dans les populations temporelles de parasites P. falciparum déterminée à l'aide de hapFLK. Les valeurs P ont été corrigées pour les tests multiples en utilisant la méthode BH. Les seuils de signification à -log10 (valeur P corrigée du taux de fausses découvertes (FDR)) de 5 sont indiqués par des lignes horizontales pointillées rouges. Les régions situées dans les 1 % supérieurs des valeurs P corrigées par FDR sont marquées par des symboles de gène. Les signaux les plus forts observés à l'échelle du génome se situent autour de pfcrt, pfaat1 et pfdhfr (qui est impliqué dans la résistance à la pyriméthamine). c, IBD, quantifié avec la statistique isoRelate (iR), pour les populations temporelles échantillonnées en Gambie. Les valeurs P ont été corrigées pour les tests multiples en utilisant la méthode BH. Les seuils de signification à -log10 (valeur P corrigée par FDR) de 5 sont indiqués par des lignes horizontales pointillées rouges. Les régions situées dans les 1 % supérieurs des valeurs P corrigées par FDR sont marquées par des symboles de gène. Des pics constamment élevés d'IBD autour de pfcrt et pfaat1 sont observés pour les populations de parasites au cours de toutes les années d'échantillonnage. L'échantillon de 1990 (n = 13) n'est pas représenté en c.

Données source

Une autre preuve d'une forte sélection sur pfaat1 et pfcrt est venue de l'analyse de l'identité par descendance (IBD) dans les génomes des parasites gambiens. Nous avons vu les signaux les plus forts d'IBD dans le génome autour de pfaat1 et pfcrt (Fig. 1c). Ces signaux sont dramatiques, car il y a une MII minimale ailleurs dans le génome, à l'exception d'un signal fort centré sur pfdhfr après 2008. Fait intéressant, la MII forte est observée dans les quatre échantillons temporels examinés, y compris 1984, avant la propagation de pfaat1 S258L ou pfcrt K76T. Cependant, une seule variante synonyme de pfaat1 (I552I) et aucune des variantes mutantes associées résistantes à la CQ dans pfcrt n'étaient présentes à ce moment-là. Le CQ était le traitement de première ligne en Afrique depuis les années 1950. Ces résultats sont cohérents avec la possibilité de balayages sélectifs axés sur la CQ conférant une résistance à la CQ de bas niveau avant 1984, ciblant peut-être des régions promotrices de gènes associés à la résistance. pfaat1 a également été sélectionné dans d'autres sites mondiaux : cela ressort des analyses génomiques de population antérieures d'Afrique17, SEA18 et d'Amérique du Sud (SM)19. Des tracés résumant les MII dans ces régions sont fournis dans les données étendues Fig. 3.

Les modèles de déséquilibre de liaison (LD) fournissent une preuve supplémentaire de la liaison fonctionnelle entre pfcrt et pfaat1. Le signal le plus fort à l'échelle du génome de LD interchromosomique a été trouvé entre ces deux loci à la fois dans nos données gambiennes (Fig. 1 supplémentaire) et dans des échantillons de toute l'Afrique20. La LD entre pfaat1 et pfcrt était la plus forte en 2001, puis a diminué en 2008 et 2014 (Figs. 1 et 2 supplémentaires), conformément au maintien de la LD lors d'une utilisation intensive de CQ, et la dégradation ultérieure de la LD après que la monothérapie CQ a été remplacée par des combinaisons sulfadoxine-pyriméthamine + CQ en 2004, puis avec des combinaisons d'artémisinine en 2008 (réf. 16 ).

Des corrélations dans les fréquences alléliques sont attendues entre pfcrt et pfaat1 si ces locus interagissent ou sont co-sélectionnés. Les fréquences de l'haplotype CVIET pour les acides aminés 72 à 76 dans le pfCRT sont significativement corrélées aux fréquences alléliques de pfaat1 S258L en Afrique de l'Ouest (WAF) (R2 = 0,65, P = 0,0017) et dans toutes les populations africaines (R2 = 0,44, P = 0,0021) (Extended Data Fig. 4). Cette analyse renforce encore l'argument de la co-évolution ou épistasie entre ces deux gènes.

Nous avons examiné la structure haplotype de pfaat1 à partir des génomes de P. falciparum (MalariaGEN version 6 (réf. 21)) (Fig. 2 et tableau supplémentaire 2). Le SNP pfaat1 S258L est à haute fréquence dans SEA (58%) mais se trouve sur des haplotypes flanquants divergents suggérant une origine indépendante du pfaat1 S258L en Gambie et ailleurs en Afrique (Fig. 2c, d et Extended Data Fig. 5). Hendon et al.18 sont arrivés à la même conclusion pour le chr. 6 région à l'aide d'une analyse IBD des parasites provenant d'emplacements mondiaux. L'évolution convergente de pfaat1 S258L fournit une preuve supplémentaire de la sélection et contraste avec pfcrt et pfdhfr, où les allèles de résistance qui se sont propagés en Afrique avaient une origine asiatique1,2. L'évolution de pfaat1 est plus complexe en SEA qu'ailleurs dans le monde. Il existe trois changements d'acides aminés dérivés communs supplémentaires dans SEA. pfaat1 F313S s'est propagé près de la fixation dans SEA (total 96 %, FST = 0,91 par rapport aux échantillons africains) associé à pfaat1 S258L (55 %), Q454E (15 %) ou K541N (22 %). L'appariement de F313S avec trois mutations différentes suggère que F313S est apparu en premier. Nous supposons que ces haplotypes pfaat1 géographiquement localisés ont joué un rôle important dans l'évolution de la résistance à la CQ dans l'ASE et pourraient également refléter des différences géographiques dans l'utilisation historique d'autres médicaments à base de quinoléine (méfloquine, quinine, pipéraquine et luméfantrine) dans cette région22.

a, Distribution globale des allèles pfaat1. b, Cartes comparables montrant les pourcentages d'haplotypes pfcrt pour les acides aminés 72–76. Les segments colorés montrent les principaux haplotypes pfcrt variant au niveau de la mutation K76T. Nous avons utilisé l'ensemble de données de la version 6 de MalariaGEN pour l'analyse de la fréquence des allèles pfaat1 et pfcrt. Les données utilisées pour la figure sont contenues dans le tableau supplémentaire 2. Seuls les échantillons avec des infections monoclonales (N = 4 051) ont été inclus (1 233 d'Afrique de l'Ouest (WAF), 415 d'Afrique de l'Est (EAF), 170 d'Afrique centrale (CAF), 994 d'Asie du Sud-Est (ESEA), 998 d'Asie du Sud-Est occidental (WSEA), 37 d'Asie du Sud (SA), 37 d'Amérique du Sud (SM) et 167 de la région de l'océan Pacifique (PO) ). c, d, MSN des haplotypes colorés par l'allèle pfaat1 (c) et l'emplacement géographique (d), respectivement. Des réseaux ont été construits à partir de régions du génome de 50 kb centrées par pfaat1 (25 kb en amont et en aval. Cela couvre les régions du génome montrant LD autour de pfaat1 (Fig. 2 supplémentaire). Un total de 581 génomes avec la couverture de séquence la plus élevée ont été utilisés pour générer le réseau. Les réseaux ont été générés sur la base de 1 847 SNP (au moins un mutant dans l'ensemble de données complet – MalariaGEN version 6). La taille du cercle indique le nombre de échantillons représentés (le plus petit, 1 ; le plus grand, 87). Les haplotypes de la même région (Asie ou Afrique) ont été regroupés, indiquant l'origine indépendante des allèles pfaat1.

Des croisements génétiques de P. falciparum peuvent être réalisés avec des souris chimériques de foie humain, ravivant et améliorant cet outil puissant pour la génétique du paludisme23,24, après l'interdiction de l'utilisation des grands singes pour la recherche. Nous avons utilisé deux répliques biologiques indépendantes d'un croisement entre le parasite africain sensible à la CQ, 3D7, et un parasite résistant à la CQ récemment isolé de la frontière entre la Thaïlande et le Myanmar, NHP4026 (tableau supplémentaire 3). Nous avons ensuite comparé les fréquences d'allèles à l'échelle du génome dans les pools de progénitures traités par CQ et traités par le contrôle afin d'identifier les locus de traits quantitatifs (QTL) (tableau supplémentaire 4). Cette analyse de ségrégation en masse (BSA) 25 des parasites descendants a identifié de manière robuste le chr. 7 locus contenant pfcrt comme prévu, validant notre approche (Fig. 3a et Fig. 3 et 4 supplémentaires). Nous avons également été intrigués de voir un QTL significatif sur chr. 6 dans chacun des croisements répétés (Fig. 3, Fig. 3 et 4 supplémentaires et Données étendues Fig. 6). Nous avons priorisé les gènes dans l'intervalle de confiance à 95 % de chaque QTL (tableau supplémentaire 5) en inspectant les SNP et les indels qui différenciaient les deux parents (tableau supplémentaire 6). Le chr. 6 QTL s'étendaient de 1 013 kb à 1 283 kb (270 kb) et contenaient 60 gènes. Parmi ceux-ci, 54 sont exprimés dans les stades sanguins et 27 ont des mutations non synonymes qui différencient 3D7 de NHP4026. pfaat1 était situé au sommet du chr. 6 QTL (Fig. 3c). NHP4026 portait deux mutations non synonymes dérivées dans pfaat1 (S258L et F313S) par rapport à 3D7, qui porte l'allèle ancestral. Nous avons donc émis l'hypothèse que l'un ou les deux de ces SNP pfaat1 pourraient être à l'origine du chr. 6 QTL.

a, Parcelles de fréquence d'allèles à travers le génome avant et après le traitement CQ. Les lignes de la même couleur indiquent les résultats des répétitions techniques. b, QTL identifiés par l'approche G'. Les lignes de la même couleur indiquent les résultats des répétitions techniques. a et b incluent les résultats de la BSA avec un traitement CQ de 48 h avec des échantillons prélevés au jour 4. Pour la BSA complète à partir de différents moments de collecte et de la durée du traitement médicamenteux sous différentes concentrations de CQ, voir les figures supplémentaires. 3 et 4. c, Cartographie fine des chr. 6 QTL. Les intervalles de confiance (IC) à 95 % ont été calculés à partir des échantillons traités avec 250 nM de CQ, y compris les données de différents moments de collecte (jour 4 pour un traitement de 48 h avec CQ et jour 5 pour un traitement de 96 h avec CQ), pools (pool 1 et pool 2) et durée du traitement médicamenteux (48 h et 96 h). Une ombre cyan clair montre les limites des CI fusionnés de tous les QTL. Chaque ligne indique un QTL ; la ligne pointillée noire indique le seuil de détection des QTL (G′ = 20). La ligne pointillée rouge verticale indique l'emplacement de pfaat1.

Nous avons isolé des clones individuels de la progéniture en vrac 3D7 × NHP4026 F1 pour récupérer des clones avec toutes les combinaisons d'allèles parentaux au chr. 6 et chr. 7 locus QTL. Nous avons cloné des parasites à la fois à partir d'une culture de descendance en vrac sélectionnée par CQ (96 h à 250 nM de CQ) et à partir d'une culture témoin. Cela a généré 155 descendants clonaux : 100 de la culture sélectionnée par CQ, dont 62 étaient génétiquement uniques, et 55 de la culture témoin non traitée, dont 47 étaient uniques (Fig. 4a). Nous avons comparé les fréquences alléliques entre ces deux populations de descendance (Fig. 4b), révélant des différences significatives chez les chr. 6 et chr. 7 régions QTL, parallèlement aux résultats BSA. Nous avons observé une déplétion spectaculaire de l'allèle NHP4026 résistant à la CQ au chr. 7 QTL dans les cultures traitées par le contrôle, compatibles avec une forte sélection contre les allèles pfcrt résistants à la CQ en l'absence de sélection de la CQ. À l'inverse, tous les descendants isolés après le traitement à la CQ portaient l'allèle pfcrt NHP4026 résistant à la CQ. L'héritage du locus pfcrt (chr. 7) et du locus pfaat1 (chr. 6) était étroitement lié dans les clones isolés (Fig. 4c). Pour examiner plus en détail si les données croisées étaient compatibles avec l'épistasie ou la co-sélection, nous avons examiné un plus grand échantillon de clones recombinants isolés à partir de cinq itérations indépendantes de ce croisement génétique en l'absence de sélection CQ. Cela a révélé une sous-représentation significative des clones de génotype pfcrt 76T et pfaat1 258S/313F (WT) (tableau supplémentaire 7, χ2 = 12,295, P = 0,0005). Ces résultats sont cohérents avec la forte DL entre ces loci observée dans la nature (Extended Data Fig. 4 et Supplementary Fig. 1) 20 et suggèrent une relation fonctionnelle entre les deux loci. Le rôle de pfaat1 S258L/F313S dans la compensation de la remise en forme réduite des parasites porteurs de pfcrt K76T est une explication probable des résultats observés.

a, Héritage allélique de 109 descendants recombinants uniques. Les blocs noirs et rouges indiquent les allèles de 3D7 et NHP4026, séparément. Les lignes grises verticales montrent des régions non centrales où aucun SNP n'a été génotypé. A gauche : les clones isolés des pools de descendance recombinante avec ou sans traitement CQ sont marqués. À droite : les allèles pfaat1 et pfcrt sont étiquetés. WT indique les allèles pfaat1 et pfcrt de 3D7 et MUT indique les allèles de NHP4026. L'emplacement de pfaat1 et pfcrt est marqué à l'aide de triangles noirs en haut du panneau. b, graphique de fréquence des allèles 3D7 à l'échelle du génome de la progéniture unique clonée à partir de pools après 96 h de traitement CQ (250 nM) (bleu) ou à partir de pools de contrôle (or). c, Lien entre les loci sur différents chromosomes mesuré par le test exact de Fisher. La ligne verticale pointillée marque le seuil de signification corrigé de Bonferroni (unilatéral), tandis que les points indiqués en rouge sont des comparaisons entre les SNP flanquant pfaat1 et pfcrt. Le tableau supplémentaire 7 montre des associations non aléatoires entre les génotypes dans les clones de parasites récupérés à partir de cultures non traitées.

Nous avons ensuite mesuré les valeurs de la concentration inhibitrice semi-maximale (IC50) de CQ in vitro pour 18 parasites (un ensemble de 16 descendants et les deux parents), portant toutes les combinaisons du chr. 6 et chr. 7 allèles QTL (Fig. 5 supplémentaire et tableau supplémentaire 8). Le parent NHP4026 était le parasite le plus résistant à la CQ testé. Tous les descendants qui ont hérité du pfcrt NHP4026 ont montré un phénotype résistant à la CQ, tandis que tous les descendants qui ont hérité du pfcrt 3D7 étaient sensibles à la CQ, conformément aux rapports précédents. L'effet des allèles pfcrt sur la résistance du parasite à la CQ était significatif sur la base d'un test d'analyse de variance à deux voies (P = 7, 52 × 10-11). Nous n'avons pas observé d'effet des génotypes pfaat1 sur les valeurs d'IC50 chez les clones portant pfcrt 76T (P = 0,06) ou pfcrt 76K (P = 0,19). Cette analyse a une puissance limitée car seuls deux parasites descendants ont été récupérés avec pfaat1 258S / 313F (WT) en combinaison avec pfcrt 76T (Fig. 4a et Fig. 5 supplémentaire), mais elle est cohérente avec le fait que le QTL pfaat1 est déterminé par la forme physique du parasite dans nos croisements génétiques. Nous nous sommes donc concentrés sur la manipulation génétique des parasites isogéniques pour l'analyse fonctionnelle.

Nous avons utilisé la modification CRISPR – Cas9 du parent NHP4026 résistant à la CQ pour étudier les effets des mutations de pfaat1 sur la réponse aux médicaments CQ IC50 et la forme physique du parasite (Fig. 5). NHP4026 pfaat1 porte les deux modifications non synonymes SEA les plus courantes (S258L et F313S) (Fig. 2), par rapport au parent sensible 3D7. Nous avons modifié ces positions à l'état ancestral à la fois individuellement et en combinaison et avons confirmé les modifications dans trois à cinq clones isolés à partir de modifications indépendantes pour chaque changement allélique (Fig. 5a). Nous avons ensuite déterminé les valeurs CQ IC50 et mesuré la forme physique à l'aide d'expériences de compétition par paires pour le NHP4026258L/313S parental, les mutations uniques NHP4026258L/313F, NHP4026258S/313S et l'allèle ancestral NHP4026258S/313F. Cela a révélé un impact hautement significatif de la mutation S258L, qui a multiplié par 1,5 les valeurs de CQ IC50, et un impact plus modéré mais significatif de F313S et de la double mutation (S258L/F313S), par rapport à l'allèle ancestral (258S/313F) (Fig. 5b). L'observation selon laquelle 258L présente des valeurs IC50 réduites en combinaison avec la mutation F313S révèle une interaction épistatique entre ces variants d'acides aminés (Fig. 5b).

a, édition du gène CRISPR-Cas9. En commençant par le parent NHP4026, nous avons généré toutes les combinaisons des états SNP à pfaat1. b, réponse médicamenteuse. Chaque point indique une mesure IC50 répétée : nous avons utilisé deux à quatre clones édités CRISPR indépendants pour chaque haplotype examiné. Le nombre de répétitions biologiques est indiqué au-dessus de l'axe des x. Nous avons effectué des tests t par paires (bilatérales) pour comparer les valeurs IC50 entre les lignées parasites, sans ajustement pour les comparaisons multiples. Les haplotypes sont indiqués sur l'axe des x avec les acides aminés dérivés indiqués en rouge. Les barres indiquent les moyennes ± sem), tandis que les différences significatives entre les haplotypes sont marquées. c, remise en forme. Les barres montrent la forme physique relative moyenne (± 1 sem) mesurée dans des expériences de compétition répliquées, et les points représentent la forme physique à partir de mesures individuelles. Nous avons mené trois expériences de compétition indépendantes pour chaque groupe de parasites édité en l'absence de CQ. La statistique F a été utilisée pour comparer la fitness entre les lignées de parasites. Les résultats des tests pour chaque groupe édité ont été combinés à l'aide de méta-analyses à effets aléatoires. Pour les changements de fréquence d'allèles pour chaque expérience de compétition, voir Extended Data Fig. 10. NS, non significatif.

Données source

Nous avons également examiné l'effet des substitutions S258L et F313S sur les réponses à d'autres médicaments à base de quinoléine. Les résultats ont révélé des effets significatifs des substitutions pfaat1 sur les réponses IC50 de la quinine, de l'amodiaquine et de la luméfantrine, et aucun effet sur l'IC50 de la méfloquine (données étendues Fig. 7). Notamment, ces changements de valeur IC50 étaient bien inférieurs au seuil associé à la résistance clinique. Par conséquent, bien que les mutations de pfaat1 puissent avoir un impact subtil sur une gamme de composés, ces résultats sont cohérents avec le fait que le traitement CQ est la principale force sélective qui a conduit les mutations pfaat1 S258L et F313S avec celles de pfcrt.

Les mutations conférant une résistance aux médicaments entraînent souvent des coûts de remise en forme en l'absence de traitement médicamenteux. Nous avons donc examiné l'aptitude du parasite en menant des expériences de compétition par paires avec le parasite parental NHP4026 contre les mêmes parasites mutants pfaat1 créés ci-dessus. Cela a révélé des différences significatives de fitness (Fig. 5c). L'allèle 258L/313F qui a montré un balayage sélectif en Gambie était le moins adapté de tous les génotypes, l'allèle ancestral (258S/313F) porté par le parent 3D7 était le plus adapté, tandis que la mutation 258S/313S a montré une aptitude similaire au parent NHP4026 (258L/313S). Ces résultats ont également révélé de fortes interactions épistatiques dans la condition physique. Alors que l'allèle 258L / 313F qui conférait des valeurs CQ IC50 élevées (Fig. 5b) entraînait une lourde pénalité de fitness (Fig. 5c), la fitness était partiellement restaurée par la mutation 313S de l'allèle 258L / 313S qui prédomine dans SEA. Ensemble, ces résultats montrent que la substitution pfaat1 S258L sous-tend une augmentation de 1,5 fois de la résistance à la CQ qui a probablement entraîné sa propagation sélective en Gambie. Cependant, S258L a un coût de fitness élevé qui, dans les parasites SEA, a probablement été atténué par la substitution, F313S. Dans l'ensemble, ces résultats démontrent un effet important des mutations pfaat1 sur l'aptitude des parasites porteurs d'allèles de résistance pfcrt K76T.

Les expériences d'édition révèlent que les clones portant l'allèle ancestral pfaat1 en combinaison avec pfcrt K76T présentent la meilleure forme physique. En revanche, l'association étroite de pfaat1 S258L/F313S avec pfcrt K76T dans la descendance des croisements génétiques a révélé la relation opposée. Nous supposons que ces résultats opposés peuvent refléter des pressions de sélection différentes chez les parasites au stade sanguin dans le cas des expériences CRISPR, ou dans les stades du moustique et du foie du cycle de vie dans le cas de croisements génétiques. Les études d'édition de gènes ont été menées avec un seul génotype de parasite SEA (NHP4026). Alors que les allèles africains pfcrt CQR sont originaires de SEA et partagent un ancêtre et une identité communs aux acides aminés 72 à 76, la plupart des parasites SEA (y compris NHP4026) portent une ou deux mutations supplémentaires dans pfcrt (N326S et I356T) associées à des valeurs CQ IC50 plus élevées et à une remise en forme réduite13,26. L'haplotype pfcrt prédominant en Gambie diffère de NHP4026 à un acide aminé, portant le 326S ancestral, tandis que NHP4026 porte la mutation 326N13. Il sera important d'examiner l'effet des mutations pfaat1 sur les fonds génétiques africains dans les travaux futurs.

Pour mieux comprendre comment pfaat1 S258L impacte le phénotype du parasite, nous avons utilisé un système d'expression hétérologue de levure. WT pfaat1 est exprimé dans la membrane plasmique de la levure27, où il augmente l'absorption de quinine et de CQ, conférant une sensibilité aux médicaments à base de quinoléine, entraînant une croissance réduite. Il a déjà été démontré que l'absorption de CQ était inhibée de manière compétitive par le tryptophane, un acide aminé aromatique, suggérant un rôle de pfaat1 dans le transport des médicaments et des acides aminés27. Nous avons donc exprimé pfaat1 S258L dans la levure, ce qui a restauré la croissance de la levure en présence de niveaux élevés de CQ (Extended Data Fig. 8). Fait intéressant, l'expression d'un autre variant d'acide aminé (T162E), responsable de la résistance à la CQ chez les parasites du paludisme des rongeurs (Plasmodium chabaudi)28, empêche également l'accumulation de médicaments à base de quinoléine dans les cellules de levure et restaure la croissance cellulaire en présence de 1 mM de CQ27. Ensemble, ces résultats nouveaux et publiés suggèrent que l'expression par la levure des mutations pfaat1 a un impact sur la résistance et la forme physique en modifiant les taux de transport des acides aminés et de la quinoléine.

Nous avons évalué des modèles structurels tridimensionnels basés sur la séquence d'acides aminés 3D7 PfAAT1 en utilisant AlphaFold29 et I-TASSER30 (Extended Data Fig. 9). Alors que pfCRT a 10 hélices traversant la membrane31, pfAAT1 en a 11 ; cela a été corroboré à l'aide de l'outil de prédiction de topologie membranaire basé sur la séquence TOPCONS32. Les mutations communes pfAAT1 S258L, F313S et Q454E sont situées dans des domaines transmembranaires, tandis que K541L se trouve dans une boucle reliant les domaines 9 et 10. La localisation de ces changements non synonymes à haute fréquence dans les domaines transmembranaires présente de forts parallèles avec l'évolution de pfCRT31 et est cohérent avec un rôle fonctionnel pour ces acides aminés dans la fonction de transport.

L'identification de pfcrt comme le principal déterminant de la résistance à la CQ a été une percée qui a transformé le paysage de la recherche sur la résistance aux antipaludiques, mais la contribution de facteurs génétiques supplémentaires dans l'évolution et le maintien de la résistance à la CQ est restée incertaine26,33. En combinant l'analyse génomique longitudinale de la population couvrant l'émergence de la résistance à la CQ en Gambie, l'analyse des populations en vrac et de la descendance de croisements génétiques contrôlés, et la validation fonctionnelle à l'aide de P. falciparum et de la levure, nous trouvons des preuves convaincantes qu'un deuxième locus, pfaat1, a joué un rôle important dans l'évolution de la résistance à la CQ. Cette puissante combinaison d'approches nous a permis d'examiner les variantes critiques de pfaat1 qui contribuent à l'architecture de la résistance CQ et aux interactions entre pfcrt et pfaat1.

Nos résultats fournissent des preuves convaincantes qui consolident les observations disparates de plusieurs systèmes suggérant un rôle pour pfaat1 dans l'évolution de la résistance aux médicaments. Chez le parasite du paludisme des rongeurs P. chabaudi, une mutation (T162E) du gène orthologue (pcaat1) s'est avérée être un déterminant de la faible résistance à la CQ dans la résistance développée en laboratoire28. Dans les études d'association à l'échelle du génome de P. falciparum, la mutation S258L de pfaat1 était associée à la résistance à la CQ dans des isolats de terrain collectés le long de la frontière Chine-Myanmar34, tandis que pfcrt K76T et pfaat1 S258L montrent la LD la plus forte entre les chromosomes physiquement non liés à l'échelle du génome20. De plus, des mutations dans pfaat1 ont été liées à l'évolution in vitro de la résistance de P. falciparum à trois échafaudages médicamenteux différents35. Des travaux antérieurs ont identifié de fortes signatures de sélection récente chez les parasites en Afrique dans les régions entourant pfcrt, pfaat1 et d'autres locus de résistance aux médicaments16,17,36 ; des signatures de sélection similaires sont observées en Asie et en SM18,19, tandis que pfaat1 a été mis en évidence dans une liste de gènes de P. falciparum montrant une différenciation géographique extrême21.

Les différents haplotypes pfaat1 en Afrique et en Asie pourraient être en partie responsables de l'évolution contrastée de la résistance à la CQ sur ces deux continents. Les parasites résistants à la CQ portant à la fois pfcrt K76T et pfaat1 S258L se sont répandus à travers l'Afrique, mais après le retrait de la CQ comme médicament de première ligne, la prévalence des parasites résistants à la CQ a diminué dans de nombreux pays37,38,39. Ceci est cohérent avec la faible aptitude des parasites porteurs de pfcrt K76T et pfaat1 S258L en l'absence de pression médicamenteuse et une concurrence intense au sein de l'infection parasitaire du paludisme en Afrique40.

En revanche, pfcrt K76T est resté au niveau ou proche de la fixation dans de nombreux pays SEA21,41 (Fig. 2). À la frontière entre la Thaïlande et le Myanmar, la résistance à la CQ est restée fixée depuis 1995, date à laquelle la CQ a été supprimée en tant que traitement de première intention du paludisme à P. falciparum41. Nos résultats de mutagenèse pfaat1 démontrent que les parasites porteurs de pfaat1 258L/313S présentent des valeurs IC50 réduites mais une forme physique élevée par rapport à pfaat1 258L/313F. Nous supposons que la restauration de la forme physique par F313S peut aider à expliquer la rétention des allèles pfcrt K76T résistants à la CQ dans SEA. L'hypothèse alternative - selon laquelle les fréquences élevées de mutations F313S sont motivées par l'utilisation généralisée d'autres médicaments partenaires de la quinoléine dans SEA42 - n'est pas étayée, car nous ne voyons que des impacts mineurs de cette substitution sur la réponse à la luméfantrine, à la quinine, à la méfloquine et à l'amodiaquine (Extended Data Fig. 7).

Les mutations de pfcrt confèrent une résistance à la CQ en permettant l'efflux de CQ à travers la membrane de la vacuole digestive, loin de son site d'action8. pfAAT1 est également situé dans la membrane vacuole digestive35, où il agit probablement comme un transporteur bidirectionnel d'acides aminés aromatiques9,43. Compte tenu de la similitude structurelle des médicaments à base de quinoléine et des acides aminés aromatiques, les mutations de pfaat1 peuvent moduler la capacité de pfAAT1 à transporter la CQ et/ou les acides aminés27,43. La mutation pfaat1 S258L pourrait potentialiser la résistance soit en augmentant l'efflux de CQ hors de la vacuole digestive, soit en réduisant le taux d'entrée dans la vacuole. Étant donné que cette mutation pfaat1 bloque l'entrée des médicaments à base de quinoléine dans les cellules de levure lorsqu'elle est exprimée de manière hétérologue dans la membrane cellulaire de la levure, nous émettons l'hypothèse que la mutation pfaat1 S258L réduit l'absorption de CQ dans la vacuole alimentaire (Fig. 6). Nos analyses de mutagenèse montrent que l'allèle S258L a un coût de remise en forme élevé, peut-être en raison d'une diminution de la capacité de transport des acides aminés depuis la vacuole. Fait intéressant, la comparaison de l'haplotype pfaat1 S258L / F313S ségrégeant dans notre croisement génétique avec l'allèle pfaat1 WT généré à l'aide de l'édition de gènes n'a révélé que des augmentations marginales des valeurs IC50 et des réductions limitées de la forme physique. Ceci est cohérent avec la mutation F313S rétablissant la fonction pfaat1 naturelle de transport des acides aminés, réduisant ainsi le stress osmotique et la famine, tout en réduisant également partiellement les niveaux de résistance à la CQ (Fig. 6). Le fait que cet haplotype ait atteint une fréquence élevée dans SEA peut contribuer au maintien des allèles pfcrt K76T longtemps après le retrait de CQ en tant que médicament de première intention. Ce modèle (Fig. 6) fournit des hypothèses de travail qui peuvent être testées dans des travaux futurs examinant le rôle de pfAAT1 et pfCRT.

pfCRT (rouge) et pfAAT1 (bleu) sont tous deux situés dans la membrane de la vacuole digestive (DV). a, WT pfCRT et pfAAT1 transportent respectivement des peptides et des acides aminés aromatiques, ainsi que CQ. b, pfCRT K76T exporte la CQ du DV loin de son site d'action, entraînant une résistance élevée mais transporte les peptides de manière inefficace, entraînant une perte de forme physique. c, pfAAT1 S258L réduit l'entrée de CQ dans le DV, entraînant une résistance élevée, mais le flux d'acides aminés est affecté, entraînant une perte de forme physique. d, La double mutation pfAAT1 S258L/F313S augmente l'influx de CQ par rapport au S258L seul, mais la fonction de transport des acides aminés est restaurée, entraînant une réduction des valeurs d'IC50 et une amélioration de la condition physique en l'absence de traitement médicamenteux.

Nos résultats révèlent une complexité cachée dans l'évolution de la résistance à la CQ : le traitement médicamenteux a entraîné des balayages sélectifs mondiaux agissant sur des mutations dans un transporteur supplémentaire (pfAAT1) situé dans la membrane vacuole digestive de P. falciparum, qui affinent l'équilibre entre le transport des nutriments et des médicaments, révélant des preuves d'épistasie et de compensation, et ayant un impact à la fois sur la résistance aux médicaments et sur la forme physique.

L'étude a été réalisée conformément au Guide pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire des National Institutes of Health (NIH) des États-Unis. Le Seattle Children's Research Institute (SCRI) a une assurance du service de santé publique par l'intermédiaire du Bureau du bien-être des animaux de laboratoire pour le travail approuvé par son comité institutionnel de protection et d'utilisation des animaux. Tous les travaux effectués dans le cadre de cette étude ont été spécifiquement examinés et approuvés par le comité institutionnel de protection et d'utilisation des animaux du SCRI.

La conception du projet est résumée dans la Fig. 6 supplémentaire. En bref, nous utilisons (1) des analyses génomiques de population, (2) des croisements génétiques et une analyse génétique quantitative suivies de (3) des analyses fonctionnelles pour étudier le rôle de loci supplémentaires dans la résistance à la CQ.

Des échantillons de sang infectés par P. falciparum prélevés en Gambie centrale (Farafenni) et côtière (Serrekunda) en 1984 et 2001 ont été traités pour l'ADN du sang total et les génomes de P. falciparum et séquencés en profondeur au Wellcome Trust Sanger Institute. Les données des isolats collectés sur la côte gambienne en 2008 et 2014 avaient été publiées précédemment44,45 (tableau supplémentaire 1). Avant le séquençage, les génomes de P. falciparum ont été amplifiés à partir de l'ADN du sang total de chaque échantillon de 1984 et 2001 par amplification sélective du génome entier (WGA), puis séquencés (lectures appariées) sur la plateforme Illumina HiSeq46. Les lectures ont été cartographiées sur le génome de référence de P. falciparum 3D7 à l'aide de bwa mem (http://bio-bwa.sourceforge.net/). Les fichiers de mappage (Binary Alignment Map) ont été triés et dédupliqués par les outils Picard v2.0.1 (http://broadinstitute.github.io/picard/), et SNP et indel ont été appelés avec GATK HaplotypeCaller (https://software.broadinstitute.org/gatk/) conformément aux meilleures pratiques (https://www.malariagen.net/data/pf3K-5). Les fichiers de format d'appel de variante (VCF) ont été générés par chromosome, fusionnés à l'aide de bcftools (https://samtools.github.io/bcftools/bcftools.html) et filtrés à l'aide de vcftools (https://vcftools.sourceforge.net/). Après filtration, seuls les variants SNP bialléliques avec un score VQSLOD ≥ 2, une qualité de carte > 30 et pris en charge ≥ 5 lectures par variant allélique ont été retenus. Les SNP avec une fréquence d'allèles mineurs <2 % ont été retirés de notre analyse. Nous avons également supprimé les échantillons avec > 10 % de génotypes manquants. Dans l'ensemble de données final, il y avait au total 16 385 loci SNP bialléliques et 321 isolats (1984 (134), 1990 (13), 2001 (34), 2008 (75) et 2014 (65)). La complexité de l'infection (monogénomique ou polygénomique) a été estimée par le coefficient de consanguinité Fws à partir du fichier VCF fusionné à l'aide du package R Biomix. Les données de séquence à lecture courte analysées sont répertoriées dans le tableau supplémentaire 1.

Pour chaque échantillon avec une complexité d'infection supérieure à 1, l'allèle avec le plus de lectures a été conservé pour les génotypes à allèles mixtes afin de créer un ensemble de données de variation du génome haploïde virtuel. Les fréquences alléliques ont été calculées dans plink, et les différences par paires entre les populations temporelles et les grappes génétiques ont été estimées par Fst à l'aide de la méthode de Weir et Cockerham appliquée dans le package hierfstat dans R. Le test du rapport de vraisemblance pour la différence de fréquence allélique pFST a ensuite été calculé à l'aide de vcflib. Pour une valeur pFST P combinée, la méthode Fisher a été réalisée dans le package R metaseq. Les valeurs P récapitulatives ont été corrigées pour les tests multiples à l'aide de la méthode Benjamini-Hochberg (BH). Pour examiner le partage d'haplotypes à pfaat1 (Pf3D7_06_v3:1,213,102-1,217,313) et pfcrt (Pf3D7_07_v3:403222-406317) entre les isolats des différentes années d'échantillonnage en Gambie, nous avons extrait la matrice IBD à l'aide du package isoRelate R18 pour toutes les paires d'isolats pour les régions géniques couvrant 25 kb supplémentaires. sur chaque flanc. Nous avons généré des réseaux de parenté à l'aide du package R igraph en suivant les scripts du package isoRelate R18. Les isolats sont connectés s'ils montrent > 90 % d'IBD.

Nous avons considéré les échantillons collectés la même année comme une seule population, quel que soit le lieu de collecte. Nous avons utilisé l'approche hapFLK pour détecter les signatures de sélection positive par la différenciation des haplotypes après le regroupement hiérarchique des groupes de population temporelle gambienne par rapport à un groupe externe de Tanzanie, comme décrit précédemment47. Les valeurs P ont été calculées pour chaque valeur spécifique au SNP à l'aide du script Python fourni avec le programme hapFLK, et les valeurs ont été corrigées pour plusieurs tests à l'aide de la méthode BH. Deuxièmement, nous avons utilisé la relation par paires basée sur l'identité par descendance pour dériver une statistique iR pour chaque SNP telle qu'implémentée par le package IsoRelate18 dans R. Les régions avec des valeurs iR et hapFLK -log10 P se chevauchant > 5 ont été considérées comme des régions d'intérêt.

Nous avons inclus deux ensembles de données dans cette étude : (1) les génotypes de 7 000 échantillons de P. falciparum dans le monde du projet communautaire MalariaGEN Pf (version 6.0) (réf. 21). Cet ensemble de données comprend des échantillons d'Amérique du Sud (SM), d'Afrique de l'Ouest (WAF), d'Afrique centrale (CAF), d'Afrique de l'Est (EAF), d'Asie du Sud (SA), de la partie occidentale de l'Asie du Sud-Est (WSEA), de la partie orientale de l'Asie du Sud-Est (ESEA) et de la région de l'Océanie Pacifique (PO). (2) Nous avons également inclus 194 échantillons thaïlandais avec des données de séquençage du génome entier disponibles auprès de Cerqueira et al.15, et les avons fusionnés dans la population WSEA. Les séquences en double ont été supprimées en fonction de l'ID d'origine de l'échantillon (Hypercode). Seuls les échantillons avec des infections parasitaires uniques (diversité intra-hôte FWS> 0, 90) et> 50% des locus SNP génotypés ont été inclus pour une analyse plus approfondie. Un total de 4 051 échantillons sont restés après filtration (tableau supplémentaire 2). Les SNP non bialléliques et les appels de variants hétérozygotes ont été davantage supprimés de l'ensemble de données. Nous avons ensuite extrait les données de génotype dans les régions des gènes pfaat1 et pfcrt et calculé les fréquences alléliques (Fig. 2a).

Pour minimiser l'effet de la recombinaison, nous avons extrait 1 847 SNP répartis dans 25 kb en amont et 25 kb en aval du gène pfaat1. Seuls les échantillons avec les 1 847 SNP génotypés (581/4 051) ont été utilisés pour l'analyse évolutive. Pour visualiser la structure de la population, nous avons calculé la distance génétique par paires entre les échantillons et généré un réseau couvrant minimum (MSN; Fig. 2b et Données étendues Fig. 5), en utilisant le package R poppr. Nous avons comparé les séquences du génome (PlasmoDB, version 46) entre P. falciparum et Plasmodium reichenowi et extrait les génotypes à 1 803/1 847 locus communs. Nous avons ensuite construit une méthode de groupe de paires non pondérées avec un arbre de moyenne arithmétique (UPGMA) enraciné par P. reichenowi en utilisant les 581 haplotypes et 1 803 SNP (Extended Data Fig. 5), en utilisant les packages R ape et phangorn sous les paramètres par défaut. Le réseau MSN et la méthode de groupe de paires non pondérées avec arbre de moyenne arithmétique ont été tracés avec ggplot2.

Nous avons généré des croisements génétiques entre le parasite 3D7 et NHP4026 (réf. 48), en utilisant des souris FRG NOD huHep avec des foies chimériques humains et des moustiques Anopheles stephensi comme décrit précédemment23,24,25,49,50. 3D7 est un parasite d'origine africaine51 qui a été maintenu en laboratoire pendant des décennies et est sensible à la CQ, tandis que NHP4026 a été cloné à partir d'un patient visitant la clinique de l'unité de recherche sur le paludisme de Shoklo à la frontière entre la Thaïlande et le Myanmar (2007) et est résistant à la CQ (tableau supplémentaire 3). Nous avons généré trois pools de recombinants en utilisant des cages indépendantes de moustiques infectés : ce sont des pools indépendants de recombinants48. Le nombre estimé de génotypes recombinants dans chaque pool était d'environ 2 800 (réf. 48). Nous avons utilisé deux pools (pool 1 et pool 2) maintenus dans un milieu de culture à base d'AlbuMAX pour cette étude.

Pour chaque pool recombinant, la culture de parasites a été étendue dans des conditions de culture standard25. En bref, les cultures ont été maintenues dans un milieu complet à 5 % d'hématocrite dans des globules rouges O+ (RBC) (Biochemed Services) à 37 °C, pH de 7,0 à 7,5, 5 % de CO2, 5 % d'O2 et 90 % de N2. Des changements de milieu ont été effectués toutes les 48 h et les cultures ont été étendues pour maintenir la parasitémie à ~ 1 %. Une fois expansé, chaque pool recombinant a été divisé en 16 aliquotes de 0,5 ml tout en diluant à 1 % de parasitémie. Les aliquotes ont été maintenues dans des plaques à 48 puits et traitées avec du CQ (Fig. 7 supplémentaire). Au total, nous avions 32 cultures : 2 pools × 4 concentrations de CQ (0 (témoin), 50, 100 ou 250 nM) × 2 temps de durée du médicament (48 h ou 96 h) × 2 répétitions techniques. Nous définissons le jour où le médicament a été appliqué comme le jour 0. Après 2 jours (48 h) de traitement médicamenteux, les globules rouges infectés ont été lavés deux fois avec une solution saline tamponnée au phosphate pour éliminer le médicament résiduel. Pour la plaque affectée au traitement CQ de 48 h (plaque 48 puits 1), les cultures ont été maintenues en milieu complet ; et des échantillons ont été prélevés aux jours 0, 4 et 7. Pour la plaque affectée au traitement CQ de 96 h (plaque 2 à 48 puits), du CQ frais a été ajouté au milieu de culture et traité pendant 48 h supplémentaires ; et après un total de 96 h de traitement CQ, le médicament a été retiré et des échantillons ont été prélevés aux jours 0, 5 et 10. CQ a été dissous dans H2O et dilué dans un milieu incomplet (Gibco, Life Technologies). Le milieu de culture était changé toutes les 48h. La parasitémie a été contrôlée à l'aide de lames colorées au Giemsa à 20 % et les cultures ont été diluées à 1 % de parasitémie si la parasitémie était supérieure à 1 %. Environ 15 μl de globules rouges emballés ont été collectés par échantillon.

Nous avons préparé des bibliothèques Illumina et séquencé les deux parents et les 96 pools de ségrégants collectés. Nous avons extrait l'ADN génomique à l'aide du mini kit Qiagen DNA et quantifié l'ADN avec le test Quant-iT PicoGreen (Invitrogen). Pour les échantillons avec <50 ng d'ADN obtenus, nous avons effectué WGA52. Les produits WGA ont été nettoyés avec KAPA Pure Beads (Roche Molecular Systems) dans un rapport de 1:1. Nous avons préparé des bibliothèques de séquençage à l'aide de 50 à 100 ng d'ADN ou de produit WGA à l'aide du kit KAPA HyperPlus en suivant les instructions avec trois cycles de PCR. Toutes les bibliothèques ont été séquencées à 150 paires de bases à l'aide de séquenceurs Illumina Novaseq S4 ou Hiseq X, pour obtenir une couverture génomique > 100× par échantillon.

Nous avons cartographié les lectures de séquençage par rapport au génome de référence 3D7 (PlasmoDB version 46) à l'aide de BWA mem (http://bio-bwa.sourceforge.net/), et dédupliqué et trans-formaté les fichiers d'alignement à l'aide des outils picard v2.0.1 (http://broadinstitute.github.io/picard/). Nous avons recalibré le score de qualité de base sur la base d'un ensemble de variantes connues vérifiées53 à l'aide de BaseRecalibrator, et avons appelé des variantes via HaplotypeCaller. Les deux fonctions provenaient de Genome Analysis Toolkit GATK v3.7 (https://software.broadinstitute.org/gatk/). Seuls les variants situés dans les régions centrales du génome (définies dans la réf. 53) ont été appelés et utilisés pour une analyse plus approfondie.

Nous avons fusionné les appels des deux parents à l'aide de GenotypeGVCF dans GATK et appliqué une filtration standard à l'ensemble de données de variantes brutes, comme décrit dans la réf. 54. Nous avons recalibré les scores de qualité des variantes et supprimé les loci avec un score de qualité des variantes <1. Les variantes finales au format VCF ont été annotées à l'aide de snpEff v4.3 (https://pcingola.github.io/SnpEff/) avec 3D7 (PlasmoDB, version 46) comme référence. Après filtration et annotation, nous avons sélectionné des locus SNP distincts chez les deux parents et utilisé ces SNP pour d'autres BSA.

Nous avons utilisé des méthodes statistiques décrites dans les réf. 25,48,50 pour BSA. Les variantes d'appels des pools de descendants ségrégants ont été fusionnées. De plus, les locus SNP avec une couverture <30 × ont été supprimés. Nous avons compté les lectures avec les génotypes de chaque parent et calculé les fréquences alléliques. Les fréquences alléliques de 3D7 ont été tracées sur l'ensemble du génome et les valeurs aberrantes ont été supprimées selon la règle de Hampel55 avec une taille de fenêtre de 100 loci. Nous avons effectué la BSA en utilisant le package R QTLseqr56. Les QTL extrêmes ont été définis comme des régions avec G '> 20 (réf. 57). Une fois qu'un QTL a été détecté, nous avons calculé un intervalle de confiance d'environ 95 % en utilisant la méthode de Li58 pour localiser les gènes responsables.

Les descendants individuels ont été clonés via une dilution limite à 0, 3 cellule par puits à partir de cultures en vrac au jour 10 après 96 h de traitement contrôle / 250 nM CQ. Les puits individuels avec des parasites ont été déterminés par qPCR (comme décrit précédemment49) et étendus à des cultures plus grandes dans des conditions de culture standard pour obtenir suffisamment de matériel pour la cryoconservation et le séquençage du génome.

La descendance clonée a été séquencée et génotypée comme décrit dans la section « Croisement génétique et BSA », avec ces modifications : (1) la descendance clonée a été séquencée à une couverture génomique de 25× ; (2) Les appels SNP ont été supprimés si la couverture était supérieure à trois lectures par échantillon.

Des descendants recombinants uniques ont été identifiés à partir de tous les descendants clonés à l'aide d'un pipeline décrit précédemment49. La descendance non clonale a été identifiée sur la base du nombre et de la distribution des appels SNP hétérozygotes. La progéniture autofécondée a été identifiée comme ayant une similarité de séquence supérieure à 90 % avec l'un ou l'autre des parents. La descendance recombinante unique qui a été échantillonnée plusieurs fois a été identifiée comme des grappes de descendance clonale individuelle avec une similarité de séquence supérieure à 90 %. Nous avons tracé les fréquences des allèles 3D7 à travers le génome dans les populations descendantes avec et sans traitement CQ. Des cartes thermiques ont été générées pour visualiser les modèles d'héritage dans la descendance recombinante unique individuelle (Fig. 4a). Nous avons sélectionné 16 descendants recombinants uniques avec différentes combinaisons d'allèles au niveau des régions QTL du chromosome 6 et du chromosome 7 pour une mesure supplémentaire des valeurs CQ IC50 (Fig. 5 supplémentaire).

Le test exact de Fisher a été utilisé pour tester la liaison entre toutes les paires interchromosomiques de locus à travers l'ensemble de 109 descendants recombinants uniques. La distribution du -log des valeurs P résultantes a été tracée sur la figure 4c et le seuil de signification a été calculé sur la base d'une correction de Bonferroni pour le nombre de loci.

Les stocks cryoconservés de la progéniture 3D7, NHP4026, 3D7 x NHP4026 ont été décongelés et cultivés dans un milieu complet dans des conditions de culture standard comme décrit ci-dessus. Les cultures ont été maintenues en dessous de 3 % de parasitémie avec des changements de milieu toutes les 48 h. Les valeurs IC50 des parents et de la progéniture ont été évaluées via un test de fluorescence SYBR Green 1 standard de 72 h59. Les cultures ont été évaluées quotidiennement pour la parasitémie et le stade. Les cultures contenant au moins 70 % d'anneaux ont été chargées dans des tests dose-réponse CQ d'une série de dilutions de médicament de deux fois dans dix puits à 0,15 % de parasitémie. Les stocks de médicaments (1 mg ml-1) pour CQ ont été préparés dans H2O sous forme d'aliquotes à usage unique et conservés à -20 ° C jusqu'à leur utilisation. Les dilutions de médicament ont été préparées dans un milieu incomplet. Des répétitions biologiques ont été réalisées avec au moins deux cycles de culture entre les dates de chargement. Les valeurs IC50 ont été calculées dans GraphPad Prism 8 à l'aide d'une courbe à quatre paramètres à partir de deux répliques techniques chargées par plaque.

Nous avons conçu des plasmides pour l'édition CRISPR-Cas9 comme décrit précédemment60. L'ARN guide (GAAATTAAATACATAAAAGA) a été conçu pour cibler pfaat1 dans NHP4026. Des modifications (258L/313F, 258S/313S et 258S/313F, Fig. 5a) ont été introduites dans NHP4026 par le biais d'une séquence de bras d'homologie avec des mutations cibles et boucliers. Les mutants de contrôle du site de liaison n'ont pas été générés, car P. falciparum n'a pas de jonction d'extrémité non homologue sujette aux erreurs61. Les parasites ont été transfectés aux stades annulaires avec 100 ug d'ADN plasmidique, et les transfectants réussis ont été sélectionnés par traitement avec 24 nM de WR99210 (cadeau de Jacobus Pharmaceuticals) pendant 6 jours. Les parasites ont été récupérés après environ 3 semaines. Pour déterminer si les parasites récupérés contenaient les mutations attendues, nous avons amplifié la région cible (amorce directe, AGTACGGTACTTTTTATATGTACAGCT; amorce inverse, TGCATTTGGTTGTTGAGAGAAGG) et confirmé la mutation avec le séquençage Sanger. Nous avons cloné des parasites à partir d'expériences de transfection réussies : des parasites édités indépendants (provenant de différentes expériences de transfection) ont été récupérés pour chaque génotype pfaat1. Les parasites modifiés ont été séquencés pour identifier les modifications hors cible ailleurs dans le génome. Nous n'avons trouvé aucun changement de SNP ou d'indel entre le NHP4026 d'origine et les parasites édités par CRISPR autres que les mutations cibles et boucliers.

Les valeurs de CI50 des parasites pour la CQ, l'amodiaquine, la luméfantrine, la méfloquine et la quinine ont été mesurées pour deux à quatre clones par lignée modifiée par CRISPR-Cas9 et pour NHP4026 sur plusieurs dates de charge, comme décrit ci-dessus pour la descendance clonée, sauf que chaque plaque comprenait deux répliques techniques de NHP4026 comme témoins. Cette réplication du génotype à chaque date de chargement a permis de détecter les effets de lot dus à la date de chargement.

L'analyse de la variance a été utilisée pour tenir compte des effets de lot et pour tester les différences de valeurs d'IC50 entre tous les groupes de génotypes et pour chaque contraste entre chaque lignée modifiée par CRISPR-Cas9 et NHP4026 pour chaque médicament testé62. Un modèle linéaire avec la date de chargement (lot) et le génotype comme variables explicatives a été utilisé pour générer des valeurs IC50 corrigées par lot pour la visualisation de l'impact des modifications CRISPRCas9 (Fig. 5b et Extended Data Fig. 7).

Les parasites ont été synchronisés avec les schizontes de stade avancé à l'aide d'un gradient de densité63. La couche supérieure des schizontes au stade avancé a été retirée et lavée deux fois avec le milieu Roswell Park Memorial Institute (RPMI). Les cultures synchronisées ont été mises en suspension dans 5 ml de milieu complet à 5 % d'hématocrite et on les a laissées envahir à nouveau pendant une nuit sous agitation douce. La parasitémie et le stade parasitaire ont été quantifiés par cytométrie en flux. En bref, 80 μl de culture et un contrôle RBC ont été colorés avec SYBR Green I et SYTO 61 et mesurés sur un Guava easyCyte HT (Luminex). Au total, 50 000 événements ont été enregistrés pour déterminer la parasitémie relative et le stade. Lorsque 80 % des parasites étaient au stade de l'anneau, les expériences de compétition en tête-à-tête ont été mises en place64. Des tests de compétition ont été mis en place entre les parasites édités par CRISPR – Cas9 et NHP4026 dans un rapport 1: 1 à une parasitémie de 1% dans une plaque à 96 puits (200 μl par puits) et maintenus pendant 30 jours. Chacun des tests contenait trois répliques biologiques (trois clones indépendants issus de différentes expériences d'édition CRISPR-Cas9) et deux répliques techniques (deux puits de culture). Tous les 2 jours, la parasitémie a été évaluée par microscopie à l'aide de lames colorées au Giemsa, des échantillons ont été prélevés et stockés à -80 ° C et les cultures ont été diluées à 1% de parasitémie avec des globules rouges frais et du milieu. La proportion de parasites dans chaque compétition (Extended Data Fig. 10) a été mesurée à l'aide d'un test rhAmp SNP (Integrated DNA Technologies) avec des amorces ciblant la région éditée par CRISPR – Cas9 dans pfaat1.

Nous avons mesuré le(s) coefficient(s) de sélection en ajustant un modèle linéaire entre le logarithme naturel du rapport allèle (freq (parasite édité par allèle)/freq (NHP4026)) et le temps (mesuré en cycles asexués du parasite de 48 h). La pente du modèle linéaire fournit une mesure de la conduite s de chaque mutation65. Pour comparer l'aptitude relative des parasites portant différents allèles pfaat1, nous avons normalisé l'aptitude de NHP4026 à 1 et utilisé la pente + 1 pour quantifier l'aptitude des parasites édités par CRISPR – Cas9 (Fig. 5c).

Pour générer la levure exprimant pfAAT1, le plasmide portant la séquence codante pfaat1 a été transformé dans la levure Saccharomyces cerevisiae (BY4743) comme décrit précédemment27. Le temps de doublement (h) a été mesuré pour les souches portant le vecteur vide, WT pfAAT1 ou le mutant S258L pfAAT1. Nous avons mesuré le temps de doublement dans deux conditions de culture : témoin ou avec 1 mM de CQ. Trois expériences indépendantes ont été réalisées pour chaque essai.

Les modèles d'homologie tridimensionnelle pour pfAAT1 ont été prédits à l'aide d'AlphaFold29,66 et I-TASSER30,67,68 et analysés avec le logiciel PyMol (v2.3.0 ; Schrödinger, LLC). Au niveau de la séquence primaire, nous avons utilisé TOPCONS32 pour prédire la topologie de l'hélice transmembranaire à des fins de comparaison. Nous avons tracé une version de dessin animé de la topologie transmembranaire des protéines basée sur les structures prédites par calcul et la topologie membranaire (Extended Data Fig. 9). Les modèles ont été tronqués pour exclure les résidus amino-terminaux 1 à 166, probablement positionnés à l'extérieur de la membrane, car AlphaFold attribue une faible confiance à cet étirement N-terminal. De plus, les mutations d'intérêt ne correspondent qu'aux hélices transmembranaires selon les modèles 3D et TOPCONS. I-TASSER a généré des modèles avec une topologie similaire à AlphaFold avec les variations les plus élevées dans les régions AlphaFold à faible confiance 1–166 et 475–516. Les cinq premiers modèles I-TASSER se superposent au modèle AlphaFold avec une plage d'écart quadratique moyen de 2,4 à 2,8 Å sur 303 à 327 des 440 résidus alignés à l'aide du serveur PDBeFold (http://www.ebi.ac.uk/msd-srv/ssm). Les quatre SNP courants (S258L, F313S, Q454E et K541L) se superposent étroitement entre les modèles d'homologie. Nous avons évalué l'effet de différentes mutations sur la stabilité des protéines en utilisant la fonction de mutagenèse dans PyMol.

De plus amples informations sur la conception de la recherche sont disponibles dans le résumé des rapports sur le portefeuille Nature lié à cet article.

Toutes les données de séquençage brutes ont été soumises au National Center for Biotechnology Information Sequence Read Archive (SRA, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra) ou European Nucleotide Archive (ENA) avec les numéros d'accès disponibles dans les tableaux supplémentaires 1 et 2. Toutes les autres données sont disponibles dans le texte principal ou dans des documents supplémentaires. Les données sources sont fournies avec ce document.

Le code utilisé dans l'analyse et les données analysées sont disponibles sur GitHub via les liens suivants : https://github.com/emilyli0325/CQ.AAT1.git (XL), https://github.com/MPB-mrcg?tab=repositories (AA-N.) et https://github.com/kbuttons/CQ.AAT1.progeny.git (KAB-S.).

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Nous remercions le personnel passé et actuel et les chercheurs invités de l'unité MRC en Gambie impliqués dans des études dont des échantillons ont été archivés, y compris ceux sous la direction précédente de B. Greenwood et T. Corrah. Les travaux au Texas Biomedical Research Institute ont été menés dans des installations construites avec le soutien de la subvention du programme d'amélioration des installations de recherche C06 RR013556. L'unité de recherche sur le paludisme de Shoklo fait partie de l'unité de recherche de l'Université Mahidol d'Oxford soutenue par le Wellcome Trust de Grande-Bretagne. Nous remercions le personnel des installations de logistique, de séquençage et d'informatique du Wellcome Trust Sanger Institute pour leurs contributions. Le noyau de biologie structurale du centre des sciences de la santé de l'Université du Texas à San Antonio fait partie des noyaux de recherche institutionnels soutenus par le bureau du vice-président pour la recherche, le Greehey Children's Cancer Research Institute et le Mays Cancer Center Drug Discovery and Structural Biology Shared Resource (subvention NIH P30 CA054174). Financement : subvention NIH P01 12072248 (MTF) ; subvention NIH R37 AI048071 (TJCA); Bourse de développement de carrière du CRM MC_EX_MR/K02440X/1 (AA-N.); Subvention du programme de lutte contre le paludisme du MRC MC_EX_MR/J002364/1 (UDA) ; Subvention du Conseil européen de la recherche AdG-2011-294428 (DC et AA-N.); Subvention MRC MR/S009760/1 (DC) ; Wellcome Trust (206194 et 204911) et la Fondation Bill & Melinda Gates (OPP1204628 et INV-001927) (DK) ; Subvention du Conseil de recherche en biotechnologie et en sciences biologiques BB/M022161/1 (SVA); et Wellcome Trust (numéro de subvention 220221) (FHN). Aux fins du libre accès, l'auteur a appliqué une licence de droit d'auteur public CC BY à toute version du manuscrit accepté par l'auteur découlant de cette soumission.

Ces auteurs ont contribué à parts égales : Alfred Amambua-Ngwa, Katrina A. Button-Simons, Xue Li, Sudhir Kumar, Katelyn Vendrely Brenneman.

Unité MRC Gambie à la London School of Hygiene and Tropical Medicine, Banjul, Gambie

Alfred Amambua-Ngwa & Umberto D'Alessandro

Eck Institute for Global Health, Département des sciences biologiques, Université de Notre Dame, Notre Dame, IN, États-Unis

Katrina A. Button-Simons, Katelyn Vendrely Brenneman, Lisa A. Checkley, Douglas A. Shoue, Haley Dalhoff, James K. Larbalestier et Michael T. Ferdig

Programme d'intervention et de prévention des maladies, Texas Biomedical Research Institute, San Antonio, Texas, États-Unis

Xue Li, Marco Ferrari, Marina McDew-White, Ann Reyes, Elizabeth Delgado et Timothy JC Anderson

Center for Global Infectious Disease Research, Seattle Children's Research Institute, Seattle, WA, États-Unis

Sudhir Kumar, Meseret T. Haile, Stefan HI Kappe et Ashley M. Vaughan

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Sarah M. Tindall et Simon V. Avery

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Roberto Amato, Richard D. Pearson et Dominic Kwiatkowski

Département de biochimie et de biologie structurale, University of Texas Health Science Center à San Antonio, Antonio, TX, États-Unis

Alexandre B.Taylor

Shoklo Malaria Research Unit, Mahidol-Oxford Tropical Medicine Research Unit, Mahidol University, Mae Sot, Thaïlande

François H. Nosten

Centre de médecine tropicale et de santé mondiale, Nuffield Department of Medicine, Université d'Oxford, Oxford, Royaume-Uni

François H. Nosten

Programme d'interactions hôte-pathogène, Texas Biomedical Research Institute, San Antonio, TX, États-Unis

Ian H. Cheeseman

Département de pédiatrie, Université de Washington, Seattle, WA, États-Unis

Stefan HI Kappe et Ashley M. Vaughan

Département de santé mondiale, Université de Washington, Seattle, WA, États-Unis

Cape Stefan HI

Département de biologie des infections, London School of Hygiene and Tropical Medicine, Londres, Royaume-Uni

David J. Conway

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AA-N., KAB-S., XL, SK et KVB ont contribué à parts égales à ce travail. Conceptualisation : MTF, TJCA, IHC, AMV, AA-N. et Méthodologie DJC : AMV, SK, SVA et ABT Investigation : AA-N., UD, DK, DJC, RA, RDP, KAB-S., KVB, MM-W., MTH, LAC, HD, JKL, AR, ED, SK, DAS, SMT, MF, ABT et TJCA Analyse : XL, KAB-S. et AA-N. Visualisation : XL, KAB-S. et AA-N. Acquisition des financements : MTF, TJCA, DJC, AA-N., DK, SVA et FHN Administration du projet : MF, DK, AA-N., DJC et SVA Supervision : MF, AMV, TJCA, IHC, SHIK, SVA, DK et DJC Rédaction—ébauche originale : KVB, TJCA, KAB-S. et XL Writing - révision et édition : MTF, AMV, IHC, SK, AA-N., DJC, DK, UD, RDP, SHIK, FHN, ABT et TJCA

Correspondance à Ashley M. Vaughan, Michael T. Ferdig ou Timothy JC Anderson.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Nature Microbiology remercie Liwang Cui, Carol Sibley et les autres examinateurs anonymes pour leur contribution à l'examen par les pairs de ce travail. Les rapports des pairs examinateurs sont disponibles.

Note de l'éditeur Springer Nature reste neutre en ce qui concerne les revendications juridictionnelles dans les cartes publiées et les affiliations institutionnelles.

p est la fréquence des allèles mutants (pfaat1 S258L ou pfcrt K76T) comme indiqué sur la figure 1a, et q (= 1-p) est la fréquence déduite des allèles de type sauvage (3D7). L'axe des x indique les générations de parasites (étiquetées avec l'année de collecte de l'échantillon). Nous avons estimé les coefficients de sélection (s) basés sur la fréquence des allèles entre 1990 et 2001, car la monothérapie CQ a été arrêtée en Gambie en 2004. s indique les changements de croissance relative par génération de parasite (c'est-à-dire la durée du cycle de vie complet chez le moustique et l'hôte humain). Le calcul était basé sur des estimations de 2, 4 ou 6 générations par an.

Les relations d'haplotype étaient basées sur l'identité par descendance de segments de génome englobant 25 kb de chaque côté de chaque gène (voir méthodes). Les haplotypes reliés par des lignes indiquent > 90 % d'IBD. Chaque point représente un isolat avec des couleurs de points représentant les années à partir desquelles ils ont été échantillonnés. Les points carrés représentent les infections complexes et les cercles représentent les monoclonaux. MOI, multiplicité d'infection.

Les panneaux AH montrent la proportion de paires IBD tracées à travers le génome pour les parasites de différentes régions géographiques (marquées en haut à gauche de chaque panneau). Pour les échantillons où > 90 % des génomes sont IBD, un seul échantillon représentatif avec le taux de génotype le plus élevé a été sélectionné et utilisé pour l'analyse IBD. Les numéros d'échantillons sont indiqués dans chaque panneau. Les limites des chromosomes sont indiquées par des lignes verticales en pointillés gris. L'emplacement de pfaat1 et pfcrt est indiqué par des flèches rouges en haut de chaque panneau. Le pic chr 10 (Afrique de l'Ouest, A) contient pfmspdbl2 associé à une diminution de la sensibilité à l'halofantrine, la méfloquine et la luméfantrine69. Le pic chr 8 (Afrique de l'Est et Asie (CH)) contient la dihydroptéroate synthase (résistance à la sulfadoxine)70 et le pic chr 12 (DF) contient la GTP cyclohydrolase I, un locus compensatoire pour les médicaments antifoliques71. Voir également les analyses d'Amambua-Ngwa et al.17, Hendon et al.18 et Carrasquilla et al.19.

Distribution des allèles A. pfcrt dans les pays africains. Distribution de l'allèle B. pfaat1 dans les pays africains. C. Corrélations des fréquences alléliques entre pfcrt (CVIET) et pfaat1 (S258L). Les fréquences de l'haplotype CVIET pour les acides aminés 72-76 dans pfcrt sont significativement corrélées avec les fréquences alléliques de pfaat1 S258L en Afrique de l'Ouest (R2 = 0,65, p = 0,0017, ligne pointillée rouge) ou dans toutes les populations africaines (R2 = 0,44, p = 0,0021). La taille du point indique le nombre d'échantillons, tandis que la couleur indique les emplacements d'échantillonnage. Nous avons utilisé le test t pour déterminer si la statistique r de Pearson diffère significativement de zéro.

L'arbre était enraciné avec Plasmodium reichenowi (non représenté sur l'arbre). WAF : Afrique de l'Ouest, EAF : Afrique de l'Est, CAF : Afrique centrale, SM : Amérique du Sud, ESEA : Asie du Sud-Est (SE), SA : Asie du Sud, WSEA : Asie du SE ouest, PO : Région de l'océan Pacifique.

Données source

Les traitements CQ ont été appliqués aux pools au jour 0 à 0 (témoin), 50, 100 ou 250 nM. Le CQ a été retiré le jour 2 (traitement de 48 heures) ou le jour 4 (traitement de 96 heures), comme ombragé en bleu clair. Pour les traitements CQ de 48 heures, des échantillons ont été prélevés aux jours 0, 4 et 7 ; tandis que pour le traitement CQ de 96 heures, les échantillons ont été prélevés aux jours 0, 5 et 10. Les lignes pleines ou pointillées sont les résultats de différentes répétitions techniques. Les fréquences des allèles 3D7 dans les pools traités au CQ diminuent dans les régions QTL chr.6 et chr.7. Dans la région chr.14 QTL, les fréquences alléliques ne changent pas ou peu après le traitement médicamenteux, ce qui suggère que ce QTL n'est pas lié au traitement médicamenteux.

L'édition du gène CRISPR/Cas9 a entraîné de petites différences d'IC50 pour la quinine (QN), la luméfantrine (LUM) et l'amodiaquine (AMD), mais aucun changement significatif pour la méfloquine (MQ). Cependant, toutes les IC50 étaient inférieures aux niveaux de signification clinique pour ces médicaments (seuils cliniques : QN = 600 nM72 ; MQ = 30 nM72, AMD = 60 nM72), ou à l'extrémité inférieure de la plage in vitro (0-150 nM) dans le cas de LUM73. Le nombre de répétitions biologiques est indiqué au-dessus de l'axe des x. Les valeurs P indiquent les niveaux de signification et sont basées sur une analyse ANOVA à deux facteurs. Les données sont présentées sous forme de valeurs moyennes +/- SEM.

Données source

Le temps de doublement de la levure a été calculé à partir de la partie linéaire de la croissance exponentielle. Les données ont été présentées sous forme de moyennes de 3 expériences indépendantes ± SEM et de signification et ont été calculées selon des comparaisons multiples (avec des corrections de Turquie) de l'ANOVA à deux facteurs. La croissance des cellules de levure exprimant pfaat1 de type sauvage (WT) est sévèrement impactée par le traitement CQ (1 mM CQ à travers les expériences) mais est récupérée dans la levure exprimant pfaat1 S258L. Les résultats publiés démontrent que l'AAT1 est exprimée dans la membrane cellulaire de la levure27, tandis que la pfAAT1 se localise dans la membrane vacuolaire digestive43 et peut également être présente dans la membrane plasmique35.

(A) Modèle AlphaFold de PfAAT1 (à gauche), modèle I-TASSER représentatif de PfAAT1 (au centre), superposition structurelle du modèle AlphaFold (sarcelle) et du modèle I-TASSER (gris, à droite). Les prédictions de la topologie de l'hélice transmembranaire (TM) de TOPCONS sont cartographiées sur les modèles en bleu foncé (à gauche, au centre). Les modèles AlphaFold et I-TASSER s'alignent sur un RMSD de 2,5 Å sur 327 des 440 résidus. Les résidus amino-terminaux 1-166 ont été exclus de tous les modèles en raison de la faible confiance dans la prédiction de la structure. (B) Vue détaillée des mutations sur la structure 3-D PfAAT1 prédite à l'aide du modèle AlphaFold. La vue de droite est liée à la gauche par une rotation de 45° autour de l'axe en regardant la figure suivie d'une rotation de 90° autour de l'axe horizontal. Les quatre SNP représentés sous forme de modèles de remplissage d'espace sont tous disposés dans un plan d'un côté du modèle, perpendiculaire à la membrane. S258L (hélice 3) et F313S (hélice 5) sont situés l'un en face de l'autre avec l'hélice 8 entre les deux. Compte tenu des interactions épistatiques entre les SNP PfAAT1 S258L et F313S évidentes à partir de nos analyses fonctionnelles, la substitution F313S de la phénylalanine volumineuse et hydrophobe par la plus petite sérine polaire peut compenser une perturbation dans la région transmembranaire qui comprend les hélices 3, 5 et 8 permettant potentiellement une restauration partielle de l'activité de transport d'acides aminés prévue. Q454E est situé sur l'hélice 8 près de la surface TM et K541N est situé dans une boucle reliant les hélices 9 et 10. (C) Topologie de PfAAT1 déduite à l'aide de la structure 3D. Il existe onze hélices transmembranaires (TM). Trois des mutations sont situées au niveau des hélices TM, tandis que K541N est situé au niveau d'une boucle reliant les hélices 9 et 10. Le schéma de couleurs correspond au schéma du panneau B. Le triangle bleu indique les résidus amino-terminaux 1-166 qui ont été exclus de la prédiction de la structure.

Nous avons utilisé trois clones édités CRISPR/Cas9 indépendants pour chaque génotype et deux répétitions techniques pour chaque expérience de compétition (valeurs moyennes tracées).

Fig. supplémentaires. 1–7.

Tableau supplémentaire 1. Numéros d'accession, identifiants d'échantillons et allèles pour les échantillons gambiens au codon pfaat1 258 et au codon pfcrt 76, respectivement. Tableau supplémentaire 2. Échantillons utilisés dans l'étude de l'allèle et de l'évolution de pfaat1. Tableau supplémentaire 3. Résumé des génotypes de parasites parentaux. Tableau supplémentaire 4. Informations et numéros d'accession pour les échantillons croisés. Tableau supplémentaire 5. Gènes à l'intérieur des régions QTL. Tableau supplémentaire 6. SNP et indels à l'intérieur des régions chr.6 QTL. Tableau supplémentaire 7. Descendance recombinante unique issue du croisement génétique 3D7 × NHP4026 sans sélection CQ. Tableau supplémentaire 8. Données CQ IC50 pour la descendance sélectionnée.

Nombre d'allèles et proportions de mutants par année d'échantillonnage en Gambie pour les codons pfaat1 258 et pfcrt 76. Données IC50 pour le parasite édité par CRISPR/Cas9. Données IC50 sur l'amodiaquine, la méfloquine, la luméfantrine et la quinine pour les parasites édités par CRISPR/Cas9. Temps de doublement cellulaire (h), déterminations en triple.

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Réimpressions et autorisations

Amambua-Ngwa, A., Button-Simons, KA, Li, X. et al. L'évolution de la résistance à la chloroquine chez Plasmodium falciparum est médiée par le transporteur putatif d'acides aminés AAT1. Nat Microbiol (2023). https://doi.org/10.1038/s41564-023-01377-z

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Reçu : 26 juillet 2022

Accepté : 29 mars 2023

Publié: 11 mai 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s41564-023-01377-z

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