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Rapports scientifiques volume 13, Numéro d'article : 9445 (2023) Citer cet article

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Les pseudomonades sont métaboliquement flexibles et peuvent prospérer sur différents hôtes végétaux. Cependant, les adaptations métaboliques nécessaires à la promiscuité de l'hôte sont inconnues. Ici, nous avons comblé ce manque de connaissances en utilisant RNAseq et en comparant les réponses transcriptomiques de Pseudomonas donghuensis P482 aux exsudats racinaires de deux plantes hôtes : la tomate et le maïs. Notre objectif principal était d'identifier les différences et les points communs entre ces deux réponses. Les voies régulées à la hausse uniquement par les exsudats de tomate comprenaient la détoxification de l'oxyde nitrique, la réparation des amas fer-soufre, la respiration par le cytochrome bd insensible au cyanure et le catabolisme des acides aminés et/ou gras. Les deux premiers indiquent la présence de donneurs de NO dans les exsudats des plantes tests. Le maïs induit spécifiquement l'activité de la pompe à efflux de type MexE RND et la tolérance au cuivre. Les gènes associés à la motilité ont été induits par le maïs mais réprimés par la tomate. La réponse commune aux exsudats semblait être affectée à la fois par les composés provenant des plantes et ceux de leur environnement de croissance : la résistance à l'arsenic et la synthèse de bactérioferritine étaient régulées à la hausse, tandis que l'assimilation du soufre, la détection du citrate ferrique et/ou d'autres transporteurs de fer, l'acquisition d'hème et transport des acides aminés polaires ont été régulés à la baisse. Nos résultats fournissent des orientations pour explorer les mécanismes d'adaptation à l'hôte chez les micro-organismes associés aux plantes.

Les plantes nourrissent les communautés microbiennes dans la rhizosphère en libérant des mélanges de composés organiques par les racines1. Les exsudats racinaires contiennent des métabolites primaires tels que des acides organiques, des acides aminés, des sucres et des métabolites secondaires aux propriétés bioactives ou de signalisation. La composition chimique exacte des exsudats dépend de l'espèce végétale et de l'état physiologique de la plante, ce dernier dépendant du stade de développement, de la disponibilité des nutriments et de la présence de facteurs de stress2. Les différences dans la composition des exsudats et le fonctionnement de l'immunité innée de la plante façonnent la composition et l'activité du microbiote racinaire3.

Les bactéries Pseudomonas peuvent prospérer dans diverses niches environnementales, y compris les racines de diverses plantes hôtes. Leur avantage concurrentiel implique une flexibilité métabolique et la production d'une large gamme de métabolites secondaires, y compris des antimicrobiens et des composés piégeant le fer4. De nombreuses souches associées aux plantes facilitent la croissance des plantes, atténuent le stress abiotique ou protègent les plantes contre les agents pathogènes5. Il n'y a pas d'études complètes sur l'étendue phylogénétique des plantes qu'une souche de Pseudomonas donnée peut coloniser. Cependant, certaines pseudomonades se sont avérées efficaces comme agents de lutte biologique sur des espèces végétales différentes de celle d'origine ou sur de multiples cultures, suggérant que les pseudomonades sont des colons plutôt promiscueux des plantes6.

Il est de plus en plus reconnu que les espèces végétales sélectionnent des communautés microbiennes distinctes7, les hôtes végétaux plus éloignés phylogénétiquement recrutant les populations de microbiote les plus distinctes8. Par conséquent, la promiscuité apparente de l'hôte de certains micro-organismes, tels que les pseudomonades, soulève des questions sur les changements métaboliques requis des bactéries pour coloniser plusieurs hôtes ou pour maintenir une association avec un hôte qui subit des changements physiologiques. Ce problème a été difficile à résoudre avec les données existantes, car la plupart des études ne traitent que des interactions hôte-microbe uniques. De plus, alors que les déterminants de la spécificité de l'hôte dans les interactions plante-microbe ont été étudiés en profondeur pour les rhizobiums symbiotiques, ils ont reçu peu d'attention chez les bactéries qui forment des associations moins intimes avec leurs hôtes9.

Pseudomonas donghuensis P482 est une souche de lutte biologique qui inhibe la croissance de plusieurs pathogènes bactériens et fongiques des plantes10,11. Isolée à l'origine de la rhizosphère de la tomate (Solanum lycopersicum L.), la bactérie peut également coloniser la rhizosphère de la pomme de terre12 et, comme le montre cette étude, les racines du maïs, ce qui en fait un modèle prometteur pour l'étude des traits d'adaptation à l'hôte chez la promiscuité. bactéries colonisatrices des racines.

Dans ce travail, nous étudions quelles voies métaboliques peuvent faire partie d'une réponse adaptative des Pseudomonas à différents hôtes végétaux en identifiant les gènes de différenciation ("spécifique de l'hôte") et les réponses transcriptomiques partagées ("indépendantes de l'hôte") de Pseudomonas donghuensis P482 aux exsudats racinaires de deux espèces végétales phylogénétiquement distinctes : la tomate (Dicot) et le maïs (Monocot).

Les méthodes de cette étude sont conformes aux directives et législations institutionnelles, nationales et internationales pertinentes. Ces protocoles d'étude sont également conformes à la Déclaration de politique générale de l'UICN sur la recherche impliquant des espèces menacées d'extinction et à la Convention sur le commerce des espèces de faune et de flore sauvages menacées d'extinction.

Le test de colonisation de la rhizosphère a été réalisé en utilisant P482 Rif, un mutant spontané résistant à la rifampicine de P48212. Les plantes ont été cultivées pendant 18 jours dans un sol non stérile à partir de graines inoculées au P482. Les détails expérimentaux peuvent être trouvés dans les informations supplémentaires (SI).

Tomate (Solanum lycopersicum L.) cv. Saint Pierre (Vilmorin Garden, Pologne) et maïs (Zea mays L.) cv. Les Bejm (fournis par le Plant Breeding and Acclimatization Institute, Smolice, Pologne) ont été cultivés à partir de graines.

Les graines de tomates ont été stérilisées par traitement avec de l'éthanol à 70 % pendant 1 min, suivi de 3 min dans du NaOCl à 3 % et 3 rinçages à l'eau distillée stérile. Les graines de maïs ont été stérilisées en surface en traitant deux fois avec du NaOCl à 3 % pendant 15 min, suivi de 10 min dans de l'éthanol à 70 % et en rinçant 3 fois avec de l'eau distillée stérile. Les graines stérilisées en surface ont germé sur un milieu de germination (GM) (0,5 × milieu de Murashige et Skoog avec vitamines Gamborg B5, 2 % de saccharose, 0,2 % de peptone de blé et 0,7 % de gélose végétale, pH ≈ 6,1). L'avantage d'utiliser GM est que, grâce à l'ajout de peptone, il permet de filtrer les graines en germination pour la contamination microbienne. La tomate a germé dans l'obscurité à 24 °C, tandis que le maïs était à la lumière à 22 °C. Les graines germées ne présentant aucun signe d'infection ont été transférées dans des récipients contenant du sable à gros grains (1,4–2 mm) (AQUAEL, Pologne). Les conditions de culture ont été optimisées pour la taille et les besoins nutritionnels de chaque espèce : le maïs a été cultivé dans des bocaux en verre de 900 ml dans ¼ de milieu de Hoagland, pH 5,6 à 5,8 (mélange de sel de base n° 2 de Hoagland, Merck), 3 plants par bocal, tandis que la tomate a été cultivée dans des récipients GA-7 Magenta (Merck), 6 plantes par récipient, dans ½ milieu de Hoagland. Les plantes ont été cultivées pendant 13 jours à 22 °C, 16 h de lumière/8 h de photopériode d'obscurité. Les deux espèces de plantes ont établi une deuxième paire de feuilles au cours de cette période.

Les plantes cultivées dans des conditions gnotobiotiques ont été retirées du sable. Les racines ont été lavées à l'eau pendant 2 à 4 min, transférées dans des béchers en verre contenant de l'eau stérile de haute pureté et incubées pendant 2 h. Certaines feuilles des petits plants de tomates ont touché la surface de l'eau. Les exsudats de 174 plants de tomates et de 48 plants de maïs ont été collectés afin d'obtenir suffisamment d'exsudats pour les cultures bactériennes (RNAseq) et les analyses chimiques. Ce nombre de plantes a donné 4,5 mg d'exsudats de tomate et 6,6 mg d'exsudats de maïs. Les échantillons de chaque espèce ont été regroupés et stérilisés par filtration à travers une membrane PES à faible liaison de 0,22 µm (Thermo Scientific). Les échantillons ont été congelés à - 80 °C et lyophilisés.

L'analyse non ciblée de la composition chimique des exsudats racinaires a été réalisée par chromatographie en phase gazeuse-spectrométrie de masse (GC-MS) et résonance magnétique nucléaire (RMN). La quantité relative de 21 acides aminés a été évaluée par spectrométrie de masse de contrôle de réaction sélectionnée par chromatographie liquide (LC-SRM). Tous les détails sont fournis dans les informations supplémentaires (SI).

P482 a été cultivé à 28 °C dans un milieu 1C (sels de M9, 2 mM de Mg2SO4, 0,1 mM de CaCl2, 0,4 % de glucose13), avec ou sans exsudats lyophilisés (témoins) de tomate ou de maïs. L'expérience a été réalisée dans des plaques à 96 puits, incubées avec agitation orbitale dans un lecteur de microplaques EPOCH (BioTek), avec une DO600 mesurée toutes les 20 min. Trois concentrations d'exsudats (0,02 mg L−1, 0,1 mg L−1, 0,2 mg L−1) ont été testées pour vérifier leur impact sur les paramètres de croissance de P482 (Fig. S1). La concentration la plus élevée a ensuite été appliquée pour faire pousser des cellules pour interrogation avec RNAseq, car la concentration la plus élevée a été jugée la plus susceptible d'entraîner des modifications induites par l'exsudat dans l'expression des gènes. Le pH du milieu a été mesuré avant l'inoculation et après la croissance de P482 jusqu'à une phase stationnaire précoce à l'aide de bandelettes indicatrices de pH MQuant (Supelco).

Les bactéries ont été récoltées après avoir atteint la phase stationnaire précoce, après 33 h de croissance dans un milieu 1C non supplémenté et 24 et 28 h, respectivement, pour la croissance dans un milieu 1C avec des exsudats de maïs ou de tomate (OD600 0, 35–0, 48) (Fig. S1). Pour chaque traitement, trois pools de cellules (environ 109) ont été collectés par centrifugation et fixés avec fixRNA (Eurx, Pologne). Chaque pool a été traité comme une réplique biologique distincte dans le RNAseq en aval. L'ARN total a été isolé à l'aide du kit RNeasy Mini (Qiagen). L'ARN purifié a été traité avec le kit TURBO DNA-free™ (Thermo Fisher Scientific). L'absence de contamination par l'ADNg a été confirmée par PCR en temps réel avec des amorces ciblant gyrB.

Neuf échantillons d'ARN ont été séquencés, avec 3 réplicats biologiques pour chacun des deux traitements d'exsudat et le contrôle (milieu 1 C seul). L'évaluation de l'intégrité de l'ARN, l'épuisement de l'ARNr, la préparation de la bibliothèque, le séquençage Illumina (min. 5 Go par échantillon), l'assemblage du transcriptome et l'analyse différentielle de l'expression génique ont été sous-traités à Baseclear (Leiden, Pays-Bas). Les lectures d'ARN-seq filtrées ont été cartographiées sur le génome de référence de P482 (Genbank : JHTS00000000.1)14. Les statistiques suivant le filtrage et l'alignement sont disponibles dans les tableaux S1 et S2, respectivement. Une analyse en composantes principales a été appliquée pour vérifier si les échantillons répétés forment des grappes distinctes (Fig. S2). L'analyse différentielle de l'expression génique a été réalisée à l'aide de DESeq2 1.22.215. D'autres analyses ont été effectuées en interne. Les changements dans l'expression des gènes ont été filtrés pour leur signification biologique (1, 5 log2 fold change (FC)) et statistique (p <0, 05; valeur p ajustée, correction de Benjamini – Hochberg (B – H) pour contrôler le taux de fausses découvertes (FDR)). Les gènes avec padj> 0, 05 et ceux auxquels la valeur ajustée (NA) n'a pas pu être attribuée ont été exclus de l'analyse en aval. Des groupes se chevauchant de gènes exprimés de manière différentielle ont été visualisés avec BioVenn16. Les protéines ont été attribuées à des grappes de groupes orthologues (COG) à l'aide du mappeur eggNOG 5.017 et aux voies métaboliques KEGG à l'aide de BlastKOALA18,19,20,21. L'enrichissement dans les voies COG et KEGG a été établi en utilisant le génome de P482 comme référence (JHTS00000000.1), avec le test exact de Fisher appliqué pour déterminer la signification statistique (p <0, 05; valeur p ajustée, correction B – H). La mise en réseau de gènes et l'enrichissement en grappes ont été analysés à l'aide de STRING 11.5 (mai 2023)22, avec le génome de P. donghuensis HYS comme référence11.

Les données RNAseq ont été validées par RT-qPCR en utilisant six cibles avec différents modèles d'expression : BV82_3254, mexE, norC, ssuC, trpB et ytfE. La transcription inverse et la qPCR en temps réel ont été réalisées comme décrit précédemment23. Les détails de l'amorce sont disponibles dans le tableau S3. La taille des amplicons a été confirmée par électrophorèse sur gel (Fig. S3). L'analyse de l'expression génique a été réalisée à l'aide de qbase + 24. Les gènes de référence appliqués, gyrB et rpoD, ont été choisis sur la base de nos travaux précédents23 et confirmés pour leur stabilité dans l'ensemble de données analysé (moyenne M = 0,543 ; CV = 0,181). L'expression a été adaptée aux échantillons provenant de P482 cultivés dans un milieu 1C sans exsudats (non traités). La signification statistique des différences d'expression a été évaluée à l'aide d'un test t non apparié.

P482 Rif était présent sur les racines de plants de tomates et de maïs âgés de 18 jours cultivés dans le sol à partir de semences inoculées. Sur la base des moyennes arithmétiques, la taille de la population sur les racines de tomate était environ dix fois plus élevée que celle sur les racines de maïs, s'élevant à 1,54 × 107 UFC g−1 sur tomate et 2,35 × 106 UFC g−1 sur maïs (Fig. S4). Lorsque les valeurs médianes ont été prises en compte, la différence était de 25 fois, avec des tailles de population de 8,1 × 106 UFC g−1 et 3,1 × 105 UFC g−1 pour la tomate et le maïs, respectivement. Malgré la différence, la taille des populations de P482 sur les deux plantes peut être considérée comme élevée, ce qui implique que la souche peut s'adapter pour coloniser les deux hôtes.

Le profilage du transcriptome entier a été réalisé pour les cellules P482 cultivées en présence d'exsudats racinaires de tomate ou de maïs (0, 2 mg L-1), qui ont tous deux stimulé la croissance de la bactérie par rapport au milieu 1C seul (Fig. S1A, B). 5168 gènes ont été détectés dans le transcriptome, couvrant 99% de l'ensemble du génome. La fiabilité de la mesure de l'abondance des transcrits par RNAseq a été confirmée à l'aide de la transcription inverse en temps réel qPCR (RT-qPCR) pour des cibles sélectionnées (Fig. S5).

Les exsudats de tomate ont altéré l'expression de 413 gènes (7,99 %) par rapport au milieu non supplémenté. Ceux-ci sont en outre appelés gènes à expression différentielle induits par la tomate (tiDEG). Les exsudats de maïs ont influencé l'expression de 181 gènes (3,51 %), appelés miDEG (deg induits par le maïs) (Fig. 1). Le fait qu'il y avait plus de tiDEG que de miDEGS, et qu'ils avaient une valeur log2FC moyenne plus élevée (2,27 log2FC contre 2,14 log2FC ; Dataset S1), suggère que la réponse de P482 aux exsudats de tomate était plus large et plus prononcée que celle de les exsudats de maïs. La question reste ouverte de savoir si cela est lié au fait que le maïs n'est pas l'hôte d'origine de P482. Une échelle de réponse transcriptomique similaire à celle de P482 et de la tomate a été rapportée pour P. aeruginosa PAO1 cultivée dans un milieu CAA additionné d'exsudats de betterave rouge (Beta vulgaris)25. Dans cette dernière étude, visant à identifier des gènes nouveaux et vraisemblablement spécifiques à l'hôte impliqués dans les interactions plante-microbe, les auteurs ont comparé la réponse de PAO1 aux exsudats de deux variétés de betterave, Celt et Roberta, connues pour sélectionner différentes communautés microbiennes. Selon les variétés, 9,30 % et 8,13 % du transcriptome de PAO1 étaient affectés par des exsudats.

Diagramme de Venn illustrant les sous-ensembles de gènes dans les transcriptomes déclenchés par la tomate et le maïs de P. donghuensis P482 (A), et la proportion de gènes régulés à la hausse et à la baisse dans chaque sous-ensemble (B). Les tiDEG (413) et les miDEG (181) ont montré une expression significativement différente en réponse aux exsudats racinaires de la tomate ou du maïs, respectivement, par rapport au milieu non supplémenté (témoin). A l'inverse, les gènes de la réponse différenciante (GDRs, 278), un ensemble entouré d'un trait pointillé, ont montré un changement d'expression significatif entre les deux traitements d'exsudat. Les gènes de réponse partagée (SRG, 63) ont été établis par superposition de miDEG, tiDEG et GDR, et comprennent des gènes affectés par les deux types d'exsudats de manière similaire. Les sous-ensembles supplémentaires résultant de la superposition sont les GDR spécifiques à la tomate (150) et les GDR spécifiques au maïs (34). Ceux-ci répondaient simultanément à deux critères : ils faisaient partie des GDR et en même temps leur expression était significativement différente de celle dans le milieu lorsqu'ils étaient traités avec un seul type d'exsudat. Seuils de signification pour un changement significatif de l'expression : p < 0,05 (padj ; correction B–H) ; log2FC > 1.5. Une liste des lieux dans chaque sous-ensemble peut être trouvée dans l'ensemble de données S6. Dans le panneau B, les gènes régulés positivement sont indiqués en magenta (à gauche) et les gènes régulés négativement sont en bleu (à droite). Le pourcentage de gènes et le nombre réel d'ORF sont indiqués dans les graphiques.

Notre objectif dans cette étude était d'identifier les voies métaboliques qui sont : (1) différentiellement et (2) régulées de manière similaire dans P482 en réponse aux exsudats de tomate et de maïs. Pour ce faire, nous avons déterminé deux pools de gènes au sein du transcriptome : les gènes de la réponse différentielle (GDR) et les gènes de réponse partagée (SRG). Les GDR (278 gènes) sont des gènes dont l'expression est significativement différente entre les deux traitements d'exsudat (Fig. 1 ; Dataset S2). Au contraire, les SGR (63 gènes) montrent des réponses similaires aux exsudats indépendamment de la plante source. La superposition des GDR, tiDEG et miDEG a déterminé le pool de SGR. Cette analyse a également permis de distinguer des sous-ensembles de GDR que nous avons appelés GDR spécifiques à la tomate (150 gènes) et GDR spécifiques au maïs (34 gènes) (Fig. 1 ; Dataset S2). Les gènes des sous-ensembles GDR spécifiques aux plantes répondaient simultanément à deux critères : ils présentaient une expression différente lors des deux traitements à l'exsudat (> 1,5 log2FC, padj < 0,05), ce qui en faisait des GDR, mais leur expression était également significativement différente (> 1,5 log2FC, padj < 0,05) par rapport au milieu 1C lors du traitement avec un seul des exsudats. Les GDR spécifiques à la tomate et au maïs, ainsi que les SGR, ont été analysés pour les gènes régulés à la hausse et à la baisse de premier rang (tableaux S4 à S6). L'établissement de GDR spécifiques aux usines nous a permis d'attribuer certains aspects de la réponse différentielle globale à l'une des usines. Cela a également empêché la sous-déclaration des aspects de la réponse différenciée liés au maïs, étant donné que les exsudats de tomate, avec une part plus importante de GDR, sont le principal moteur des changements globaux.

Le pool complet de 278 GDR (réponse différenciante) et 63 SGR (réponse partagée) a été analysé pour l'enrichissement KEGG et COG et la mise en réseau des gènes (Figs. 2, 3; Datasets S3 – S4). Les résultats les plus intéressants sont présentés et discutés ci-dessous, tandis que quelques voies mineures sont décrites dans SI.

Voies KEGG et catégories COG significativement enrichies dans les réponses transcriptomiques partagées (A, B) et différenciantes (C, D) de P482 aux exsudats racinaires de tomate et de maïs. Pour les gènes individuels au sein des voies : le rouge et le bleu indiquent respectivement une régulation à la hausse et une régulation à la baisse de l'expression génique ; la colonne de gauche montre les changements d'expression (log2FC) lors de l'ajout d'exsudats de tomate (lettre T), et la colonne de droite lors de l'ajout d'exsudats de maïs (lettre M). Catégories KEGG : a—métabolisme des glucides, b—traitement de l'information environnementale, c—métabolisme des acides aminés. Les gènes affichés en caractères gras sont répertoriés dans les voies KEGG enrichies et les COG. Les gènes soulignés se chevauchent entre les catégories au sein des voies KEGG.

Réseau de gènes pour les 63 gènes des gènes partagés (A) et 278 gènes de la réponse transcriptomique de différenciation (B) de P482 aux exsudats des racines des plantes. L'analyse a été réalisée à l'aide de STRING avec le génome de P. donghuensis HYS comme référence, et l'image a été organisée manuellement. Chaque nœud représente un gène de P482 avec un nom attribué avec eggNOG. Les nœuds remplis marquent les gènes qui appartiennent à des groupes enrichis identifiés par STRING (carte—voie KEGG, CL—cluster, GO—ontologie des gènes, PF, IPR—domaines protéiques). Les bords du réseau indiquent la confiance. Interaction basée sur toutes les sources disponibles pour la version 11.5 (mai 2023). Score d'interaction minimale 0,4 (moyen). Les nœuds déconnectés ont été désactivés, à l'exception des gènes qui se sont avérés faire partie de clusters enrichis. Chaque gène peut être associé à une désignation de locus à l'aide du Dataset S5. La liste complète des interactions STRING et des groupes enrichis est fournie dans l'ensemble de données S4.

Les GDR représentaient 5,38 % du transcriptome, avec une part à peu près égale de régulée négativement et de régulée positivement. En comparaison, les SGR représentaient 1,22 % du transcriptome, la plupart d'entre eux étant régulés à la baisse (76 %) (Fig. 1). Par conséquent, le pool de gènes affectés différemment par deux hôtes dans P482 était d'env. 4,5 fois plus grand que le pool de gènes de la réponse partagée. La même chose a été observée pour PAO1 dans deux variétés de betterave25. Dans le cas de plantes hôtes distinctes telles que la tomate et le maïs, il est tentant d'attribuer cet effet aux différences globales liées aux espèces dans la composition des exsudats. Cependant, le fait qu'une tendance similaire ait été observée pour deux variétés d'une même espèce végétale, la betterave rouge, suggère que des changements relativement mineurs dans la composition des composés d'origine végétale peuvent avoir un impact décisif. Conformément à cette hypothèse, il a été démontré que des composés tels que les benzoxazinoïdes et les coumarines exercent à eux seuls un effet profond sur la composition du microbiote associé aux racines26,27.

Les deux traitements à l'exsudat ont provoqué la régulation à la baisse des gènes P482 dans les voies qui se chevauchent pour le «métabolisme du soufre» et les «transporteurs ABC» (Fig. 2a, Tableau 1). Cela comprenait des gènes codant pour les composants CysW et CysA de la sulfate-thiosulfate permease (SulT). Le sulfate et le thiosulfate représentent des sources inorganiques de soufre utilisées par les bactéries28. En l'absence de sulfate inorganique ou de cystéine, les bactéries peuvent utiliser des alcanesulfonates, dont la taurine, comme sources alternatives de soufre28. Dans P482, les deux exsudats ont régulé négativement l'expression de tauBC et ssuBC, impliqués dans l'importation de taurine et d'autres alcanesulfonates. Une influence similaire a été observée pour ssuD et tauD, impliqués dans la libération de soufre de ces composés29. De plus, STRING a permis l'identification d'un autre gène régulé à la baisse éventuellement impliqué dans l'acquisition de soufre dans P482, le sfnR (Fig. 3a). Chez Pseudomonas putida DS1, le sfnR s'est avéré nécessaire pour obtenir du soufre à partir de sulfure de diméthyle (DMS)30.

Les résultats montrent que les deux types d'exsudats diminuent l'expression de plusieurs gènes liés à l'acquisition du soufre. Une régulation à la baisse des gènes ssu, ou des gènes ssu et tau, a également été observée pour 6 des 8 Pseudomonas spp. souches exposées aux exsudats racinaires de l'herbe Brachypodium distachyon31. Des plants de maïs et de tomates pour les expériences P482 et B. distachyon pour les expériences avec d'autres pseudomonades ont été cultivés dans un milieu de Hoagland contenant des sulfates (MgSO4, ZnSO4, CuSO4). Cela pourrait potentiellement influencer la disponibilité du soufre dans les exsudats racinaires des plantes co-cultivées. En revanche, dans les deux études, la cystéine et la méthionine ont été détectées dans les exsudats, qui peuvent être une source de soufre organique pour les bactéries Pseudomonas.

La réponse commune de P482 aux exsudats comprenait une régulation à la hausse de arsC et arsH (tableau 1). Les deux gènes sont liés au métabolisme de l'arsenic, un métalloïde hautement toxique. L'arsenic est omniprésent dans l'environnement, y compris le sol; par conséquent, les bactéries ont développé différents mécanismes pour le traiter32. ArsC est une arséniate réductase transformant l'arséniate pentavalent (As(V)) en arsénite trivalent (As(III)) avant l'efflux d'As(III) de cell33. Le deuxième gène régulé à la hausse dans P482, arsH, confère la résistance de certains micro-organismes aux organoarsenicaux comme les formes trivalentes de l'herbicide monosodique méthylarséniate et le phénylarsénite arsenical aromatique33.

On considère que la plupart des espèces d'arsenic méthylé présentes dans l'environnement sont d'origine microbienne. Certains micro-organismes auraient utilisé des arsenicaux méthylés comme armes contre leurs concurrents microbiens34. Les plantes, contrairement aux microbes, ne méthylent pas les arsenicaux35. Au lieu de cela, ils absorbent les arsenicaux inorganiques du sol sous forme d'arséniate, probablement via les transporteurs de phosphate en raison de la similitude de ces molécules, et ils les extrudent vers le sol via les racines une fois qu'il est réduit en arsénite trivalent36. Nous émettons l'hypothèse que l'expression régulée à la hausse d'arsC et d'arsH dans P482 pourrait avoir été déclenchée par l'arséniate et les organoarsenicaux transférés sur les racines à partir du substrat sableux utilisé pour la croissance de la tomate et du maïs.

L'une des catégories COG enrichies dans la réponse partagée était « Transport et métabolisme des ions inorganiques / Mécanisme de transduction du signal ». Cette catégorie à double fonction était représentée par sept gènes de type fecR (tableau 1). Les protéines FecR sont des capteurs transmembranaires impliqués dans la transduction du signal. Chez Escherichia coli, FecR coopère avec le facteur sigma FecI et la protéine réceptrice FecA pour diriger l'expression de l'opéron fecABCDE impliqué dans l'absorption du citrate ferrique37. Cependant, les espèces bactériennes peuvent héberger de nombreux gènes de type fecR. Dans le génome de P. aeruginosa, il existe quatorze gènes de type fecR situés à côté de facteurs sigma de carence en fer qui peuvent potentiellement être induits en présence de différents porteurs de fer apparentés38. Outre l'utilisation de sidérophores fabriqués par eux-mêmes, les pseudomonades peuvent utiliser ceux produits par d'autres bactéries ou plantes, transférant le coût énergétique de leur production à d'autres organismes39, un phénomène appelé « piratage des sidérophores »40.

Les autres sources de fer que les pseudomonades peuvent utiliser sont les molécules d'hème libérées par les hémoprotéines41. Parmi les SGR de P482, le gène présentant la régulation négative la plus importante codait pour une protéine de la famille A se liant à l'hème (- 6, 8 log2FC) (tableau S6). D'autres gènes impliqués dans l'absorption et le métabolisme de l'hème ont également été régulés à la baisse. Ceux-ci comprenaient : hasR, hemO, hmuU et hmuV, et hasD (tableau 1).

Pour mieux comprendre comment l'ajout d'exsudats racinaires a influencé la disponibilité du fer à P482 dans nos expériences, nous avons étudié les niveaux d'expression de 3 gènes : BV82_1009, une synthase de type NRPS impliquée dans la synthèse du puissant sidérophore pyoverdine ; BV82_1008, (pvdS), un facteur sigma impliqué dans la régulation de la synthèse de la pyoverdine, et BV82_4709 impliqué dans la synthèse de la 7-hydroxytropolone, un composé aux propriétés ferreuses et antimicrobiennes plus caractéristiques de P. donghuensis11. Les exsudats racinaires n'ont affecté l'expression d'aucun de ces gènes (Dataset S5). L'expression de la pyoverdine n'a également été régulée positivement dans aucune des huit souches de Pseudomonas cultivées dans les exsudats racinaires de B. distachyon31. Dans cette dernière étude, la régulation à la hausse d'autres gènes liés à l'acquisition du fer n'a été observée que pour la moitié de ces souches. Ceux-ci comprenaient: les transporteurs de dicitrate de fer (souches SBW25 et 30–84), la biosynthèse des sidérophores ornicorrugatine (SBW25) et pyocheline (souche Pf-5), les enzymes dégradant l'hème (2–79, 30–84) et les gènes associés à TonB (2–79 et Pf-5). Dans une autre étude, l'expression de gènes liés à l'acquisition de l'hème et à la synthèse de pyoverdine chez P. protegens CHA0 était relativement faible en réponse au blé par rapport à celle observée lors de l'infection d'insectes42.

Contrairement à la régulation à la baisse des gènes d'acquisition du fer, les exsudats racinaires de la tomate et du maïs ont significativement régulé à la hausse l'expression du gène de la bactérioferritine bfr impliqué dans l'homéostasie intracellulaire du fer. Bfr fonctionne dans le stockage du fer qui, lorsqu'il est présent en excès sous forme libre, peut provoquer un stress oxydatif dans les cellules par la génération d'espèces réactives de l'oxygène43. La bactérioferritine et les protéines interagissant avec le Bfr se sont avérées essentielles pour la résistance au stress et la virulence chez les agents pathogènes végétaux et animaux44,45. Ils jouent également un rôle dans les symbiotes végétaux nodulant les racines46.

La régulation à la hausse de Bfr dans P482 est une autre prémisse indirecte selon laquelle les exsudats racinaires seuls ne limitent pas le fer pour P482 et au moins certains autres pseudomonades. Cependant, il est hautement probable que le P482 aurait besoin d'employer ses mécanismes de piégeage du fer en présence de concurrents microbiens.

Lors de l'exposition de P482 aux deux exsudats, nous avons observé une expression plus élevée de tagQ, pppA et crp. Chez P. aeruginosa, tagQ et pppA sont impliqués dans la cascade régulatrice qui contrôle l'activation du système de sécrétion de type VI (T6SS), pppA étant considéré comme un régulateur négatif de T6SS47. Le troisième gène, crp, code pour une protéine de type récepteur de l'AMP cyclique. Les rapports sur le rôle de la Crp dans la régulation du T6SS sont rares et concernent Vibrio cholerae où la Crp a été suggérée comme étant un régulateur positif du T6SS48. Dans l'ensemble, nos résultats suggèrent que la présence d'exsudats racinaires a un certain impact sur le T6SS chez P482 cultivé en monoculture. Cependant, la direction de cet impact nécessite des études complémentaires. Nous pouvons également supposer que l'expression des gènes liés au T6SS serait différente en présence de (micro)organismes concurrents. Le T6SS permet aux bactéries d'injecter des protéines dans d'autres cellules procaryotes ou eucaryotes et est surtout connu pour son rôle dans la compétition interbactérienne49.

Le P482 traité à la tomate a montré les symptômes du stress causé par l'oxyde nitrique (autrement appelé stress nitrosatif). L'oxyde nitrique est une molécule librement diffusible qui exerce des effets toxiques sur les cellules. Pour contrer le stress nitrosatif, les bactéries ont développé plusieurs voies pour convertir le NO en molécules non nocives comme le N2O, le NO3− ou l'ammoniac50. L'un des deux gènes avec la régulation à la hausse la plus importante dans P482 était le hmp (BV82_4743) codant pour la flavohémoglobine (Hmp). L'expression de ce gène a été fortement augmentée (6,13 log2FC) dans P482 cultivé dans des exsudats de tomate mais pas de maïs. Dans des conditions aérobies, le Hmp catalyse la réaction du NO avec l'oxygène pour donner du nitrate (NO3−)51. Un schéma similaire de changements dans l'expression génique a été observé dans norD, norC et norB codant pour l'oxyde nitrique réductase (NOR). Cette enzyme intégrée à la membrane catalyse la réduction du monoxyde d'azote (NO) en protoxyde d'azote (N2O)52. Hmp et NOR sont des composants bien documentés du mécanisme de détoxification du NO chez les bactéries.

Le NO agissant sur une cellule bactérienne peut provenir de l'environnement ou être généré par les cellules elles-mêmes. Le NO est un intermédiaire connu dans une réduction progressive du nitrate, par le nitrite, en oxyde d'azote53. Ce processus, appelé dénitrification, peut être effectué par certaines bactéries Pseudomonas sous une disponibilité limitée en oxygène pour surmonter le manque d'oxygène en tant qu'accepteur terminal d'électrons dans la respiration54. La formation de NO à partir de nitrite dans la deuxième étape de dénitrification nécessite l'activité de NirS, une nitrite réductase périplasmique du cytochrome cd1 portant les cofacteurs de l'hème c et de l'hème d155. P. donghuensis P482 possède un homologue de nirS (BV82_3250) et des homologues de plusieurs autres gènes du groupe nir (nirCFLGHNBDJM). Chez P482 traité avec des exsudats de tomate, la régulation à la hausse des gènes de détoxification du NO ne s'est pas accompagnée de l'induction de gènes nir. Par conséquent, la cause sous-jacente de l'activation des voies de détoxification du NO dans le P482 n'est pas une dénitrification de commutation, mais plutôt la gestion de la toxicité du NO exogène présent dans les exsudats de tomate.

Les effets délétères du NO résultent principalement de l'inactivation des protéines contenant des amas de fer-soufre (Fe-S)56,57. Les clusters Fe-S sont des cofacteurs protéiques redox-actifs présents dans presque tous les organismes et nécessaires à de nombreux processus biochimiques fondamentaux58. Dans le P482 traité à la tomate, nous avons observé une régulation à la hausse importante de yftE (6,36 log2FC), connue pour son rôle dans le métabolisme/réparation des clusters Fe-S. Des homologues de ytfE sont présents dans de nombreuses bactéries59, et le gène est constamment régulé à la hausse lors de l'exposition bactérienne au NO60. Il a été démontré que la protéine YftE contribuait à la survie de Yersinia pseudotuberculosis dans la rate suite à un stress nitrosatif et contribuait à la virulence de ce pathogène humain57. Un autre gène dont l'expression a été significativement induite par les exsudats de tomate est le nnrS (BV82_3241). NnrS est une protéine transmembranaire contenant de l'hème et du cuivre qui contribue à la tolérance au stress du NO chez Vibrio cholerae en soulageant le stress causé par la formation de complexes fer-NO61. Il convient de noter que les gènes yftE et nnrS forment un seul groupe de gènes (BV82_3238 à BV82_3246) avec les gènes codant pour NOR et deux régulateurs : norR et dnr. La souche sur les clusters Fe-S causée dans P482 par les exsudats de tomate est en outre confirmée par la régulation à la hausse des gènes iscR, iscS, iscU, iscA, hscB, hscA et fdx (Fig. 3b) codant pour des protéines liées à la biogenèse des clusters de soufre62.

Les hôtes eucaryotes peuvent produire de l'oxyde nitrique dans le cadre de la défense pendant l'infection63. Les plantes utilisent le NO comme molécule signal en réponse au stress biotique et abiotique et à un large éventail de processus physiologiques, notamment la germination, le développement, la floraison et la sénescence64. Le NO étant hautement réactif, il est stocké dans des S-nitrosothiols (SNO), qui agissent comme des réservoirs de NO in vivo64. Le NO joue un rôle dans la réponse des plantes aux pathogènes microbiens mais est également crucial pour établir des interactions symbiotiques entre les rhizobiums et les légumineuses65. Il a été suggéré que le NO pourrait être une molécule de signalisation essentielle dans la communication entre les plantes et les microbes64. Dans le cas de P482, il est important de noter que la présence apparente de facteurs provoquant un stress nitrosatif dans les exsudats de tomate n'a pas influencé négativement le taux de croissance de P482 in vitro (Fig. S1). Cela implique que P482 est bien adapté pour faire face aux conditions rencontrées.

Les pseudomonades possèdent une chaîne respiratoire ramifiée. Cinq oxydases terminales différentes sont connues pour opérer dans P. aeruginosa, permettant à la bactérie d'exploiter une chaîne de transport d'électrons mieux adaptée dans des circonstances données54. Dans P482, en réponse aux exsudats de tomate mais pas de maïs, nous avons observé une régulation négative des gènes ccoN, ccoO, ccoQ et ccoP codant les sous-unités d'une cytochrome c oxydase de type cbb3. Cette oxydase a une forte affinité pour l'oxygène et est vitale pour la survie des cellules dans des conditions microaérobies66. Contrairement aux gènes cco, cioA et cioB codant pour l'oxydase insensible au cyanure (CIO) du cytochrome bd ont été régulés positivement. Les micro-organismes qui peuvent passer à la voie CIO peuvent résister à de fortes concentrations de cyanure d'hydrogène, qui bloque la respiration par les cytochrome c oxydases67. La souche P482 est capable de produire du cyanure d'hydrogène68. Cependant, chez P482 exposé aux exsudats de tomate, les gènes hcnA et hcnB codant pour la synthase de cyanure d'hydrogène ont été régulés à la baisse, ce qui implique que l'expression régulée à la hausse du cytochrome bd insensible au cyanure dans cette souche ne se produit pas pour contrer la toxicité de niveaux élevés de cyanure d'hydrogène auto-produit. .

Bien que les gènes cio aient été initialement associés à une résistance bactérienne au cyanure d'hydrogène, d'autres facteurs peuvent affecter leur expression. Le cytochrome bd insensible au cyanure joue un rôle lors de la limitation du cuivre dans des conditions aérobies69 et confère une tolérance bactérienne au stress oxydatif et nitrosatif70. De plus, cioA a été impliqué dans l'évasion des défenses de l'hôte par Pseudomonas sp. WCS365 lors d'une interaction avec l'Arabidopsis thaliana71.

Nous émettons l'hypothèse qu'un déplacement vers le cytochrome bd (CIO) dans le P482 traité avec des exsudats de tomate est dû à la présence d'inhibiteurs du complexe cytochrome bc1 et/ou d'oxyde nitrique. Le complexe cytochrome bc1 est nécessaire pour transmettre les électrons aux oxydases du cytochrome c comme cbb3, mais pas au CIO qui reçoit les électrons directement de l'ubiquinone54,72. L'effet bactéricide des inhibiteurs de bc1 a été grandement renforcé par l'ajout simultané de donneurs de NO dans Mycobacterium tuberculosis, un effet que les bactéries ont tenté de contrecarrer en passant à la voie du cytochrome bd73. La cytochrome bd oxydase est plus résistante à l'inhibition du NO en raison de la vitesse de dissociation rapide du NO de son site actif.

Le métabolisme intermédiaire du P482 était principalement affecté par les exsudats de la tomate. Trois voies KEGG qui se chevauchent ont été enrichies au sein d'une réponse de différenciation : « métabolisme du pyruvate », « métabolisme du propanoate » et « dégradation de la valine, de la leucine et de l'isoleucine ». Ceux-ci partagent des gènes avec des COG enrichis liés à la «production et conversion d'énergie» (Fig. 2c, d).

Les exsudats de tomate ont régulé positivement l'expression de lpdV, bkdB, bkdA2 et pdhA (tableau 1). Les produits protéiques de ces gènes sont les composants du complexe alpha-céto déshydrogénase à chaîne ramifiée, l'un des trois complexes multienzymatiques métabolisant le pyruvate, le 2-oxoglutarate et les acides 2-oxo à chaîne ramifiée. La fonction globale de ces complexes est la conversion des acides alpha-céto en acyl-CoA et CO2. Les alpha-cétoacides sont souvent issus de la désamination oxydative des acides aminés, et réciproquement, ils sont les précurseurs de leur synthèse74. La 2-oxoisovalérate déshydrogénase codée par bkdA2 et pdhA est une enzyme participant à la dégradation des acides aminés à chaîne ramifiée (BCAA) : valine, leucine et isoleucine75. Dans P482, nous avons observé une régulation positive simultanée de mmsA et mmsB. Chez P. aeruginosa, l'opéron mmsAB est impliqué dans le métabolisme de la valine, et la perturbation de ces gènes conduit à une croissance prolongée de la souche sur le milieu valine/isoleucine76. Chez certaines bactéries, la disponibilité des BCAA semble avoir des fonctions régulatrices et joue un rôle dans des processus tels que la prolifération au cours de l'infection et l'évasion des défenses de l'hôte78. Contrairement à ce que nous avons observé pour P482 en présence d'exsudats de tomate, S. typhimurium et E. fredii ont régulé à la hausse la synthèse de BCAA, et non leur catabolisme, lorsqu'ils sont exposés aux exsudats de laitue et de maïs en culture intercalaire, respectivement79,80.

Outre les BCAA, le catabolisme de trois autres acides aminés semble être induit dans le P482 lors du traitement de l'exsudat de tomate. Cela comprenait la phénylalanine (gènes phhA, phhB et phhC), la glycine (gcvH et gcvP) et la méthionine (aceE/mdeB, mdeA) (tableau 1).

D'autres modifications métaboliques du P482 associées à un catabolisme accru des acides aminés et/ou des acides gras comprennent la régulation à la hausse des acyl-CoA déshydrogénases MmgC et Ivd, catalysant l'α,β-déshydrogénation des esters d'acyl-CoA81 et la régulation à la hausse de l'aceA codant pour l'isocitrate lyase, ce dernier impliquant l'activation du shunt du glyoxylate (GS). De nombreuses bactéries activent la GS lorsque l'acétyl-CoA, dérivé du catabolisme des acides aminés ou des acides gras, est la principale source de carbone et d'énergie disponible pour la cellule82. Le cycle classique de l'acide tricarboxylique (TCA) ne peut pas assimiler le carbone et recycler le citrate lorsque l'acétyl-CoA est la seule source de carbone disponible en raison de la perte de CO2 et de l'incapacité de recycler l'oxaloacétate. Le GS contourne les étapes de production de dioxyde de carbone du TCA et détourne une partie du flux de carbone vers l'isocitrate. Outre son rôle essentiel dans le métabolisme de l'acétate et des acides gras, le shunt du glyoxylate pourrait jouer un rôle encore peu exploré dans la défense contre le stress et la pathogenèse. L'expression d'aceA dans P. aeruginosa a été régulée positivement sous un stress oxydatif induit par H2O2 et dans des conditions limitant le fer et est liée à l'homéostasie intercellulaire du fer72. Cette voie métabolique est également centrale pour la croissance et la virulence de P. aeruginosa lors de l'infection lorsque la bactérie montre une préférence pour le catabolisme des acides gras83. De plus, il a été démontré que le shunt du TCA et le passage à l'utilisation d'acides aminés augmentaient la résistance aux antibiotiques chez P. aeruginosa84. Fait intéressant, la GS a été activée dans l'agent pathogène humain Salmonella lorsqu'elle a été cultivée avec des exsudats de laitue79.

Ici, nous avons analysé le contenu initial de l'exsudat (description détaillée en SI). L'analyse LC-SRM de la teneur relative en acides aminés dans les exsudats de maïs et de tomate a montré que la valine et la leucine BCAA étaient environ 4 fois plus abondantes dans les exsudats de maïs que dans la tomate, la teneur en isoleucine était égale dans les deux échantillons (tableau S7) . La quantité de phénylalanine et de tryptophane était respectivement 4,5 et 2,3 fois plus élevée dans le maïs que dans la tomate. L'abondance de méthionine dans les deux exsudats ne différait pas. Par conséquent, il n'est pas vrai que les acides aminés, dont le catabolisme est régulé positivement dans le P482 traité avec des exsudats de tomate, soient plus abondants dans ce traitement. Dans notre dispositif expérimental, l'influence de la supplémentation en exsudat sur P482 a été évaluée dans un milieu minimal contenant du glucose. Cela a fait du glucose la source de carbone la plus abondante dans les traitements et le contrôle. Une approche similaire a été appliquée dans l'étude sur l'influence des exsudats de B. distachyon sur différents Pseudomonas spp.31. Il est possible que le P482, dans les cultures avec des exsudats de tomate, ait épuisé le glucose plus rapidement que dans les échantillons supplémentés au maïs. Par conséquent, au moment de la récolte, les cellules traitées à la tomate utiliseraient déjà des acides aminés pour soutenir leur croissance. Une analyse non ciblée par RMN 1H a révélé que le glucose, bien que très abondant dans les exsudats de maïs (9947 ng mg-1), n'était pas présent dans les exsudats de tomate (Tableau S8, Figs. S6, S7). Cependant, on peut se demander si la quantité de glucose ajoutée avec les exsudats serait suffisante pour avoir un tel impact sur la disponibilité totale du glucose dans le milieu 1C.

Nous proposons qu'un passage au catabolisme des acides aminés dans le P482 traité à la tomate vise à augmenter la résistance des cellules aux facteurs de stress d'une manière similaire à celle rapportée pour P. aeruginosa dans des modèles d'infection humaine83,84. La présence de NO, causant des dommages aux clusters Fe-S dans les centres actifs de certaines enzymes, peut compromettre certaines voies métaboliques. Dans un tel cas, le changement observé dans le métabolisme intermédiaire du P482 ne serait pas motivé par une préférence pour des sources de carbone spécifiques et leur disponibilité dans les exsudats, mais plutôt par le choix de voies métaboliques moins sensibles au facteur de stress particulier. Les facteurs de stress d'origine végétale peuvent être spécifiques à une espèce ou liés à l'état physiologique d'une plante donnée. La justesse de cette hypothèse nécessite des études complémentaires.

En présence d'exsudats de tomate, l'expression des gènes codant pour la tryptophane synthase, trpA et trpB, était significativement régulée à la baisse, ce qui implique une synthèse réduite du tryptophane par P482. Le tryptophane est un acide aminé aromatique protéinogène qui peut également être un précurseur de molécules de signalisation telles que l'hormone végétale acide indole-3-acétique (IAA), la kynurénine et le signal Pseudomonas quinolone (PQS)85. Au contraire, nous avons observé une augmentation significative de metE (4,73 log2FC). MetE est un 5-méthyltétrahydroptéroyltriglutamate, une homocystéine S-méthyltransférase qui catalyse le transfert d'un groupe méthyle du 5-méthyltétrahydrofolate à l'homocystéine entraînant la formation de méthionine. Les gènes liés à la synthèse de la méthionine ont été régulés positivement chez E. coli après un traitement avec du S-nitrosoglutathion dans des conditions imitant le stress nitrosatif. Dans cette dernière étude, les mutants d'E. coli perturbés dans la voie de synthèse de la méthionine présentaient une tolérance réduite au S-nitrosoglutathion et que l'ajout de méthionine exogène pourrait abroger cet effet86. Cela suggère que la méthionine pourrait également jouer un rôle dans la lutte contre le stress nitrosatif dans P482.

De plus, la synthèse de la méthionine était essentielle pour établir la symbiose entre Sinorhizobium meliloti fixateur d'azote et sa plante hôte, Medicago sativa87. Contrairement à ce que nous avons observé chez P482 en présence d'exsudats racinaires de tomate, la synthèse de méthionine a été diminuée chez PAO1 en réponse aux exsudats de betterave25 et chez S. typhimurium en réponse aux exsudats de laitue79. Cela suggère que le rôle de la synthèse de méthionine dans les bactéries associées aux plantes dépend du système plante-microbe étudié.

Dans le contexte de la façon dont la synthèse et le catabolisme des acides aminés sont affectés dans le P482 traité à la tomate, il convient de mentionner que ceux-ci peuvent également avoir des causes moins simples. Chez P. fluorescens, la phénylalanine 4-hydroxylase (PAH) est impliquée non seulement dans le catabolisme de la phénylalanine mais également dans la biosynthèse de la mélatonine antioxydante à partir du tryptophane88,89. Il a également été démontré que le tryptophane, la méthionine, la tyrosine et la phénylalanine, les précurseurs bien connus des métabolites secondaires des plantes, peuvent contribuer à augmenter la résistance des plantes90. On peut supposer que le P482, en dégradant la phénylalanine, en réduisant la synthèse du tryptophane et en équilibrant les niveaux de méthionine, peut essayer de contrecarrer et d'influencer ce qu'"il interprète" comme la réponse immunitaire de la plante.

Les exsudats de maïs ont provoqué la régulation à la hausse de trois sous-unités de protéine de fusion membranaire (MFP) des exportateurs de RND : mexE, BV82_1337 et BV82_1618. L'expression de mexE était particulièrement régulée positivement (4,12 log2FC). RND signifie superfamille de pompes à efflux Resistance-Nodulation-Division. Les pompes à efflux de la superfamille RND et les protéines Omp forment des complexes protéiques qui permettent aux bactéries Gram-négatives d'exporter des médicaments nocifs directement à l'extérieur de la cellule et non, comme dans le cas d'autres systèmes d'efflux, dans l'espace périplasmique. Cela fait des pompes à efflux RND des déterminants importants de la multirésistance91. Chez P. aeruginosa, plusieurs opérons d'efflux confèrent une résistance intrinsèque de la bactérie aux antibiotiques, l'opéron mexE contenant mexEF-oprN conférant une résistance aux quinolones, au chloramphénicol et au triméthoprim92. Cependant, il est probable que la résistance aux antibiotiques de synthèse ne soit qu'un effet secondaire de la résistance aux métabolites secondaires naturels. Il a été démontré que l'expression de smeDEF était déclenchée par des flavonoïdes d'origine végétale et que l'inactivation de la pompe par suppression de smeE altérait la capacité de Stenotrophomona maltophilia à coloniser les racines du colza93. Il est donc plausible que la surexpression de mexE dans P482 en réponse aux exsudats de maïs soit impliquée dans la lutte contre la présence de certains métabolites secondaires spécifiques à cette plante hôte. Conformément à l'effet spécifique à l'hôte, seuls certains transporteurs RND, et non tous, ont été induits en présence de maïs. La régulation à la hausse de czcA et mdtA, codant également pour les pompes à efflux RND, a été entraînée par la tomate (tableau 1). Le maïs et d'autres graminées (Poacées) sont connus pour produire et sécréter des benzoxazinoïdes biocides, des composés ayant un rôle établi dans la formation du microbiome de la plante27,94. Il semble utile d'étudier si les transporteurs RND jouent un rôle dans la tolérance de certaines bactéries aux benzoxazinoïdes.

Les deux exsudats ont régulé positivement l'expression de copA et copZ dans P482. Cependant, l'induction de ces gènes était beaucoup plus élevée en réponse au maïs (tableau 1). CopA est une ATPase transmembranaire responsable de l'efflux des ions Cu+ délivrés par le chaperon cytoplasmique CopZ. Les deux protéines sont des éléments de systèmes de tolérance Cu+ bien caractérisés95. Le cuivre est un oligo-élément essentiel pour tous les organismes ; cependant, il est toxique en excès96. Le cuivre sous forme de CuSO4 est un ingrédient du milieu de croissance des plantes de Hoagland, utilisé dans cette étude pour cultiver à la fois la tomate et le maïs. Par conséquent, le fait que la réponse de tolérance au cuivre soit tellement plus robuste dans les exsudats de maïs que dans la tomate doit être causé par des facteurs dépendant de l'hôte affectant soit la disponibilité soit la toxicité du cuivre. Mavrodi et ses collaborateurs31 ont montré une régulation à la hausse considérable d'un ou plusieurs gènes cop liés à la tolérance au cuivre chez 5 des 8 pseudomonades étudiées traitées avec les exsudats de B. distachyon. Le maïs et B. distachyon sont des graminées Monocot, et les deux ont été cultivés à Hoagland pour les expériences respectives.

Dans P482, les exsudats de maïs ont provoqué une régulation positive de BV82_2809 codant pour FimV, une protéine impliquée dans l'assemblage des pili de type IV. Les pili de type IV sont impliqués dans l'adhérence, certains types de mouvement (un glissement social chez Myxococcus xanthus et des contractions chez les espèces Pseudomonas et Neisseria), et la formation de biofilm, l'invasion tissulaire guidée et d'autres événements liés à la pathogenèse97. Les pili de type IV sont essentiels à la colonisation endophyte du riz par l'endophyte fixateur de N2 Azoarcus sp. souche BH7298. Fait intéressant, pilK, impliqué dans la motilité des contractions, a été régulé à la baisse chez P. aeruginosa en réponse aux exsudats de betterave25, ce qui suggère que les exsudats de betterave ont un effet négatif sur la formation de pili chez P. aeruginosa, par opposition à l'effet stimulant des composés du maïs chez P. donghuensis.

Les exsudats de maïs ont provoqué une expression régulée à la hausse de fliS dans P482, suggérant une synthèse accrue de flagelles liés à la natation. Les flagelles sont indispensables à certaines souches de Pseudomonas pour coloniser efficacement leurs hôtes. P. fluorescens F113 avec un gène fliS perturbé était immobile et incapable de rivaliser avec la souche de type sauvage (WT) pour coloniser l'extrémité racinaire de la luzerne99.

Contrairement aux cellules traitées au maïs, la régulation à la hausse des gènes liés à la synthèse des pili et des flagelles n'a pas été observée dans le P482 traité avec des exsudats de tomate. Au contraire, les exsudats de tomate ont régulé à la hausse l'expression d'un régulateur négatif présumé de l'opéron maître flagellaire flhDC dans le locus BV82_3459. Il a été montré que bien que les flagelles puissent apporter un avantage aux cellules, leur synthèse peut également entraîner certains inconvénients. La reconnaissance d'antigènes flagellaires spécifiques peut induire une réponse d'hypersensibilité et la mort cellulaire dans le cadre de la réponse immunitaire de l'hôte100. Une diminution de la synthèse des flagelles est considérée comme un mécanisme majeur pour échapper à l'immunité des plantes101. Des études sur P. putida KT2440 concernant les compromis métaboliques de la production de flagelles ont montré qu'une souche mutante non flagellée présente une phase de latence plus courte et est plus résistante aux stress oxydatifs que la souche WT. Il a été suggéré que l'absence de dépense métabolique pour la production de flagelles pourrait fournir aux cellules un surplus d'énergie (ATP) et réduire la puissance (NADPH) que les cellules peuvent allouer à d'autres activités, y compris la résistance au stress102. Il semble donc que les avantages d'avoir une expression plus faible des gènes flagellaires l'emportent sur les inconvénients potentiels de fitness dans P482 traité avec des exsudats de tomate. Les exsudats de tomate ont également régulé à la baisse deux gènes codant pour les protéines du domaine de signalisation de la chimiotaxie acceptant le méthyle (MCP), qui fonctionnent comme les chimiorécepteurs prédominants chez les bactéries et les archées103.

Pris ensemble, les exsudats de maïs ont augmenté l'expression des fonctions liées à la motilité dans P482, alors que l'inverse a été observé en réponse aux exsudats de tomate. Il reste à élucider si ces différences sont liées à l'importance variable de la motilité dans la colonisation de ces deux hôtes, ou plutôt c'est l'état physiologique de la tomate prélevée pour les exsudats dans notre étude qui a rendu l'expression de ces gènes défavorable.

Comprendre les interactions plantes-microbes est une exigence clé pour exploiter le potentiel des microbes pour soutenir la santé des plantes. L'étude de ces interactions dans toute la complexité des systèmes naturels reste techniquement difficile. Par conséquent, les configurations simplifiées qui isolent les interactions sélectionnées continuent d'aider à obtenir des informations précieuses31,104. Ici, nous avons identifié quels aspects du métabolisme de P. donghuensis P482 sont différemment affectés par les exsudats racinaires de deux plantes hôtes différentes : la tomate et le maïs (Fig. 4). La composition des exsudats testés, et donc leur influence sur le P482, sont très probablement le résultat à la fois du génotype des plantes prélevées et de leur état physiologique. Nous concluons que le catabolisme des acides aminés à chaîne ramifiée passe au shunt du glyoxylate, la résistance à l'oxyde nitrique, l'utilisation flexible de la chaîne respiratoire, la synthèse de la méthionine et l'activation sélective des pompes à efflux de type RND méritent une attention particulière en termes de rôle dans la façon dont la racine promiscuité Les Pseudomonades colonisatrices s'adaptent à différents hôtes végétaux et comment elles restent associées lorsqu'elles sont confrontées à un changement de l'état physiologique de l'hôte.

Réponses transcriptomiques partagées et spécifiques à l'hôte de P. donghuensis P482 aux exsudats de tomate et de maïs. Les flèches rouges pointant vers le haut indiquent la régulation à la hausse d'une voie, tandis que les flèches bleues pointant vers le bas indiquent la régulation à la baisse.

Une grande attention concernant l'assemblage du microbiome est consacrée à l'attraction entre les microbes et la plante. Contrairement à cette tendance, la plupart des voies spécifiques à l'hôte que nous avons décrites dans P482 sont liées à la résistance au stress. Malgré cela, les exsudats ont stimulé et n'ont pas inhibé la croissance de P482. Une plus grande résilience de certains microbes à des facteurs de stress particuliers peut entraîner des changements dans les populations microbiennes associées aux plantes, en particulier chez les plantes ayant des réponses au stress activées. Parallèlement au comportement social humain, ne pas être dérangé par les explosions de son partenaire peut être un facteur sous-estimé pour décider si l'on décide de rester.

Les lectures de séquençage brutes pour cette étude sont disponibles dans la base de données de lecture de séquençage NCBI (PRJNA868728). Les fichiers d'analyse génétique différentielle ont été déposés dans NCBI Gene Expression Omnibus (GSE211040).

Reinhold-Hurek, B., Bünger, W., Burbano, CS, Sabale, M. & Hurek, T. Racines façonnant leur microbiome : Points chauds mondiaux pour l'activité microbienne. Annu. Rev. Phytopathol. 53, 403–424. https://doi.org/10.1146/annurev-phyto-082712-102342 (2015).

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Nous tenons à remercier le professeur Steven E. Lindow (Université de Californie-Berkeley, Berkeley, CA, États-Unis) pour sa précieuse contribution à l'amélioration du manuscrit et sa discussion utile, le professeur associé R. Czajkowski (IFB UG & MUG, Gdansk, Pologne) pour ses commentaires utiles sur la version quasi finale, et Tomasz Krzyżanowski (spécialiste informatique, Varsovie, Pologne) pour avoir écrit un script permettant d'extraire des données des fichiers GenBank. Nous apprécions également grandement la contribution des examinateurs anonymes.

Cette recherche a été financée par le National Science Center (Pologne), projet n° 2017/25/B/NZ9/00513 à S. Jafra.

Laboratoire de microbiologie végétale, Faculté intercollégiale de biotechnologie UG et MUG, Université de Gdańsk, ul. A. Abrahama 58, 80-307, Gdańsk, Pologne

Dorota M. Krzyżanowska, Magdalena Jablonska & Sylwia Jafra

Laboratoire de biochimie structurale, Faculté de chimie, Université de Gdańsk, ul. Wita Stwosza 63, 80-308, Gdansk, Pologne

Zbigniew Kaczynski & Małgorzata Czerwicka-Pach

Laboratoire de spectrométrie de masse, Faculté intercollégiale de biotechnologie UG et MUG, Université de Gdańsk, ul. A. Abrahama 58, 80-307, Gdańsk, Pologne

Catherine Macur

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DMK a coordonné le travail expérimental, participé à la collecte des exsudats et des cultures de plantes, traité les exsudats pour les analyses, réalisé des cultures bactériennes, l'isolement de l'ARN, la RT-qPCR, l'expérience de colonisation des racines, l'enrichissement fonctionnel et les analyses de mise en réseau des données RNAseq, préparé toutes les figures et tableaux, et rédigé le manuscrit. MJ a fait pousser des plantes dans des conditions gnotobiotiques et a aidé à la collecte des exsudats. ZK a effectué des mesures RMN. MCP a effectué une GC-MS. KM a effectué l'analyse de la teneur en acides aminés par LC-SRM. SJ a conçu l'étude, acquis des fonds, supervisé et coordonné le projet et révisé le manuscrit. Tous les auteurs ont revu le manuscrit.

La correspondance est Sylwia Jafra.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

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Réimpressions et autorisations

Krzyżanowska, DM, Jabłońska, M., Kaczyński, Z. et al. Traits d'adaptation à l'hôte chez le Pseudomonas donghuensis P482 colonisateur de plantes révélés par des réponses transcriptomiques aux exsudats de tomate et de maïs. Sci Rep 13, 9445 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-36494-6

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Reçu : 24 janvier 2023

Accepté : 05 juin 2023

Publié: 09 juin 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s41598-023-36494-6

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