Enzyme

Rapports scientifiques volume 13, Numéro d'article : 312 (2023) Citer cet article

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Le pyridoxal-5′-phosphate (PLP) est un cofacteur polyvalent qui participe à différents types de réactions enzymatiques. Il a également été rapporté que le PLP réagissait avec des substrats et catalysait certaines de ces réactions indépendamment des enzymes. Une de ces réactions catalytiques est la dégradation de la cystéine pour produire du sulfure d'hydrogène (H2S) en présence d'ions métalliques multivalents. Cependant, l'activité catalytique indépendante de l'enzyme du PLP dans le catabolisme de la cystéine en l'absence d'ions multivalents est inconnue. Dans cette étude, nous montrons que le PLP réagit avec la cystéine pour former un produit thiazolidine, qui est soutenu par des calculs de chimie quantique du spectre d'absorption. La réaction du PLP avec la cystéine dépend de la force ionique et du pH. Le produit thiazolidine se décompose lentement pour produire du H2S et le PLP se régénère en sa forme active avec des temps de réaction plus longs (> 24 h), suggérant que le PLP peut agir comme un catalyseur. Nous proposons un mécanisme de réaction plausible indépendant de l'enzyme pour la dégradation de la cystéine catalysée par le PLP pour produire du H2S, qui passe par la formation d'intermédiaires du cycle thiazolidine qui s'hydrolyse ensuite lentement pour régénérer le PLP. Ce travail démontre que le PLP catalyse la dégradation de la cystéine en l'absence d'enzymes, de bases et d'ions métalliques multivalents pour produire du H2S.

Découvert en 1942 par Snell et al. le pyridoxal-5′-phosphate (PLP) est la forme métaboliquement active de la vitamine B6. C'est l'un des cofacteurs les plus polyvalents pour les enzymes qui catalysent une multitude de réactions avec les acides aminés1. Le PLP en tant que cofacteur est utilisé dans près de 4 % de toutes les activités enzymatiques2. Les enzymes PLP-dépendantes catalysent les transaminations, les racémisations, les décarboxylations, les substitutions et éliminations α, β et γ, les transaldolations, les condensations de Claisen et, plus récemment, les désaminations oxydatives en présence d'acides aminés3. Fait intéressant, le PLP est également capable de catalyser certaines de ces réactions de manière indépendante des enzymes. Les transaminations, les substitutions α, β et les décarboxylations avec des acides aminés sont catalysées par le PLP et les ions métalliques multivalents de manière non enzymatique dans des solutions aqueuses4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, bien qu'elles aient également été signalées. lentement sans ions métalliques12. Par exemple, le PLP en l'absence d'enzymes subit une transamination lente lorsqu'il est chauffé avec des acides aminés pour produire de la pyridoxamine4. Ces études ont conclu que le groupe aldéhyde du PLP agit comme site actif et réagit facilement et de manière réversible avec les acides aminés pour former des bases de Schiff, qui, selon d'autres conditions de réaction, réagissent davantage pour former des produits. Étant donné que le PLP génère ces produits indépendamment de l'enzyme, il est important de comprendre l'interaction directe du PLP avec les acides aminés essentiels.

Le rôle catalytique indépendant de l'enzyme du PLP sur la réaction avec la cystéine en l'absence d'ions métalliques multivalents n'a pas encore été exploré. En effet, il a été largement rapporté que la réaction du PLP avec la cystéine forme un produit stable, un cycle thiazolidine, par condensation13,14,15,16,17. Les premières études ont conclu que la formation du cycle thiazolidine se déroule en trois étapes: premièrement l'ajout du groupe amine de la cystéine sur le groupe aldéhyde du PLP, deuxièmement l'élimination de l'eau pour former une base de Schiff aldiminique et troisième fermeture du cycle (Fig. 1A) . Le cycle thiazolidine a été rapporté comme étant stable pendant plus de 24 h, cependant, des études plus longues n'ont pas été rapportées15. Alternativement, le groupe thiol de la cystéine peut également réagir avec le groupe aldéhyde du PLP pour former un intermédiaire hémimercaptal ou mercaptal17. Fait intéressant, lorsque des dérivés de cystéine tels que les cystéines S-(phényle p-substitué) ont été mis à réagir avec du PLP dans des conditions légèrement alcalines, ils subissent des éliminations α, β pour produire de l'ammoniac, du pyruvate et des analogues S-(phényle p-substitué) et le Le PLP est régénéré (Fig. 1B). Cela a confirmé le rôle catalytique du PLP dans la dégradation de la cystéine S-substituée dans des conditions légèrement alcalines18,19.

Mécanisme de réaction proposé de l'interaction chimique indépendante de l'enzyme du PLP avec la cystéine. (A) Mécanisme de formation du cycle thiazolidine avec PLP et cystéine en l'absence d'une base et d'ions métalliques. La formation de la base de Schiff est une étape intermédiaire. (B) Mécanisme du comportement catalytique du PLP en réaction avec des cystéines S-substituées dans des conditions légèrement alcalines. Le PLP est régénéré produisant des analogues S-substitués, de l'ammoniac et du pyruvate.

Récemment, Hine et al. ont étudié le rôle non enzymatique du PLP dans la décomposition de la cystéine pour produire du sulfure d'hydrogène (H2S) en présence d'ions métalliques trivalents9. L'H2S endogène est principalement produit à partir de la cystéine et de l'homocystéine par des enzymes telles que la cystathionine-β-synthase (CBS), la cystathionine-γ-lyase (CGL) et la 3-mercaptopyruvate sulfur-transférase (3-MST) avec le PLP comme cofacteur20. Le H2S est un nutriment essentiel pour le corps et les déficiences dans la production enzymatique endogène de H2S ou l'activité de CBS, CGL et 3-MST sont associées à plusieurs effets néfastes sur la santé, notamment des troubles neurodégénératifs21,22. Ainsi, l'étude du rôle catalytique indépendant des enzymes du PLP dans la dégradation de la cystéine devient imminente pour évaluer sa capacité à sauver les déficiences enzymatiques potentielles responsables de la progression des troubles neurodégénératifs.

La littérature actuelle sur le rôle catalytique indépendant de l'enzyme du PLP dans le métabolisme de la cystéine manque d'enquête sur cette interaction dans des conditions physiologiques. Le rôle catalytique du PLP en présence d'une base ou d'ions métalliques multivalents est bien établi, cependant, le comportement catalytique dépendant du temps du PLP en l'absence des deux doit être déterminé pour une compréhension holistique des interactions du PLP avec la cystéine. Par conséquent, dans cette étude, nous avons étudié les interactions du PLP avec la cystéine dans des conditions physiologiques. La spectroscopie RMN 1H et UV-Vis a été utilisée pour suivre l'évolution de la réaction. Une chromatographie sur papier a été réalisée pour suivre l'évolution du gaz H2S produit. Des calculs de chimie quantique ont été effectués sur les intermédiaires probables pour prédire leur absorption UV-Vis et comparés aux données expérimentales.

Différents intermédiaires de la réaction PLP avec la cystéine sont supposés dans la littérature13, 14, 15, 16, 17, qui comprend la formation d'une base de Schiff, d'un hémimercaptal et d'une structure de thiazolidine à cycle fermé (Fig. 2A). Ces différents produits potentiels de PLP-Cys ont été étudiés par spectroscopie RMN 1H et UV-Vis.

Spectre zoomé 1H-RMN du mélange réactionnel molaire 1: 1 de PLP et (A) cystéine, (B) S-méthylcystéine (SMC) et (C) N-acétylcystéine (NAC) dans D2O réagi à 37 ° C pendant 2 h . La base de Schiff est formée avec la réaction du PLP et du SMC. Le proton aldiminique d'une base de Schiff est observé à δ ≈ 8 ppm. L'hémimercaptal se forme avec la réaction du PLP et du NAC. Le proton énolique de l'hémimercaptal est observé à δ ≈ 6,5 ppm. La présence de base de Schiff, d'hémimercaptal et de cycle thiazolidine (δ = 6,05, 6,10 ppm) est observée avec la réaction du PLP et de la cystéine.

Dans le cas de la spectroscopie 1H-RMN, le PLP et la cystéine ont été mis à réagir dans de l'eau deutérée (D2O) à 37 ° C dans un rapport molaire de 1: 1 pendant 2 h. La version agrandie du spectre 1H-RMN est illustrée à la Fig. 2A (spectre complet à la Fig. S1). Le PLP présente une tautomérie céto-énol au-dessus de pH 5 grâce à sa fraction aldéhyde dont l'α-hydrogène (4) est observé à δ = 10,4 ppm et celui de la forme énol du PLP (4 ') est observé à δ = 6,45 ppm (Fig. S2 )23. Le PLP lors de la réaction avec la cystéine présente deux nouveaux pics qui apparaissent à δ = 6,05 ppm et 6,10 ppm correspondant au proton méthine (z) du mélange racémique du cycle thiazolidine formé avec le PLP et la cystéine24. Un troisième nouveau pic (x) a été observé à δ = 8,09 ppm qui peut correspondre au proton aldiminique de la base de Schiff formé entre le PLP et la cystéine. Aucun pic correspondant aux produits intermédiaires n'a été observé lorsque le PLP et la cystéine ont réagi à un rapport molaire de 1:10, à la place, des pics pour le cycle thiazolidine ont été observés (Fig. S3). Pour confirmer la position du proton aldiminique, et donc la formation de la base de Schiff, le PLP et la S-méthylcystéine (SMC), un analogue de la cystéine qui n'a pas de thiol libre pour la fermeture du cycle, ont réagi de manière similaire. Cette réaction a produit un nouveau pic (x) à δ = 8,05 ppm qui correspond au proton aldiminique de la base de Schiff formé entre SMC et PLP (Fig. 2B, spectre complet sur la Fig. S4). SMC et PLP forment une base de Schiff en 2 h de temps de réaction, comme observé par le déplacement du maximum d'absorbance dans le spectre UV-Vis du mélange réactionnel de 388 nm, transitions généralement attribuées au groupe aldéhyde, à 401 nm (Fig. S5 ). Par conséquent, le pic apparaissant à δ ≈ 8 ppm pour la réaction PLP-cystéine est attribué à la présence de la structure de base de Schiff. Alternativement, la cystéine peut également réagir avec le PLP par la formation d'un hémimercaptal (Fig. 2A) 17, ce qui est possible par l'interaction de la paire d'électrons isolés sur le soufre avec le proton énolique du PLP. Un petit pic d'épaule (y) a été observé à δ = 6, 49 ppm sur la figure 2A, ce qui suggère la possibilité de la formation d'un hémimercaptal. Pour confirmer la formation d'un hémimercaptal, le PLP et la N-acétylcystéine (NAC), un analogue de la cystéine qui a un thiol libre pour la formation de l'hémimercaptal mais pas une amine libre pour la formation de la base de Schiff, ont été mis à réagir et un nouveau pic (y) a été observé à δ = 6,47 ppm qui correspond au proton énolique de l'hémimercaptal formé entre NAC et PLP (Fig. 2C, spectre complet sur la Fig S6). Aucun changement dans l'intensité du pic de PLP à 388 nm dans le spectre UV-Vis n'a été observé après réaction du NAC et du PLP pendant 2 h (Fig. S7). Pour s'assurer que l'amine secondaire du NAC ne forme pas de base de Schiff produisant le nouveau pic à δ = 6,47 ppm, le PLP et la N-acétylméthionine (NAM), un analogue de la cystéine sans amine libre ni thiol, ont été mis à réagir et aucun nouveau pic n'a été observé après 2 h de réaction confirmant la position du proton hémimercaptal à δ ≈ 6,47 ppm (Fig. S8). Sur la base de ces observations, nous pouvons proposer que la réaction de la cystéine et du PLP dans l'eau entraîne la formation des trois produits : la structure cyclique de la thiazolidine, la base de Schiff et l'hémimercaptal.

L'interaction du PLP avec la cystéine dans des conditions physiologiques de force ionique et de température a été déterminée par spectroscopie d'absorption. Le PLP et la cystéine ont été mis à réagir dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) à 37 ° C pendant 2 h. Pour déterminer les produits de réaction potentiels à partir d'expériences, le spectre UV – Vis des produits potentiels a été calculé par ordinateur (coordonnées xyz pour les structures de la Fig. S9) avec la théorie fonctionnelle de la densité hybride.

Le spectre d'absorption PLP calculé (Fig. 3A) est caractérisé par une forte réponse optique dans la gamme UV avec des pics dominants à 228 nm et 392 nm. Des pics moins intenses apparaissent à 205 nm et 250 nm. La transition HOMO – LUMO pour le PLP est calculée à 2, 33 eV ou 532 nm correspondant à un transfert de densité électronique du groupe phosphate au groupe aromatique (Fig. S10A). Au pic d'intérêt (392 nm), les orbitales de transition naturelles montrent la redistribution des états de densité électronique dans le groupe aromatique (Fig. 3A). Le spectre expérimental de la solution PLP dans du PBS présente deux pics dominants à 225 nm et 388 nm, ce qui correspond bien au spectre calculé (Fig. 3A). Le spectre expérimental a également un pic d'épaule à 328 nm, qui est absent du spectre calculé. Ce pic supplémentaire pourrait être attribué à des états d'équilibre zwitterioniques supplémentaires de PLP25,26,27 Outre le pic d'épaulement, le spectre expérimental est bien reproduit dans les calculs. Étant donné que le PLP peut présenter une tautomérie céto-énol par le biais de sa fraction aldéhyde au-dessus de pH 5, le spectre UV – Vis pour la forme énol du PLP a également été calculé (Fig. S11). Le spectre calculé a des pics dominants à 451 nm, 290 nm et 223 nm. Les pics calculés ne correspondent pas aux données expérimentales et suggèrent donc que le PLP n'existe que sous forme d'aldéhyde dans des conditions physiologiques de force ionique et de température.

Comparaison des spectres d'absorption expérimentaux (lignes pleines) et calculés (lignes bleues pointillées) pour (A) PLP, (B) PLP-cystéine Schiff base et (C) PLP-cystéine thiazolidine structures annulaires. Le côté gauche de chaque panneau montre la structure moléculaire et le côté droit de chaque panneau montre les orbitales de transition naturelle au pic d'intérêt. Le spectre expérimental de PLP correspond bien au spectre calculé. Le spectre expérimental de la réaction PLP-cystéine après 2 h dans du PBS correspond à la formation de la structure thiazolidine et non à la base de Schiff.

Le spectre d'absorption calculé pour la base PLP-Cys Schiff (Fig. 3B) présente des pics dominants à 441 nm et 387 nm, qui produisent ensemble un pic gaussien à 428 nm. Plusieurs pics moins intenses dans la plage de 201 à 262 nm renforcent le large pic gaussien à 203 nm. La transition HOMO – LUMO pour la structure de base PLP-Cys Schiff est calculée comme étant de 1, 46 eV ou 849 nm correspondant à un transfert de densité électronique du groupe phosphate vers le groupe aromatique et la cystéine connectée à la base de Schiff (Fig. S10B). Au pic d'intérêt (441 nm), les orbitales de transition naturelles montrent la redistribution des états de densité électronique dans le groupe aromatique ainsi que le transfert du groupe acide carboxylique à la structure aldimine (Fig. 3B). De même, le spectre d'absorption calculé pour la structure de thiazolidine PLP-Cys (Fig. 3C) présente des pics dominants à 333 nm et 212 nm. Plusieurs pics moins intenses dans la plage de 204 à 220 nm renforcent le large pic gaussien à 210 nm. La transition HOMO – LUMO pour la structure de la thiazolidine PLP-Cys est calculée à 2, 49 eV ou 497 nm correspondant à un transfert de densité électronique du groupe phosphate vers les groupes aromatiques et thiophène (Fig. S10C). Au pic d'intérêt (333 nm), les orbitales de transition naturelles montrent la redistribution des états de densité électronique dans le groupe aromatique ainsi que le transfert vers le groupe thiophène (Fig. 3C).

Le spectre expérimental pour le mélange de cystéine PLP dans du PBS présente un pic large à 203 nm avec un pic d'épaulement à 220 nm et un deuxième pic dominant à 333 nm avec un pic d'épaulement à 294 nm. La présence d'un pic à 333 nm et l'absence de toute absorption au-dessus de 400 nm suggèrent que soit le PLP et la cystéine ne forment pas de base de Schiff, soit la base de Schiff est instable et se cyclise rapidement pour former le cycle17. Fait intéressant, les données expérimentales correspondent au spectre d'absorption de la thiazolidine PLP-Cys calculé. Le pic d'épaule à 294 nm n'est pas prédit et pourrait être attribué à des états d'équilibre zwitterioniques décalés de PLP.

Les résultats de la spectroscopie RMN 1H et UV-Vis ainsi que les spectres d'absorption calculés confirment la présence du cycle thiazolidine avec la réaction PLP-Cys. De même, la formation d'hémimercaptal est étayée par la spectroscopie 1H-RMN. Cependant, il est intéressant de noter que la structure aldiminique de base de Schiff est observée avec la spectroscopie RMN où le solvant était D2O, mais pas avec la spectroscopie UV-Vis où le solvant était PBS. Cela pourrait être dû à des différences dans la concentration des réactifs, la force ionique du solvant ou le pH sous lequel la base de Schiff est instable et se cyclise rapidement pour former le cycle thiazolidine17. Différentes concentrations de PLP ont été utilisées car une concentration de PLP inférieure à 10 mM n'est pas détectable dans le spectre 1H-RMN et une concentration supérieure à 0, 1 mM a saturé le signal UV-Vis à 388 nm, qui est le pic d'intérêt. Pour vérifier la formation de différents intermédiaires entre le PLP et la cystéine, des mélanges réactionnels de PLP et de cystéine dans de l'eau déminéralisée et du PBS ont été analysés par LC/MS. Une très faible abondance d'ions intermédiaires de masses compatibles avec la base PLP-Cys Schiff, le cycle thiazolidine et l'hémimercaptal a été observée (Fig. S12). Le signal pour la base de PLP-Cys Schiff n'était pas significativement plus élevé que le contrôle. Bien que la présence de ces intermédiaires soit cohérente avec la spectroscopie RMN et UV-Vis, il convient de noter que les signaux LC/MS détectés n'étaient pas assez forts pour confirmer la formation de ces intermédiaires. Les intermédiaires peuvent ne pas être stables dans la colonne ou en phase gazeuse lors de l'analyse MS, d'autant plus que la phase mobile était acide : 0,1 % d'acide formique (95 % dans l'eau et 5 % dans l'acétonitrile).

L'interaction en fonction du temps du PLP avec la cystéine a été étudiée à l'aide de la spectroscopie UV-Vis. Le PLP et la cystéine ont été mis à réagir dans du PBS à 37°C dans le rapport molaire de 1:10 pendant 14 jours. Leur spectre d'absorbance a été obtenu pour surveiller la réaction (Fig. 4A). Le spectre d'absorbance pour le PLP à pH = 7,2 montre un maximum à 388 nm comme discuté ci-dessus28. Après l'ajout de cystéine, l'absorption à 388 nm diminue immédiatement suggérant la formation de structures hémimercaptales et thiazolidinées17. Ce pic disparaît complètement en 2 h suggérant que le groupe aldéhyde du PLP a complètement réagi avec la cystéine et formé un cycle thiazolidine avec une augmentation du pic observée à 333 nm. Le spectre UV-Vis montre la même tendance jusqu'à 24 h de temps de réaction avec une absorption plus forte pour le cycle thiazolidine, ce qui est en accord avec la littérature15. Cependant, à 24 ha, un petit pic apparaît à 388 nm, correspondant au groupe aldéhyde du PLP. L'intensité du pic à 388 nm augmente avec le temps (7 et 14 jours) avec une diminution concomitante du pic de la thiazolidine à 333 nm. Cette inversion suggère que le cycle thiazolidine est reconverti en sa forme PLP. Des analogues de S-(phényle p-substitué) ont été observés comme sous-produit lorsque des cystéines S-(phényle p-substitué) ont été mises à réagir avec du PLP dans des conditions légèrement alcalines régénérant le PLP18. Par conséquent, nous proposons que le PLP fonctionne comme un catalyseur faible pour cataboliser la cystéine en l'absence d'ions métalliques pour former du sulfure d'hydrogène (H2S).

(A) Spectre UV-Vis de l'interaction chimique entre le PLP et la cystéine dans des conditions physiologiques surveillées à 0 h, 2 h, 24 h et 14 jours. (B) Production de H2S à partir de la réaction du PLP et de la cystéine dans de l'eau DI, des composants individuels du PBS et du PBS à 37 oC et 24 h. La production de H2S est 9 fois plus élevée dans le PBS que dans l'eau DI.

Pour vérifier la capacité du PLP à catalyser la dégradation de la cystéine pour produire du H2S, nous avons effectué une chromatographie sur papier (dosage à l'acétate de plomb) pour détecter la production de gaz H2S comme l'un des sous-produits. Il faut noter que moins de 20% de l'H2S produit est en phase gazeuse à pH physiologique29,30. La réaction du PLP et de la cystéine dans des conditions physiologiques dans du PBS a généré près de 70 µM de H2S en 24 h (Fig. 4B). Aucune production de H2S n'a été observée en l'absence de PLP (Fig. S13A). Fait intéressant, l'évolution du H2S était de 8,8 µM lorsque la réaction a été effectuée dans de l'eau désionisée (DI) (Fig. 4B). Le PBS a un pH de 7,4 et est composé de 137 mM de chlorure de sodium (NaCl), 2,7 mM de chlorure de potassium (KCl), 8 mM d'hydrogénophosphate disodique (Na2HPO4) et 2 mM de dihydrogénophosphate de potassium (KH2PO4). La réaction du PLP et de la cystéine en présence de chacun des sels a généré individuellement près de 7,6 µM de H2S avec 137 mM de NaCl, 58,9 µM de H2S avec 8 mM de Na2HPO4 et 11,1 µM de H2S avec 2 mM de KH2PO4, en 24 h. Ces résultats suggèrent que la présence de Na2HPO4 dans le PBS est un contributeur majeur à la production de H2S. C'est peut-être parce que Na2HPO4 dans l'eau est modérément basique (pH 8,86) et libère un ion hydroxyde formant de l'acide phosphorique. L'ion hydroxyde libéré peut servir de base pour extraire le proton α de la base PLP-Cys Schiff (discutée sur la figure 5) et faire avancer la réaction pour produire du H2S. Étant donné que la dégradation de la cystéine catalysée par le PLP est accélérée en milieu basique18, la production de H2S devrait augmenter en présence de conditions légèrement alcalines. De plus, la solution de PLP dans des conditions alcalines présente une couleur jaune plus foncée, comme on le voit avec la solution de PLP dans du PBS par rapport à la solution de PLP dans de l'eau DI (Fig. S13B)28.

Mécanisme de réaction plausible proposé pour la dégradation catalysée par le PLP indépendant de l'enzyme de la cystéine pour produire du H2S dans des conditions physiologiques en l'absence de métal.

Après 14 jours de temps de réaction, le pic d'absorbance du groupement thiazolidine à 333 nm diminue et celui du groupement aldéhyde à 388 nm augmente proportionnellement. Cela suggère que le PLP, en plus de produire du H2S dans des conditions physiologiques, est capable de se régénérer lentement pour se comporter comme un catalyseur. Ces résultats démontrent que le PLP peut fonctionner comme un catalyseur pour la dégradation de la cystéine pour produire du H2S dans des conditions physiologiques. Plus important encore, nous montrons, pour la première fois, que le PLP catalyse la dégradation de la cystéine en l'absence (i) d'enzymes, (ii) de bases et (iii) d'ions métalliques pour produire du H2S.

Sur la base de nos résultats et de la littérature, nous proposons un mécanisme de réaction plausible pour la décomposition de la cystéine catalysée par le PLP dans du PBS pour produire du H2S, comme présenté à la Fig. La voie de production de H2S doit passer par le mécanisme d'ouverture de cycle. En l'absence d'enzymes, de bases et d'ions métalliques, le cycle thiazolidine peut s'ouvrir par hydrolyse (Fig. S14)31. Comme présenté sur la figure 5, l'hydrolyse du cycle peut se dérouler via l'attaque de l'eau sur le groupe azote chargé positivement de I pour générer l'ion hydronium qui attaque le soufre sur le cycle de II, provoquant l'ouverture du cycle et formant probablement une base de Schiff. III. Étant donné que la base de Schiff est très instable17, les molécules d'eau ou les bases faibles peuvent extraire le proton α du méthine activé de la cystéine de III et générer un ion hydronium et une structure quinonoïde IV. Cette structure quinonoïde peut alors se stabiliser par β-élimination du groupement thiol pour former V et générer H2S. La structure V formée peut alors se décomposer pour former de l'ammoniac et du pyruvate pour régénérer le PLP VI. Ces intermédiaires ou sous-produits de réaction n'ont pas été observés avec la spectroscopie RMN 1H ou UV-Vis et nécessiteront une enquête plus approfondie.

Nous avons montré pour la première fois que le PLP catalysait la dégradation de la cystéine en l'absence (i) d'enzymes, (ii) de bases et (iii) d'ions métalliques pour produire du H2S dans des conditions physiologiques. Le PLP réagit complètement avec la cystéine pour former un cycle thiazolidine dans les 2 h suivant la réaction. La formation de l'anneau a été observée par spectroscopie RMN 1H et UV-Vis. Les spectres UV-Vis obtenus par calcul ont aidé à confirmer la formation de la structure cyclique de la thiazolidine entre le PLP et la cystéine. L'observation directe de la base de Schiff et de la formation d'hémimercaptal entre la cystéine et le PLP n'a pas été rapportée auparavant. Le cycle thiazolidine se décompose lentement pour générer 70 µM H2S en 24 h. Fait intéressant, moins de H2S (8,8 µM) a été produit dans l'eau désionisée, ce qui suggère un rôle dominant de la force ionique et du pH. Au-delà de 24 h, des signes de régénération de PLP sont observés avec la spectroscopie UV-Vis. Cela suggère que le PLP, en plus de produire du H2S dans des conditions physiologiques, est capable de se régénérer lentement pour se comporter comme un catalyseur. Sur la base des preuves spectroscopiques et informatiques fournies, un mécanisme de réaction plausible a été proposé pour la catalyse PLP. Cette étude chimique de la catalyse PLP indépendante des enzymes est importante en raison de sa pertinence biologique dans la production de H2S, qui est un nutriment essentiel pour le corps et sa carence endogène est associée à plusieurs effets néfastes sur la santé.

L'hydrate de pyridoxal-5′-phosphate (PLP), la L-cystéine (Cys), l'hydrogénophosphate disodique (Na2HPO4) et le dihydrogénophosphate de potassium (KH2PO4) ont été obtenus auprès d'Alfa Aesar (MA, USA). L'oxyde de deutérium (D2O), la N-acétylcystéine (NAC), la N-acétylméthionine (NAM), le chlorure de sodium (NaCl) et l'acétate de plomb (II) trihydraté ont été obtenus auprès de Sigma-Aldrich (MO, USA). La S-méthylcystéine (SMC) a été obtenue auprès de TCI America (OR, USA). Tous les produits chimiques ont été utilisés sans autre purification.

Spectroscopie par résonance magnétique nucléaire (RMN) 20 mM de PLP et 20 mM de Cys dans D2O ont été mélangés dans un tube RMN et placés dans un incubateur à 37 °C. La spectroscopie 1H-RMN a été utilisée pour contrôler les produits de réaction. Le spectromètre Bruker 400 MHz (MA, USA) a été utilisé pour enregistrer les spectres 1H-RMN dans D2O avec 16 balayages. Une expérience similaire a été réalisée en utilisant respectivement du PLP 20 mM et du SMC 20 mM, du NAC 20 mM, du NAM 20 mM pour surveiller leurs produits de réaction.

Spectroscopie UV – Vis Du PLP 0, 1 mM et du Cys 1 mM dans du PBS (pH = 7, 2) préchauffé à 37 ° C ont été mélangés dans une cuvette en quartz. Le spectre d'absorption à l'état fondamental des produits de réaction a été obtenu avec un spectrophotomètre Perkin Elmer Lambda 1050 UV – Vis-NIR (Waltham, MA) et un porte-cuve à température contrôlée à 37 ° C.

Essai de chromatographie sur papier pour la mesure de H2S 1 mM de PLP et 10 mM de Cys dans de l'eau DI ont été mis à réagir dans une plaque de polypropylène à 96 puits dans un incubateur à 37 ° C pendant 24 h. Une expérience similaire a été réalisée avec des réactifs préparés dans du NaCl 137 mM, du Na2HPO4 8 mM, du KHPO4 2 mM et du PBS. Le H2S gazeux dégagé par la réaction a été quantifié à l'aide d'un dosage sur papier d'acétate de plomb. Le test sur papier d'acétate de plomb et son analyse ont été effectués comme indiqué précédemment32.

Étude computationnelle sur les interactions PLP-cystéine Tous les calculs de cette étude ont été effectués avec le code GAMESS (General Atomic and Molecular Electronic Structure System) 2018-R133 en utilisant la théorie fonctionnelle de la densité (DFT) et la fonctionnelle hybride B3LYP34,35,36,37. Un modèle de continuum polarisable standard (PCM) avec de l'eau comme solvant a été utilisé pour tous les calculs. Les coordonnées cartésiennes initiales des molécules ont été obtenues avec Avogadro (un constructeur moléculaire open source et un outil de visualisation)38 et les structures moléculaires à l'état fondamental ont été optimisées avec un ensemble de base 6-311G(d, p). Les calculs de la théorie fonctionnelle de la densité dépendant du temps (TDDFT) pour les molécules à géométrie optimisée ont été exécutés avec des fonctions d'onde Hartree – Fock (RHF) restreintes à coque fermée. Les orbitales de transition naturelle, ainsi que les spectres présentant la force de l'oscillateur en fonction de la longueur d'onde (énergie d'excitation) et la courbe obtenue par un élargissement gaussien (avec une pleine largeur à mi-hauteur de 0,08 eV), ont été acquis avec le logiciel Chemissian.

Chromatographie liquide-spectroscopie de masse La chromatographie liquide-spectroscopie de masse (LC-MS) a été réalisée à l'installation centrale de protéomique et métabolomique du Lerner Research Institute. La métabolomique non ciblée par chromatographie en phase inverse a été réalisée en injectant 4 µL de chaque échantillon sur une colonne Thermo Accucore Vanquish C18 de dimensions 100 × 2,1 mm, granulométrie 1,5 µm (Thermo P/N 27101‐102130) à 60 °C couplée à un Thermo Vanquish UHPLC par gradient d'élution où la phase mobile A est de l'acide formique à 0,1 % dans l'eau et la phase mobile B est de l'acide formique à 0,1 % dans l'acétonitrile. L'Orbitrap Q Exactive HF a fonctionné en modes d'ionisation par électrospray positif et négatif dans différentes séries LC-MS sur une plage de masse de 56 à 850 Da en utilisant la surveillance ciblée des ions sélectionnés (t-SIM) avec MS1 à une résolution de 120 000.

Les auteurs déclarent que toutes les autres données étayant les conclusions de cette étude sont disponibles dans le document et les informations supplémentaires.

Snell, EE & Pearson, PB Effet de la stérilisation à la chaleur sur l'activité de promotion de la croissance de la pyridoxine pour Streptococcus lactis R. Proc. Soc. Exp. Biol. Méd. 51(3), 356–358 (1942).

Article CAS Google Scholar

Percudani, R. & Peracchi, A. La base de données B6 : un outil pour la description et la classification des activités enzymatiques dépendantes de la vitamine B6 et des familles de protéines correspondantes. BMC Bioinform. 10(1), 273 (2009).

Article Google Scholar

Hoffarth, ER, Rothchild, KW & Ryan, KS Émergence de réactions dépendantes de l'oxygène et du phosphate de pyridoxal. FEBS J. 287(7), 1403–1428 (2020).

Article CAS Google Scholar

Snell, EE, Le groupe Vitamine B6. V. L'interconversion réversible du pyridoxal et de la pyridoxamine par des réactions de transamination. Confiture. Chim. Soc. 67(2), 194–197 (1945).

Article CAS Google Scholar

Snell, EE Structure chimique en relation avec les activités biologiques de la vitamine B6. Dans Vitamines & Hormones Vol. 16 (eds Harris, RS et al.) 77–125 (Academic Press, 1958).

Google Scholar

Metzler, DE, Ikawa, M. & Snell, EE Un mécanisme général pour les réactions catalysées par la vitamine B61. Confiture. Chim. Soc. 76(3), 648–652 (1954).

Article CAS Google Scholar

Kalyankar, G. & Snell, EE Décarboxylation catalysée par le pyridoxal des acides aminés. Biochimie 1 (4), 594–600 (1962).

Article CAS Google Scholar

Choi, K.-Y. La désamination oxydative non enzymatique dépendante du PLP des acides aminés induit une synthèse d'alcool plus élevée. Biotechnol. Ing bioprocédés 20(6), 988–994 (2015).

Article CAS Google Scholar

Yang, J. et al. La production de sulfure d'hydrogène non enzymatique à partir de la cystéine dans le sang est catalysée par le fer et la vitamine B(6). Commun. Biol. 2, 194-194 (2019).

Article Google Scholar

Braunstein, AE Phosphate de pyridoxal. Enzymes 2, 113–184 (1960).

Google Scholar

Zabinski, RF & Toney, MD Inhibition par les ions métalliques de la décarboxylation et de la transamination catalysées par le phosphate de pyridoxal non enzymatique. Confiture. Chim. Soc. 123(2), 193–198 (2001).

Article CAS Google Scholar

Metzler, DE & Snell, EE Certaines réactions de transamination impliquant la vitamine B61. Confiture. Chim. Soc. 74(4), 979–983 (1952).

Article CAS Google Scholar

Heyl, D., Harris, SA et Folkers, K. La chimie de la vitamine B6. VI. Pyridoxylaminoacides1. Confiture. Chim. Soc. 70(10), 3429–3431 (1948).

Article CAS Google Scholar

Matsuo, Y. Formation de bases de Schiff de phosphate de pyridoxal. Réaction avec les ions métalliques1. Confiture. Chim. Soc. 79(8), 2011-2015 (1957).

Article CAS Google Scholar

Buell, MV & Hansen, RE Réaction du pyridoxal-5-phosphate avec des aminothiols. Confiture. Chim. Soc. 82(23), 6042–6049 (1960).

Article CAS Google Scholar

Bergel, F. & Harrap, KR Interaction entre les groupes carbonyle et les substituants biologiquement essentiels. Partie III. La formation d'un dérivé de thiazolidine en solution aqueuse à partir de phosphate de pyridoxal et de L-cystéine. J. Chem. Soc. (Reprise) 789, 4051–4056 (1961).

Article Google Scholar

Mackay, D. Le mécanisme de la réaction de la cystéine avec le pyridoxal 5′-phosphate. Cambre. Biochimie. Biophys. 99(1), 93–100 (1962).

Article CAS Google Scholar

Yukito, M. & Hiroki, K. Catalyse pyridoxale dans l'α, β-élimination des S-(phényle p-substitué)cystéines. Taureau. Chim. Soc. Jpn. 48(1), 125–129 (1975).

Article Google Scholar

de Marco, C. & Rinaldi, A. Élimination α-β catalysée par le phosphate de pyridoxal de la lanthionine et de la cystathionine. Cambre. Biochimie. Biophys. 140(1), 19–22 (1970).

Article Google Scholar

Kabil, O. & Banerjee, R. Enzymologie de la biogenèse, de la désintégration et de la signalisation du H2S. Antioxydant. Signal redox 20(5), 770–782 (2014).

Article CAS Google Scholar

Paul, BD et al. Le déficit en cystathionine γ-lyase médie la neurodégénérescence dans la maladie de Huntington. Nature 509(7498), 96–100 (2014).

Article ADS CAS Google Scholar

Hine, C., Zhu, Y., Hollenberg, AN & Mitchell, JR Régulation alimentaire et endocrinienne de la production endogène de sulfure d'hydrogène : implications pour la longévité. Antioxydant. Signal redox 28(16), 1483–1502 (2018).

Article CAS Google Scholar

Farrant, RD, Walker, V., Mills, GA, Mellor, JM & Langley, GJ Désactivation du phosphate de pyridoxal par l'acide pyrroline-5-carboxylique. Risque accru de carence en vitamine B6 et de convulsions dans l'hyperprolinémie de type II. J. Biol. Chim. 276(18), 15107–15116 (2001).

Article CAS Google Scholar

Muche, S., Müller, M. & Hołyńska, M. Synthèse, caractérisation et structure cristalline de l'acide (2RS,4R)-2-(2-hydroxy-3-méthoxyphényl)thiazolidine-4-carboxylique. J. Mol. Structure. 1155, 65–71 (2018).

Article ADS CAS Google Scholar

Limbach, H.-H. et coll. Liaisons hydrogène critiques et états de protonation du pyridoxal 5′-phosphate révélés par RMN. Biochim. Biophys. Acta BBA Proteins Proteomics 1814(11), 1426–1437 (2011).

Article CAS Google Scholar

Gamov, GA, Khokhlova, AY, Gushchina, AS, Grazhdan, KV & Sharnin, VA Équilibres protolytiques et tautomères de la pyridoxine dans l'éthanol aqueux. J. Chem. Thermodyn. 97, 322–330 (2016).

Article CAS Google Scholar

Gamov, GA, Zavalishin, MN, Khokhlova, AY & Sharnin, VA Influence du diméthylsulfoxyde aqueux sur la protonation et la tautomérisation de la pyridoxine. J. Mol. Liquide. 221, 457–462 (2016).

Article CAS Google Scholar

Peterson, EA & Sober, HA Préparation de dérivés phosphorylés cristallins de la vitamine B6. Confiture. Chim. Soc. 76(1), 169-175 (1954).

Article CAS Google Scholar

Mishanina, TV, Libiad, M. & Banerjee, R. Biogenèse d'espèces soufrées réactives pour la signalisation par les voies d'oxydation du sulfure d'hydrogène. Nat. Chim. Biol. 11(7), 457–464 (2015).

Article CAS Google Scholar

Hartle, MD & Pluth, MD Un guide pratique pour travailler avec H(2)S à l'interface de la chimie et de la biologie. Chim. Soc. Rév. 45(22), 6108–6117 (2016).

Article CAS Google Scholar

Fife, TH, Natarajan, R., Shen, CC et Bembi, R. Mécanisme d'hydrolyse de la thiazolidine. Ouverture de cycle et hydrolyse des dérivés 1,3-thiazolidine du p-(diméthylamino)cinnamaldéhyde. Confiture. Chim. Soc. 113(8), 3071–3079 (1991).

Article CAS Google Scholar

Hine, C. & Mitchell, JR Point final ou mesure cinétique de la capacité de production de sulfure d'hydrogène dans les extraits de tissus. Bio Protocole. 7(13), e2382 (2017).

Article Google Scholar

Barça, GMJ et al. Développements récents dans le système de structure électronique atomique et moléculaire général. J. Chem. Phys. 152(15), 154102 (2020).

Article ADS CAS Google Scholar

Becke, AD Thermochimie fonctionnelle de la densité. III. Le rôle de l'échange exact. J. Chem. Phys. 98(7), 5648–5652 (1993).

Article ADS CAS Google Scholar

Lee, C., Yang, W. & Parr, RG Développement de la formule de corrélation-énergie de Colle-Salvetti en une fonctionnelle de la densité électronique. Phys. Rév. B 37(2), 785–789 (1988).

Article ADS CAS Google Scholar

Vosko, SH, Wilk, L. & Nusair, M. Énergies de corrélation électronique liquide dépendantes du spin précises pour les calculs de densité de spin locale : une analyse critique. Peut. J.Phys. 58(8), 1200–1211 (1980).

Article ADS CAS Google Scholar

Stephens, PJ, Devlin, FJ, Chabalowski, CF & Frisch, MJ Calcul ab initio des spectres d'absorption vibratoire et de dichroïsme circulaire à l'aide de champs de force fonctionnels de densité. J.Phys. Chim. 98(45), 11623–11627 (1994).

Article CAS Google Scholar

Hanwell, MD et al. Avogadro : un éditeur chimique sémantique avancé, une plateforme de visualisation et d'analyse. J. Cheminform. 4(1), 17 (2012).

Article CAS Google Scholar

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Les auteurs reconnaissent le soutien financier de la Puzzitelio Family Foundation, de la Barney Family Foundation, du Center for Transformative Nanomedicine et des fonds de démarrage du Lerner Research Institute. CC a été en partie soutenu par le soutien de la recherche de premier cycle et des efforts créatifs de la Case Western Reserve University. Les auteurs remercient le Dr Belinda Willard et Rebecca Williams du Metabolomic Core of Cleveland Clinic pour l'analyse LC-MS des mélanges PLP-cystéine. Les auteurs remercient également Alan Chen pour la préparation des échantillons pour l'analyse LC-MS. Toutes les opinions, constatations, conclusions ou recommandations exprimées ici sont celles des auteurs et ne reflètent pas nécessairement les points de vue des organismes de financement.

Département de génie biomédical, Institut de recherche Lerner, Cleveland Clinic, Cleveland, OH, 44195, États-Unis

Prajakatta Mulay, Cindy Chen et Vijay Krishna

Département de génie biomédical, Cleveland Clinic Lerner College of Medicine, Case Western Reserve University, Cleveland, OH, 44106, États-Unis

Vijay Krishna

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PM, CC et VK ont conçu l'idée, conçu les expériences et analysé les données. CC et PM ont effectué la spectroscopie UV-Vis et les expériences d'acétate de plomb/sulfure de plomb. PM a effectué les expériences et l'analyse RMN. VK a effectué les calculs de chimie quantique. PM, CC et VK ont rédigé le manuscrit.

Correspondance à Vijay Krishna.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

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Réimpressions et autorisations

Mulay, P., Chen, C. & Krishna, V. Catabolisme indépendant des enzymes de la cystéine avec le pyridoxal-5′-phosphate. Sci Rep 13, 312 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-022-26966-6

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Reçu : 05 août 2022

Accepté : 22 décembre 2022

Publié: 06 janvier 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s41598-022-26966-6

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