Vésicules extracellulaires du Gram - Coastwise Ventures Group Co., Ltd.

npj Biofilms et Microbiomes volume 9, Numéro d'article : 30 (2023) Citer cet article

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Le microbiote intestinal est désormais bien connu pour affecter le système immunitaire de l'hôte. Une voie de communication bactérienne avec les cellules hôtes se fait via la sécrétion de vésicules, de petites structures membranaires contenant diverses cargaisons. Les recherches sur les vésicules sécrétées par les bactéries intestinales à Gram positif, leurs mécanismes d'interaction avec l'hôte et leurs effets immunomodulateurs sont encore relativement rares. Ici, nous avons caractérisé la taille, la teneur en protéines et les effets immunomodulateurs des vésicules extracellulaires (VE) sécrétées par une souche symbiote intestinale humaine Gram-positive nouvellement séquencée - Bifidobacterium longum AO44. Nous avons constaté que les véhicules électriques de B. longum exercent des effets anti-inflammatoires, induisant la sécrétion d'IL-10 à la fois par les splénocytes et les cellules dendritiques (DC) - CD4 + co-cultures de cellules T. En outre, la teneur en protéines des véhicules électriques a montré un enrichissement en transporteurs ABC, en protéines de détection de quorum et en protéines de liaison au soluté extracellulaire, dont il a été précédemment démontré qu'elles avaient une fonction importante dans l'effet anti-inflammatoire d'autres souches de B. longum. Cette étude souligne l'importance des vésicules bactériennes pour faciliter les effets immunomodulateurs des bactéries intestinales sur l'hôte et met en lumière les vésicules bactériennes en tant que futures thérapeutiques.

Au cours des deux dernières décennies, de nombreuses études ont démontré les effets profonds du microbiote intestinal sur la physiologie humaine1,2,3, avec une gamme de fonctions bénéfiques principalement liées à la maturation et à la modulation du système immunitaire3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14. Les bactéries immunomodulatrices ont longtemps été identifiées par nous et d'autres15,16,17,18, mais seules quelques molécules immunomodulatrices dérivées de bactéries ont été caractérisées19,20,21. Les vésicules bactériennes ont gagné en intérêt en tant qu'entité pouvant interagir avec les cellules bactériennes et hôtes22. Les vésicules sont des structures membranaires sécrétées par les bactéries Gram-négatives et Gram-positives. La taille des vésicules varie de 20 à 300 nm et elles transportent diverses cargaisons, notamment des protéines (à la fois membranaires et cytoplasmiques), du peptidoglycane, des acides nucléiques et des toxines, ainsi que des lipopolysaccharides (LPS, chez les bactéries Gram-négatives). Les vésicules interagissent avec les bactéries et les cellules hôtes en internalisant et en libérant leur cargaison. Ces interactions rendent les vésicules idéales pour l'administration moléculaire à longue distance aux bactéries voisines ou aux cellules immunitaires hôtes. En tant que telles, les vésicules bactériennes peuvent être exploitées à des fins thérapeutiques potentielles23. Bien que les vésicules produites par les bactéries Gram-négatives soient étudiées depuis les années 6024, la production de vésicules extracellulaires (VE) par les bactéries Gram-positives a été démontrée 30 ans plus tard25. Bien que découvert dans les années 90, l'intérêt pour la vésiculogenèse et les effets immunomodulateurs des VE à Gram positif a augmenté au cours de la dernière décennie26,27, mais l'accent est mis sur les bactéries pathogènes telles que Staphylococcus aureus28, Mycobacterium tuberculosis29 et Bacillus anthracis30,31. Quelques études ont montré que seules les bactéries Gram-positives métaboliquement actives sécrètent des VE, différentes des bactéries Gram-négatives32,33, cependant, des études récentes suggèrent que les VE sont également sécrétées dans un processus de "mort cellulaire bouillonnante"34. À ce jour, il existe une compréhension limitée des facteurs impliqués dans la régulation génétique de la vésiculogenèse et de l'état membranaire de la bactérie qui permet la libération des VE26,35. Parmi les membres du microbiote intestinal à Gram positif, le genre Bifidobacterium a suscité de l'intérêt car il est connu pour dégrader les oligosaccharides du lait maternel et est très répandu dans le tractus gastro-intestinal des nourrissons allaités36 ainsi que dans les intestins des adultes37. De plus, il a été constaté que les espèces du genre Bifidobacterium affectent à la fois le système immunitaire inné et adaptatif, principalement avec des effets anti-inflammatoires16,38, avec quelques molécules effectrices caractérisées à ce jour39,40. Alors que plusieurs molécules extracellulaires, telles que le Bifidobacterium bifidum pili40 et les exopolysaccharides de Bifidobacterium breve39, se sont avérées induire des effets anti-inflammatoires, les mécanismes par lesquels ces molécules interagissent avec l'hôte ne sont pas entièrement compris. Un membre important du genre Bifidobacterium est Bifidobacterium longum. Cette espèce est très abondante dans l'intestin humain, même parmi les espèces de Bifidobacterium41. B. longum s'est avéré avoir un effet anti-inflammatoire in vitro sur des lignées cellulaires42, in vivo dans des modèles murins43 et, plus important encore, dans des essais cliniques sur les maladies inflammatoires de l'intestin (MICI)44. Ces effets anti-inflammatoires ont été attribués principalement à ses capacités à réduire le stress oxydatif, à réguler négativement la sécrétion de cytokines inflammatoires et à augmenter la teneur en acides gras à chaîne courte (AGCC) dans l'intestin45. Cependant, les mécanismes moléculaires qui sous-tendent ses interactions avec l'hôte et les effets thérapeutiques restent à découvrir. Plusieurs études ont mis en évidence les VE sécrétés par les espèces de Bifidobacterium comme anti-inflammatoires avec une utilisation potentielle comme adjuvants dans le traitement des allergies46,47. Par exemple, il a été constaté que les vésicules de B. bifidum interagissaient avec les cellules dendritiques (CD), suivies d'une différenciation des cellules T régulatrices (T-regs)47. Curieusement, une étude récente a mis en évidence le potentiel des vésicules de B. longum dans le soulagement des allergies alimentaires par l'induction de l'apoptose dans les mastocytes46. Bien que des études sur les effets immunomodulateurs des vésicules des symbiotes intestinaux Gram-négatifs et Gram-positifs commencent à émerger26, seules quelques-unes ont découvert les molécules et les mécanismes sous-jacents à ces effets. De plus, il a été démontré que les véhicules électriques de plusieurs souches de la même espèce induisaient des effets immunomodulateurs distincts avec des mécanismes différents, soulignant le grand potentiel des vésicules dérivées des milliers de souches bactériennes présentes dans l'intestin humain48. Ici, nous démontrons les effets immunomodulateurs des vésicules bactériennes intestinales produites par une souche AO44 de Bifidobacterium longum nouvellement séquencée et annotée. Nos résultats ouvrent une nouvelle voie pour de futures études sur les effets thérapeutiques potentiels des vésicules bactériennes.

L'ADN de la souche AO44 de B. longum a été extrait, le génome entier a été séquencé et déposé à GenBank, numéro d'accession PRJNA908295. Pour déterminer quelle entité bactérienne stimule une réponse immunitaire anti-inflammatoire (c'est-à-dire la sécrétion d'IL-10), un fractionnement chimique a été effectué à l'aide d'extractions au méthanol/chloroforme (MeOH/CHCl3). Des cellules bactériennes et des milieux conditionnés de B. longum AO44 cultivés dans un milieu anaérobie Gifu (GAM) ou une infusion cœur-cervelle complétée (BHIS) ont été collectés et les fractions hydrophobes / hydrophiles ont été extraites (Fig. 1a, b). des splénocytes de souris exempts d'agents pathogènes spécifiques (SPF) ont été utilisés pour évaluer les effets immunomodulateurs de chaque fraction chimique. Les splénocytes ont été activés avec des anti-CD3 et supplémentés avec chaque fraction bactérienne. Les splénocytes de souris SPF, activés par des anti-CD3, permettent d'étudier les effets d'entités bactériennes sur l'ensemble de la population de cellules immunitaires présentes dans la rate. La fraction CHCl3 des bactéries cultivées à la fois dans GAM et BHIS a exercé la plus forte sécrétion d'IL-10 par les splénocytes par rapport aux autres fractions. Le changement de pli par rapport au contrôle (splénocytes activés avec anti-CD3) est présenté (Fig. 1c, d). Les effets immunomodulateurs de la fraction du milieu conditionné concentré (10x) (c'est-à-dire le milieu conditionné) étaient similaires à la fraction CHCl3, indiquant qu'une entité bactérienne qui existe dans les deux fractions contient le composant immunomodulateur actif.

a Illustration de la croissance bactérienne et de la séparation cellules/surnageant. b Illustration du fractionnement chimique des milieux conditionnés bactériens et des cellules. c Changement de pli (par rapport au contrôle) des concentrations d'IL-10 dans les splénocytes exposés à l'une ou l'autre des fractions chimiques générées à partir de B. longum cultivé dans un milieu BHIS. d Changement de pli (par rapport au témoin) des concentrations d'IL-10 dans les splénocytes exposés à l'une ou l'autre des fractions chimiques générées à partir de B. longum cultivé dans un milieu GAM. Chaque point représente une répétition technique de trois expériences indépendantes. ANOVA de Brown-Forsythe et Welch, *P < 0,05 et **P < 0,01. Les barres d'erreur représentent sd fraction CHCl3 = fraction organique hydrophobe, fraction MeOH = fraction organique hydrophile, fraction H2O = fraction polaire hydrophile, SupX10 = milieu conditionné concentré. La figure 1a, b a été créée avec BioRender.com.

Selon les caractéristiques chimiques du CHCl3, cette fraction contient majoritairement des molécules hydrophobes, comme les membranes cellulaires bactériennes. Étant donné que la fraction CHCl3 et la fraction de surnageant concentrée ont eu un effet similaire sur la sécrétion d'IL-10 et que les VE sont composées de membranes cellulaires bactériennes sécrétées dans le milieu conditionné (c'est-à-dire présentes dans les surnageants), nous avons choisi de nous concentrer sur la caractérisation des VE en tant qu'entité bactérienne active. Les EV de B. longum AO44 ont été isolés par une série de filtrations et d'ultracentrifugation (Fig. 2a) pour obtenir des EV en granulés. En tant que témoin, le milieu BHIS sans bactérie a été soumis au même processus de filtrations et d'ultracentrifugation pour confirmer que l'effet immunitaire est dérivé d'une entité bactérienne et non du milieu concentré lui-même. Les véhicules électriques ont été caractérisés (Fig. 2b – d) par leur morphologie et leur taille. Une image Cryo-TEM représentative confirme la présence des vésicules dans le culot ultracentrifugé et démontre leur morphologie (Fig. 2b). De plus, des véhicules électriques ont été identifiés bourgeonnant à partir de la membrane cellulaire bactérienne ainsi qu'entourant les cellules bactériennes dans leur milieu de croissance, à l'aide de Cryo-TEM (Fig. 2c). La distribution de taille des véhicules électriques a été mesurée à l'aide de NanoSight, la plupart des vésicules ayant une taille de 150 nm (Fig. 2d). Pour vérifier que les VE ont été synthétisés par B. longum, les bactéries ont été cultivées en présence d'acides aminés D fluorescents pour marquer les protéines nouvellement synthétisées, et plus particulièrement les peptidoglycanes des bactéries. Les bactéries métaboliquement actives incorporent les acides aminés D fluorescents afin de synthétiser les protéines. Le marquage métabolique par des acides aminés D fluorescents est une méthode qui permet de marquer les VE bactériennes nouvellement synthétisées lors de leur production, sans avoir besoin de les marquer après extraction, une étape qui pourrait laisser des traces des marqueurs de fluorescence pouvant provoquer des artefacts de marquage non spécifiques. Les vésicules marquées ont été identifiées et différenciées des vésicules non marquées par une cytométrie en flux spécifique conçue pour détecter les petites particules (Fig. 2e, f).

a Illustration du processus d'isolement des vésicules extracellulaires. b Images Cryo-TEM de différents véhicules électriques libérés par des bactéries à partir du même échantillon. 'S' dans 'b' désigne le film support perforé TEM. Toutes les barres correspondent à 100 nm. c Images Cryo-TEM de la bactérie à différents stades de formation de l'EV : (1) La pointe d'une bactérie. L'astérisque indique la formation possible de véhicules électriques vus en projection à travers la paroi cellulaire. (2) Un EV se formant entre la paroi cellulaire et la capsule (flèche). (3) Un EV entièrement formé entre la paroi cellulaire et la capsule (flèche); 'S' désigne le film support perforé TEM. (4) La pointe de la bactérie après la libération d'un EV ; une flèche pointe vers la paroi cellulaire déformée ; les pointes de flèches pointent vers les véhicules électriques libérés. Un agrandissement de (4) est ajouté à droite. Les barres d'échelle correspondent à 100 nm. d Distribution de taille et concentration (1e10) des vésicules extracellulaires de B. longum telles que mesurées dans NanoSight. Les barres d'erreur représentent sd e, f B. longum vésicules extracellulaires marquées par fluorescence par marquage d'acides aminés D, détectées en cytométrie en flux. e vésicules non marquées et f vésicules marquées. La figure 2a a été créée avec BioRender.com.

B. longum AO44 EVs ont été analysés pour leur teneur en protéome par chromatographie liquide-spectrométrie de masse en tandem. Quatre cent soixante-trois protéines ont été identifiées et quantifiées dans les trois répétitions. Les voies KEGG enrichies sont présentées en pourcentages sur la figure 3a et le tableau supplémentaire 1c. Les trois plus grands groupes de protéines appartenaient aux voies métaboliques (16,9%), aux ribosomes (9,4%) et à la biosynthèse des métabolites secondaires (7,7%), le quatrième plus grand groupe était les transporteurs ABC (6,1%) et le sixième plus grand groupe était le quorum sensing (4,9%). De plus, les transporteurs ABC étaient la catégorie la plus significativement enrichie selon la base de données INTERPRO avec un nombre de protéines de 31 et une valeur p de 1e-10 (Fig. 3b et Tableau supplémentaire 1b). INTERPRO a confirmé que d'autres catégories de protéines liées aux transporteurs ABC sont enrichies en VE de B. longum AO44, notamment les protéines de perméase transmembranaire, les protéines de liaison aux nucléotides et les protéines de liaison aux solutés périplasmiques hautement spécifiques (Fig. 3b). L'analyse STRING et la carte des interactions de ces sous-ensembles de transporteurs ABC et du sous-ensemble de détection de quorum analysés par KEGG sont présentées aux Fig. 3c, d. À noter, le sous-ensemble de transporteurs ABC contenait également des protéines appartenant à la voie de détection du quorum et à une voie de liaison à l'ATP (Fig. 3c). Le sous-ensemble de détection de quorum comprenait des protéines impliquées dans la biosynthèse des acides gras, l'exportation de protéines, les transporteurs ABC et les protéines qui sont des composants intrinsèques de la membrane (Fig. 3d). Toutes les protéines identifiées dans les vésicules sont répertoriées dans le tableau supplémentaire 1 (le tableau supplémentaire 1a comprend la liste complète des composants membranaires intégraux, le supplément 1b comprend l'analyse INTERPRO et le supplément 1c l'analyse KEGG).

a Voies KEGG enrichies en VE de B. longum. b Domaines enrichis et catégories de familles de protéines de la base de données INTERPRO (valeur P et nombre de protéines) tels qu'analysés par DAVID Bioinformatics Resources (LHRI/ADRD au Frederick National Laboratory). L'enrichissement a été effectué sur le fond du génome bactérien. c Analyse STRING et carte des interactions du groupe de transporteurs ABC annotées par la base de données des voies KEGG (violet - transporteurs ABC, bleu - détection de quorum, gris - liaison ATP). d Analyse STRING et carte des interactions des protéines de détection du quorum telles qu'annotées par la base de données de la voie KEGG (bleu - détection du quorum, jaune - biosynthèse des acides gras, marron - exportation de protéines, violet - transporteurs ABC, bleu clair - composant intrinsèque de la membrane).

Afin de valider que le profil protéique des véhicules électriques diffère du profil protéique des cellules bactériennes et des surnageants, une analyse protéomique a également été réalisée sur les cellules bactériennes et les surnageants (tableau supplémentaire 2). Les profils d'intensités protéiques des cellules bactériennes ont été comparés aux données EVs et aux protéines analysées à partir des surnageants après ultracentrifugation. Les répliques de chaque groupe ont été regroupées par regroupement non supervisé, représenté sur une carte thermique (Fig. 4a). Plusieurs protéines intenses ont été identifiées dans la protéomique des cellules bactériennes mais pas dans les VE, et dans les VE mais pas dans les surnageants, indiquant que les VE contiennent une teneur en protéines spécifique, unique aux VE et différente de la teneur totale en protéines des cellules ainsi que de la teneur en protéines sécrétées. Les protéines et les domaines des transporteurs ABC étaient significativement enrichis en EV par rapport aux cellules bactériennes selon la base de données INTERPRO (Fig. 4b). Les protéines différentielles identifiées dans les cellules bactériennes (à droite) et les VE (à gauche) sont représentées dans le diagramme du volcan (Fig. 4c).

a Représentation par carte thermique des intensités protéiques des cellules bactériennes, des véhicules électriques et des échantillons de surnageants, analysées par le logiciel Perseus. Ce regroupement hiérarchique non supervisé a été effectué à l'aide d'une analyse de distance euclidienne. b Domaines enrichis et catégories de familles de protéines de la base de données INTERPRO (valeurs P) telles qu'analysées par les ressources bioinformatiques DAVID (LHRI/ADRD au Frederick National Laboratory) comparant les cellules bactériennes et les véhicules électriques. L'enrichissement a été effectué sur le fond du génome bactérien. c Représentation de la parcelle volcanique des protéines différentielles identifiées dans les cellules bactériennes (à droite) et les véhicules électriques (à gauche). Rouge—transporteurs ABC, bleu—protéines de liaison à l'ATP, vert—membrane plasmique, orange—protéines ribosomiques.

Les véhicules électriques ont été introduits dans les splénocytes de souris SPF à des concentrations décroissantes et les concentrations d'IL-10 et d'IL-17 dans le milieu des cellules ont été mesurées. La concentration d'IL-10 était la plus élevée à la dilution la plus faible des véhicules électriques (1:50) par rapport à toutes les autres dilutions et contrôles. Les concentrations d'IL-10 ont diminué de manière non linéaire lorsque les vésicules ont été diluées à une concentration non efficace à une dilution de 1: 1250 (Fig. 5a). Au contraire, les concentrations d'IL-17 n'étaient pas affectées par les vésicules à toutes les concentrations (Fig. 5b). Les fréquences des cellules CD8+ Ki67+ PD1+ et CD4+ Ki67+ PD1+ ont été mesurées par cytométrie en flux pour évaluer la prolifération et l'activation des cellules. Les fréquences des cellules CD8 + Ki67 + PD1 + et CD4 + Ki67 + PD1 + étaient plus élevées lorsque les cellules étaient exposées à la plus faible dilution de vésicules (1:50), CD8 + Ki67 + PD1 + étant légèrement plus significatif par rapport aux autres dilutions et aux témoins (Fig. 5c, d). Pour étudier plus avant la réponse anti-inflammatoire des cellules présentatrices d'antigène et des lymphocytes T aux véhicules électriques de B. longum, des cellules T DC-CD4 + ont été co-cultivées en présence des véhicules électriques bactériens. Les niveaux d'IL-10 étaient significativement plus élevés dans les cellules activées avec des véhicules électriques de B. longum par rapport aux cellules activées avec du BHIS concentré (x1000, Fig. 5e). Le changement de pli de l'IL-17 n'a montré aucune différence significative, et même une légère diminution, dans les cellules activées avec des véhicules électriques par rapport aux cellules activées avec du BHIS concentré (x 1000, Fig. 5f). L'induction de l'IL-10 et de l'IL-17 dans la co-culture de cellules T DC-CD4+ est alignée sur l'induction dans le test des splénocytes entiers.

a Concentrations d'IL-10 et b Concentrations d'IL-17 dans les milieux de splénocytes après exposition aux anti-CD3 ; ou anti-CD3 combiné avec du BHIS concentré (gris clair, dilution 1:50) ou des dilutions descendantes de vésicules extracellulaires. c Fréquence des cellules CD4+ Ki67+ PD1+ par rapport aux cellules CD4 totales après exposition aux anti-CD3 ; anti-CD3 combiné avec du BHIS concentré (dilution 1:50) ou des dilutions descendantes de vésicules extracellulaires. d Fréquence des cellules CD8+ Ki67+ PD1+ sur les cellules CD8 totales après exposition à des anti-CD3 ou des anti-CD3 combinés avec du BHIS concentré (dilution 1:50) ou des dilutions décroissantes de vésicules extracellulaires. e, f Changement de pli (par rapport au contrôle) des concentrations d'IL-10 (e) ou d'IL-17 (f) dans les milieux de cellules T DC-CD4 + exposés à des véhicules électriques de B. longum ou à du BHIS concentré. Chaque point représente une répétition biologique de trois expériences indépendantes. a–d ANOVA unidirectionnelle ordinaire, e, f test t non apparié. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001 et ****P < 0,0001. Les barres d'erreur représentent sd

Le microbiote intestinal a des effets potentiels majeurs sur notre santé, à tel point qu'il peut être considéré comme une mine d'or pour les molécules thérapeutiques dérivées de la bactérie19,20,21. Une voie majeure des effets thérapeutiques induits par les bactéries sur l'hôte est la communication bactérienne avec le système immunitaire de l'hôte6,7,8,9,16,49. Par exemple, les SCFA produits par les bactéries intestinales peuvent induire des effets anti-inflammatoires sur l'hôte via l'induction de T-regs50. Cependant, les modes de ces communications commensal-hôte et les molécules immunomodulatrices bactériennes impliquées sont encore largement méconnus. Un mode possible d'interaction microbe-hôte intestinal est la sécrétion de vésicules bactériennes, qui peuvent atteindre les cellules hôtes, potentiellement même dans des sites distants. En effet, un polysaccharide de surface externe (PS) de la bactérie Gram-négative Bacteroides fragilis est communiqué aux cellules hôtes via des vésicules bactériennes de la membrane externe (OMV), soulageant la colite expérimentale chez la souris51. Les études sur les vésicules extracellulaires (VE) des bactéries intestinales à Gram positif sont en train d'émerger, cependant, elles sont encore relativement rares, par rapport aux études sur les OMV à Gram négatif46,47. Plus précisément, quelques études récentes ont démontré les effets physiologiques des VE produites par des bactéries du genre Bifidobacterium. De ce genre, Bifidobacterium longum est un commensal intestinal à Gram positif commun avec des effets anti-inflammatoires et immunomodulateurs.

Ici, nous avons choisi d'étudier une souche AO44 de B. longum dérivée de l'intestin humain nouvellement isolée, dans le but de caractériser ses entités immunomodulatrices. Nous avons d'abord effectué un fractionnement chimique des cellules bactériennes et des surnageants de B. longum AO44 pour découvrir les caractéristiques chimiques des composés bactériens immunomodulateurs actifs. Deux milieux de croissance riches ont été choisis (BHIS et GAM), qui sont principalement utilisés pour cultiver des espèces de Bifidobacterium. Nous avons effectué des fractionnements CHCl3:MeOH:H2O, qui séparent les molécules en fractions brutes hydrophobes et hydrophiles, en fractions organiques et polaires. Puisqu'il a été démontré que les bactéries du genre Bifidobacterium induisent principalement des effets anti-inflammatoires38, nous avons recherché l'induction de la cytokine anti-inflammatoire IL-10 par les fractions actives. La fraction de surnageant concentrée et la fraction cellulaire CHCl3 ont eu l'effet le plus élevé sur la sécrétion d'IL-10 par les cellules immunitaires, à la fois dans les milieux GAM et BHIS. La fraction organique non polaire CHCl3 contient des molécules hydrophobes telles que des parties membranaires et des lipides. Par conséquent, nous avons émis l'hypothèse que le composant actif est une substance cellulaire présente dans les deux. Étant donné que le surnageant a été séparé des cellules bactériennes par centrifugation, les parties de membrane hydrophobes trouvées sont probablement des débris cellulaires ou des véhicules électriques sécrétés par les cellules bactériennes dans le milieu. Par conséquent, nous avons ensuite isolé les VE à partir de bactéries cultivées dans BHIS et confirmé leur capacité à induire la sécrétion d'IL-10 mais pas d'IL-17 dans la culture de splénocytes entiers, ce qui accentue leur effet anti-inflammatoire.

Nous avons exploré plus avant leurs effets immunitaires potentiels supplémentaires et identifié que ces mêmes véhicules électriques sont également capables d'augmenter les fréquences des cellules CD4 + Ki67 + PD1 + et CD8 + Ki67 + PD1 + par rapport au contrôle. La régulation à la hausse de CD4+ Ki67+ PD1+ et CD8+ Ki67+ PD1+ indique l'activation (PD1+) et la prolifération (Ki67+) des cellules CD4 et CD8, ce qui correspond à l'induction de l'IL-10. Pour un aperçu plus mécaniste des effets anti-inflammatoires des véhicules électriques sur les cellules immunitaires de l'hôte, nous avons exploré leurs effets immunomodulateurs dans la co-culture de cellules T DC-CD4 +. Ici, comme pour les splénocytes entiers, les VE induisaient la sécrétion d'IL-10 et non d'IL-17. Cela souligne à nouveau leurs effets anti-inflammatoires et identifie les DC et les lymphocytes T CD4+ comme des acteurs majeurs de cette interaction. Une fois que nous avons identifié les effets immunomodulateurs des VE, nous avons caractérisé leur contenu par la protéomique. L'analyse protéomique a révélé une teneur en protéines unique dans les véhicules électriques qui diffère de la teneur en protéines des cellules bactériennes entières et des protéines sécrétées dans le surnageant. Plus précisément, l'enrichissement des transporteurs ABC et des protéines de détection de quorum a été observé dans les véhicules électriques. Les systèmes de transport bactériens à haute affinité sont impliqués dans le transport actif des solutés à travers la membrane cytoplasmique, y compris les protéines de perméase transmembranaire, les protéines de liaison aux nucléotides et les protéines de liaison aux solutés périplasmiques hautement spécifiques, toutes présentes dans les vésicules. À noter, les transporteurs ABC et les protéines de liaison aux solutés extracellulaires (y compris la "famille 5") ont été enrichis dans les véhicules électriques d'une autre souche de B. longum dont il a été démontré qu'elle atténuait les allergies46. De plus, il a déjà été démontré que les protéines de détection de quorum étaient enrichies en OMV à Gram négatif, favorisant la formation de biofilm bactérien52,53. Enfin, nous démontrons un marquage par fluorescence spécifique des vésicules bactériennes, ce qui peut permettre de futures études sur les interactions EVs-hôte. Pour résumer, nous avons caractérisé par la morphologie, la taille, le contenu et les activités immunomodulatrices des véhicules électriques d'un B. longum nouvellement isolé dérivé de l'intestin. Nos résultats démontrant l'activation des cellules immunitaires médiées par les véhicules électriques peuvent conduire à de futures études évaluant leurs effets in vivo, sur la santé et la maladie, et considérant ces véhicules électriques spécifiques comme de futures thérapies potentielles.

B. longum AO44 a été décongelé sur des plaques de gélose Brain Heart Infusion (BHI, BD BBLTM) additionnées de 5 µg/ml d'hémine (Alfa Aesar) dans 1 N NaOH et 2,5 µg/ml de vitamine K (Thermo Fisher Scientific) dans 100 % EtOH (précédemment appelé BHIS), à 37 °C dans une chambre anaérobie, 85 % N2, 10 % CO2, 5 % H2 (COY).

B. longum AO44 a été pré-cultivé à 37 °C dans des conditions anaérobies. Tout d'abord, dans 10 ml de BHIS ou GAM dans un tube Hungate d'environ 20 ml, puis inoculé par 0,5 % v/v à 900 ml de BHIS ou GAM dans une bouteille en verre de 1 L à 37 oC dans des conditions anaérobies. Après 4 jours d'incubation à 37 ° C, le surnageant et les cellules ont été séparés par centrifugation (7500 × g, centrifugeuse Thermo Fisher Scientific Sorvall R6 avec rotor de bouteille 1Lx4).

Fractionnement du surnageant - La fraction de surnageant 10x (c'est-à-dire le surnageant concentré brut) a été préparée en évaporant le surnageant centrifugé à 1/10 de volume par un évaporateur rotatif. Les fractions surnageant-méthanol ont été préparées comme suit : 10 ml du surnageant centrifugé ont d'abord été lyophilisés à sec. 30 ml de méthanol ont été ajoutés au résidu sec. Après mélange à la spatule et par sonication (15 min), la solution mélangée a été laissée une nuit à température ambiante (TA) pour permettre l'extraction complète des molécules dans le méthanol. La solution de méthanol a été soigneusement retirée des résidus insolubles. Cette fraction de méthanol (30 ml) a été concentrée sous vide jusqu'à siccité et redissoute dans 1 ml de diméthylsulfoxyde (DMSO). La fraction surnageant-eau a été préparée comme suit : les résidus insolubles du procédé ci-dessus ont été dissous dans 1 ml d'eau.

Fractionnement des culots cellulaires - la fraction cellule-chloroforme a été préparée comme suit : les culots cellulaires de la culture de 1 L ont été trempés dans 300 ml de chloroforme: méthanol = 1: 1 (v / v). Après mélange à la spatule et par sonication (15 min), la solution mixte a été laissée une nuit à TA pour permettre l'extraction complète des molécules dans le solvant organique. L'extrait a été retiré des culots cellulaires, filtré et évaporé sous vide jusqu'à siccité. Le résidu sec est ensuite additionné de 30 ml de chloroforme, mélangé à la spatule et par sonication (15 min), et laissé une nuit à TA pour laisser les molécules entièrement extraites dans le solvant organique. La solution de chloroforme a été éliminée des résidus insolubles, concentrée sous vide, puis redissoute dans 3 ml de DMSO. Les fractions cellulaires-méthanol ont été préparées comme suit : les résidus insolubles du processus d'extraction cellulaire-chloroforme ci-dessus ont été dissous dans 30 ml de méthanol, mélangés à la spatule et par sonication (15 min), et laissés une nuit à température ambiante pour une extraction moléculaire complète dans le solvant organique. La solution de méthanol a été éliminée des résidus insolubles, concentrée sous vide et redissoute dans 3 ml de DMSO.

B. longum AO44 a été cultivé dans 10 ml de BHIS à 37 ° C dans des conditions anaérobies pendant une nuit. La culture bactérienne a ensuite été diluée au 1:40 à 200 ml de BHIS et cultivée pendant 8 h à 37 ° C dans des conditions anaérobies, une deuxième dilution de 1:20 a été effectuée et les bactéries ont été cultivées pendant 16 h à 37 ° C dans des conditions anaérobies. La culture a été centrifugée à 8000 × g pendant 30 min, puis filtrée deux fois à travers un filtre de taille de pores de 0,45 µm et un filtre de taille de pores de 0,22 µm. Le surnageant filtré a ensuite été concentré à l'aide d'unités de filtration centrifuge Centricon® Plus-70 (Merck) avec une exclusion de 100 kDa. Le surnageant restant a été ultracentrifugé à 100 000 × g pendant 1 h à 4 ° C pour obtenir le culot de vésicules membranaires. Après ultracentrifugation, le liquide supérieur a été jeté et le culot de vésicules a été remis en suspension dans 1 ml de solution saline tamponnée au phosphate stérile de Dulbecco (PBS), filtré avec un filtre de taille de pore de 0, 22 µm et congelé à -80 ° C. La distribution de la taille des vésicules a été mesurée à l'aide de NanoSight.

Les rates ont été récoltées à partir de souris C57BL/6 SPF et ont été perturbées mécaniquement sur un tamis cellulaire de 40 µm avec 1 ml de tampon de lyse ACK (Thermo Fisher Scientific) pendant 1 à 2 min. Les cellules ont ensuite été transférées dans 20 ml de milieu RPMI (Sartorius) glacé et centrifugées pendant 10 min à 4 ° C et 300 × g. Les cellules ont été lavées deux fois avec 10 ml de RPMI glacé, comptées et diluées avec du RPMI à 37°C jusqu'à une concentration finale de 2 millions de cellules/ml. Les cellules ont ensuite été supplémentées avec du β-mercaptoéthanol 0, 05 mM (Merck) et de l'anti-CD3 (0, 5 µg / ml, 145-2C11, BioLegend) pour une activation sous-optimale des lymphocytes T. 100 µl de cellules ont été étalés dans chaque puits d'une plaque à 96 puits et ont été additionnés de 100 µl de fractions diluées (dilution 1:250) ou de vésicules (dilution 1:50-1:31,250). Les cellules et leurs milieux ont été collectés 5 jours plus tard pour la cytométrie en flux et l'analyse ELISA.

Les rates ont été récoltées à partir de souris C57BL/6 SPF. Pour l'extraction des DC, les rates ont été injectées avec de la collagénase ii à une concentration de 1 mg/ml dans du milieu RPMI, incubées à 37 °C pendant 30 min, puis rompues mécaniquement sur un tamis cellulaire de 40 µm. Pour l'extraction des lymphocytes T CD4+, les rates ont été rompues mécaniquement sur un tamis cellulaire de 40 µm avec 1 ml de PBS contenant 2 % de sérum bovin fœtal (FBS). Les cellules ont ensuite été lavées deux fois avec 10 ml de PBS ou une solution saline équilibrée de Hanks (HBSS) contenant 2% de FBS et 1 mM d'EDTA, et centrifugées pendant 5 min à température ambiante et 300 × g. Les cellules de chaque rate ont été utilisées pour isoler les DC à l'aide du kit d'enrichissement EasySep™ Mouse Pan-DC (STEMCELL Technologies Inc.) ou des lymphocytes T CD4+ à l'aide du kit d'isolement des cellules EasySep Mouse CD4+ T (STEMCELL Technologies Inc.) conformément aux instructions du fabricant. 50 ul de DC isolées ont été étalées dans une plaque à 96 puits dans du milieu RPMI à une concentration finale de 400 000 cellules/ml. 50 ul de lymphocytes T CD4+ isolés ont été étalés dans la même plaque à 96 puits dans du milieu RPMI à une concentration finale de 2 millions de cellules/ml. Les cellules ont ensuite été additionnées de 0,05 mM de β-mercaptoéthanol (Merck) et d'anti-CD3 (0,5 µg/ml, 145-2C11, BioLegend) pour une activation sous-optimale des lymphocytes T CD4+. La co-culture de cellules T DC-CD4+ a ensuite été ajoutée à 100 µl de vésicules diluées (dilution 1:50) et de BHIS concentré comme témoin (dilution 1:50). Les milieux cellulaires ont été collectés 3 jours plus tard pour une analyse ELISA.

Les échantillons Cryo-TEM ont été préparés dans un système de vitrification en environnement contrôlé (CEVS)54, à une température contrôlée (25 °C) et une humidité relative de 100 %. Une goutte de solution de 4 μL a été appliquée sur un film perforé revêtu de carbone supporté sur une grille TEM (Lacey Formvar/films de carbone sur une grille de cuivre de 200 mesh, Ted Pella Inc., Redding, USA), tenue par une pince à épiler, à l'intérieur du CEVS. Les grilles ont été préalablement gravées au plasma dans un déchargeur luminescent PELCO EasiGlow (Ted Pella Inc., Redding, USA) pour augmenter leur hydrophilie. L'excès de liquide a été buvardé deux fois à partir de l'arrière de la grille à l'aide de papier filtre, formant un film mince adapté à l'imagerie. La solution a ensuite été vitrifiée en plongeant rapidement la grille dans de l'éthane liquide à son point de congélation (-183 °C). Les spécimens ont été stockés dans un dewar d'azote liquide jusqu'à l'imagerie. Les spécimens ont été imagés à l'aide d'un Thermo-Fisher Scientific Talos 200C, un TEM haute résolution fonctionnant à 200 kV et équipé d'un canon à émission de champ (FEG) et d'une caméra à imagerie directe Falcon III. Le transfert des échantillons dans le microscope a été effectué à l'aide d'un cryo-porteur Gatan 626 maintenu à -180 ° C. Toutes les images ont été enregistrées par imagerie à faible dose, pour minimiser les dommages causés par le rayonnement par faisceau d'électrons, et avec une plaque de phase Volta (VPP), pour améliorer le contraste de l'image.

Les bactéries ont été cultivées pendant une nuit à 37 °C dans des conditions anaérobies dans une chambre anaérobie dans un milieu BHIS additionné de HADA (0,8 mM, Tocris, Bio-Techne), volume total de 10 ml55. Les bactéries marquées ont été séparées du milieu par centrifugation pendant 5 min à 7500 × g. Les vésicules ont ensuite été isolées comme décrit ci-dessus et détectées par le BD FACSymphonyTM A1, un analyseur de cytométrie en flux avec un détecteur de petites particules capable de détecter des particules aussi petites que 90 nm. Tensions utilisées : FS - 550, SS - 650, SP SSC - 450, BV421 - 460.

Un panel constant d'anticorps a été utilisé pour la cohérence. Le panel comprenait des anticorps contre CD4 (RMA-5), CD8 (53-6.7), TCRß (H57-597), CD19 (6D5), Ki67 (16A8), PD-1 (29F.1A12, tous de BioLegend). Pour la coloration intracellulaire des facteurs de transcription, les cellules ont été colorées pour les marqueurs de surface et fixées dans un tampon Fix/Perm (eBioscience) pendant 30 à 60 min à RT, et perméabilisées dans un tampon de perméabilisation (eBioscience) à RT pendant 30 min en présence d'anticorps. Les cellules ont été acquises avec un BD BioSciences® LSRFortessa et l'analyse a été effectuée avec le logiciel d'analyse Kaluza®. La concentration, le clone et la source d'anticorps ont été maintenus constants pour assurer la cohérence de la coloration.

Les concentrations d'IL-10 et d'IL-17 dans les splénocytes et les milieux de cellules T DC-CD4+ ont été mesurées à l'aide du kit standard ELISA MAXTM Mouse IL-10 et IL-17 (BioLegend) en suivant les instructions du fabricant. Limites de détection ELISA : IL-10—31,5–2000 pg/ml, IL-17—15,6–1000 pg/ml.

Les échantillons de véhicules électriques et de surnageants ont été dissous dans du dithiothréitol (DTT) 10 mM, du Tris 100 mM et du dodécylsulfate de sodium (SDS) à 5 %, soniqués et bouillis à 95 °C pendant 5 min et précipités dans de l'acétone à 80 %. Les culots de protéines ont été dissous dans de l'urée 9 M et du bicarbonate d'ammonium 400 mM, puis réduits avec du DTT 3 mM (à 60 ° C pendant 30 min), modifiés avec de l'iodoacétamide 10 mM dans du bicarbonate d'ammonium 100 mM (à température ambiante 30 min dans l'obscurité) et digérés dans de l'urée 2 M, du bicarbonate d'ammonium 25 mM avec de la trypsine modifiée (Promega), pendant une nuit à 37 ° C dans un 1: 5 0 (M/M) rapport enzyme-substrat. Les peptides trypsiques ont été dessalés à l'aide d'une pointe de platine C18 maison, séchés et remis en suspension dans de l'acide formique à 0,1 %. Les peptides ont été résolus par chromatographie en phase inverse sur des capillaires en silice fondue de 0, 075 × 300 mm (J&W) remplis de matériau en phase inverse Reprosil (Dr Maisch GmbH, Allemagne). Les peptides ont été élués avec un gradient linéaire de 60 min de 5 % à 28 %, un gradient de 15 min de 28 % à 95 % et 15 min à 95 % d'acétonitrile avec 0,1 % d'acide formique dans de l'eau à des débits de 0,15 μl/min. La spectrométrie de masse a été réalisée par le spectromètre de masse Q Exactive HF (Thermo Fisher Scientific) en mode positif (m / z 300–1800, résolution 60 000 pour MS1 et 15 000 pour MS2) en utilisant un balayage MS complet répétitif suivi d'une dissociation induite par collision élevée (HCD, à 27 énergie de collision normalisée) des 18 ions les plus dominants (> 1 charge) sélectionnés à partir du premier balayage MS. Une liste d'exclusion dynamique a été activée avec une durée d'exclusion de 20 s. Les données de spectrométrie de masse ont été analysées à l'aide du logiciel MaxQuant 1.5.2.856 pour la sélection et l'identification des pics à l'aide du moteur de recherche Andromeda, en recherchant le protéome de Bifidobacterium longum dans la base de données Uniprot avec une tolérance de masse de 6 ppm pour les masses précurseurs et de 20 ppm pour les fragments. ions. L'oxydation sur la méthionine et l'acétylation N-terminale des protéines ont été acceptées comme modifications variables et le carbamidométhyle sur la cystéine a été accepté comme modification statique. La longueur minimale du peptide a été fixée à six acides aminés et un maximum de deux faux clivages a été autorisé. Les données ont été quantifiées par analyse sans étiquette en utilisant le même logiciel. Les taux de fausses découvertes (FDR) au niveau des peptides et des protéines ont été filtrés à 1 % en utilisant la stratégie de leurre cible. Les tables de protéines ont été filtrées pour éliminer les identifications de la base de données inversée, les contaminants communs et les identifications de peptides uniques57.

Pour les échantillons de cellules bactériennes, les peptides ont été élués avec un gradient linéaire de 180 min de 5 % à 28 %, un gradient de 15 min de 28 % à 95 % et 25 min à 95 % d'acétonitrile avec 0,1 % d'acide formique dans de l'eau à des débits de 0,15 μl/min. La spectrométrie de masse a été réalisée par le spectromètre de masse Exploris 480 (Thermo) en mode positif (m/z 350–1200, résolution 120 000 pour MS1 et 15 000 pour MS2) en utilisant un balayage MS complet répétitif suivi d'une dissociation induite par collision élevée (HCD, à 27 énergie de collision normalisée) des 30 ions les plus dominants (> 1 charges) sélectionnés à partir du premier balayage MS. Une liste d'exclusion dynamique a été activée avec une durée d'exclusion de 30 s. L'analyse des données MS a été effectuée de la même manière que pour les échantillons de véhicules électriques.

La souche AO44 de B. longum, isolat humain, a été utilisée dans cette étude16 (Brigham and Women's Hospital). L'ADN génomique a été extrait à l'aide du kit ZymoBIOMICS DNA Miniprep (Zymo Research). L'ADN a été séquencé par Illumina MiSeq PE 2x150 et la méthode d'assemblage utilisée était SPades v3.15.3.

L'analyse par spectrométrie de masse de l'identification et de la quantification du contenu en protéome des vésicules a été effectuée à l'aide du logiciel Perseus 1.6.10.43. Toutes les autres analyses statistiques ont été effectuées à l'aide de Prism-GraphPad.

De plus amples informations sur la conception de la recherche sont disponibles dans le résumé des rapports de recherche sur la nature lié à cet article.

Les données analysées dans cette étude sont disponibles dans l'article et son fichier de tableaux complémentaires. La séquence du génome entier de B. longum a été déposée auprès de GenBank, numéro d'accession PRJNA908295. Les données de protéomique de spectrométrie de masse ont été déposées auprès du Consortium ProteomeXchange via le référentiel partenaire PRIDE, identifiant de jeu de données PXD038667. Des données supplémentaires sont disponibles sur demande auprès de l'auteur correspondant.

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Nous tenons à remercier les membres du laboratoire Geva-Zatorsky pour leurs discussions et contributions fructueuses. Remerciements particuliers à Rachel Herren du laboratoire Geva-Zatorsky pour la relecture. Nous remercions Lihi Shaulov de l'équipe BCF, l'unité de microscope électronique de la faculté de médecine Rappaport, Technion, et Amir Grau de l'équipe Biomedical Core Facility (BCF), l'unité de cytométrie en flux de la faculté de médecine Rappaport, ainsi que Marina Nudelman de BD Bioscience. Nous remercions le Smoler Proteomics Center du Technion pour son aide en protéomique ainsi que Inna Kovrigina et le professeur Marcelle Machluf de la Faculté de biotechnologie et de génie alimentaire du Technion pour son aide avec le NanoSight. Le travail de cryo-TEM a été réalisé au Technion Center for Electron Microscopy of Soft Matter. Remerciements particuliers au Prof. Neta Regev-Rudzki et aux Drs. Ruthie Shouval et Meirav Pevsner-Fischer du laboratoire Shouval des Instituts Weizmann, pour des discussions et des suggestions judicieuses. Ce travail a été soutenu par le Technion Institute of Technology, 'Keren Hanasi', Cathedra, le Rappaport Technion Integrated Cancer Center, la bourse Alon pour les jeunes chercheurs exceptionnels, la Fondation israélienne des sciences (subvention 1571/17 et 3165/20), la Fondation Seerave, le Fonds de recherche sur le cancer d'Israël Research Career Development Award, l'Institut canadien de recherches avancées (CIFAR), le Human Frontier Science Program Career Development Award (subvention CDA00025/2 019-C), le prix de la fondation Gutwirth, le don de la Fondation D. Dan et Betty Kahn à l'Université du Michigan, à l'Institut Weizmann et au Technion–Israel Institute of Technology Collaboration for Research, et à l'Union européenne (ERC, ExtractABact, 101078712). Les points de vue et opinions exprimés n'engagent toutefois que les auteurs et ne reflètent pas nécessairement ceux de l'Union européenne ou de l'Agence exécutive du Conseil européen de la recherche. Ni l'Union européenne ni l'autorité concédante ne peuvent en être tenues responsables. NGZ est boursière du CIFAR dans le programme Les humains et le microbiome, boursière Kavli et boursière Horev (Fondation Taub). NM est soutenu par la bourse RTICC-Rubinstein. LZ est récipiendaire des bourses de recherche JSPS Overseas.

Département de biologie cellulaire et des sciences du cancer, Faculté de médecine et institut de recherche Rappaport, Rappaport Technion Integrated Cancer Center (RTICC), Technion-Israel Institute of Technology, Haïfa, 31096, Israël

Noa Mandelbaum, Shaqed Carasso, Elliot Berinstein, Tal Gefen & Naama Geva-Zatorsky

Département de chimie et de biologie chimique, Université Harvard, Cambridge, MA, États-Unis

Lihan Zhang et Emily P. Balskus

Centre de protéomique Smoler, Centre interdisciplinaire Lokey pour les sciences de la vie et l'ingénierie, Technion-Israel Institute of Technology, Haïfa, 3200003, Israël

Tamar Ziv

Département de génie chimique et Russell Berrie Nanotechnology Institute (RBNI), Technion-Israel Institute of Technology, Haïfa, 3200003, Israël

Sapir Lifshiz-Simon, Irina Davidovitch & Yeshayahu Talmon

Département de microbiologie, d'immunologie et de génétique de Shraga Segal, Faculté des sciences de la santé, Université Ben-Gurion, Beer-Sheva, 84105, Israël

Ishai Light & Tomer cuisiniers

Institut médical Howard Hughes, Université Harvard, Cambridge, MA, États-Unis

Emily P. Balskus

Les humains et le microbiome, CIFAR, Toronto, Canada

Naam Geva-Zatorsky

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Conceptualisation de l'étude : NM, TG et NGZ, toutes les expériences et analyses ont été réalisées par NM et TG Certaines expériences ont été réalisées par LZ et EB L'assemblage du génome bactérien a été réalisé par SCTZ a effectué toutes les analyses protéomiques. L'imagerie Cryo-TEM a été réalisée par YT, SLS et ID Une partie des expériences NanoSight a été réalisée par IL et TC La conceptualisation de la première partie de l'étude a été réalisée par EPB, LZ, NM, TG et NGZ Préparation du projet original par NM, TG et NGZ Tous les auteurs ont contribué à l'article et approuvé la version soumise.

Correspondance à Naama Geva-Zatorsky.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

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Réimpressions et autorisations

Mandelbaum, N., Zhang, L., Carasso, S. et al. Les vésicules extracellulaires du symbiote intestinal Gram positif Bifidobacterium longum induisent des effets immunomodulateurs et anti-inflammatoires. npj Biofilms Microbiomes 9, 30 (2023). https://doi.org/10.1038/s41522-023-00400-9

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Reçu : 05 décembre 2022

Accepté : 18 mai 2023

Publié: 03 juin 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s41522-023-00400-9

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