Tumeur

Communications Biology volume 6, Article number: 60 (2023) Citer cet article

2519 accès

8 Altmétrique

Détails des métriques

Il existe toujours un besoin de ligands spécifiques au cancer qui peuvent fournir une grande variété de cargaisons thérapeutiques. Les ligands démontrant à la fois la spécificité de la tumeur et la capacité de médier l'absorption cellulaire efficace d'un traitement sont essentiels pour étendre les thérapies ciblées. Nous avons précédemment rapporté la sélection d'un peptide à partir d'une bibliothèque de peptides en utilisant une lignée cellulaire de cancer du poumon non à petites cellules (NSCLC) comme cible. Ici, nous optimisons notre peptide principal par une série de modifications chimiques, notamment des troncatures, un coiffage N-terminal et des changements de valence. Le peptide de 10 acides aminés résultant a une affinité de < 40 nM sur quatre lignées cellulaires NSCLC différentes en tant que monomère et est stable dans le sérum humain pendant > 48 h. Le peptide s'internalise rapidement lors de la liaison cellulaire et se dirige vers le lysosome. Le peptide se loge dans une tumeur dans un modèle animal et est retenu jusqu'à 72 h. Fait important, nous démontrons que le peptide peut livrer la protéine cytotoxique saporine spécifiquement aux cellules cancéreuses in vitro et in vivo, résultant en un agent anticancéreux efficace.

Malgré une baisse des nouveaux cas au cours des 30 dernières années, le cancer du poumon est toujours responsable d'environ 20 % des décès liés au cancer en Amérique1. Le dépistage des fumeurs par tomodensitométrie spirale à faible dose a amélioré la détection, mais seulement 17 % des cancers du poumon sont détectés à un stade localisé. Les nouvelles thérapies ont déplacé l'attention vers des traitements à guidage moléculaire qui dépendent du génotype et/ou du phénotype de la tumeur2. Une de ces classes thérapeutiques est le conjugué anticorps-médicament (ADC). Les anticorps servent de systèmes de délivrance en ciblant les récepteurs de surface cellulaire dont l'expression est régulée positivement dans une tumeur mais a une expression négligeable sur les cellules normales. Les anticorps monoclonaux doivent présenter une spécificité cellulaire élevée pour éviter la livraison aux cellules normales. De plus, ils doivent s'internaliser dans la cellule pour délivrer la charge utile toxique. En raison de la spécificité de l'anticorps pour les cellules cancéreuses, des médicaments trop toxiques pour être administrés par voie systémique peuvent être utilisés comme ADC. L'approbation de Kadcyla®3, un anticorps anti-HER2 conjugué à l'emtansine, et d'Adcetris4,5, un anticorps anti-CD30 conjugué à la monométhylauristatine, a redynamisé le développement de l'ADC. Depuis 2017, huit ADC ont reçu l'approbation de la FDA6,7,8. Cependant, à ce jour, il n'existe aucun ADC approuvé pour le traitement du cancer du poumon9.

Les peptides offrent une classe alternative de molécules ciblant le cancer. Les peptides rivalisent d'affinité et de spécificité avec les anticorps. Ils sont plus faciles à produire et peuvent être modifiés de manière régiospécifique pour transporter une variété de cargaisons, y compris des biothérapies macromoléculaires. Le biopanning par affichage de phage a été utilisé pour sélectionner des ligands peptidiques pour de nouveaux biomarqueurs présents dans le cancer10. Nous avons précédemment isolé un peptide à partir d'une bibliothèque de peptides présentés sur phage par biopanning sur la lignée cellulaire NSCLC HCC1511. Ce peptide, désormais appelé MGS4 (anciennement HCC15.2) s'internalise dans environ 54 % (21/39) des lignées NSCLC testées et se lie à 24 % (14/59) des échantillons de biopsie NSCLC humains fixes dans un microréseau tissulaire. Le manque d'internalisation dans les cellules épithéliales bronchiques humaines immortalisées mais non transformées, ainsi que le manque de liaison aux échantillons de tissus pulmonaires adjacents normaux dans les microréseaux tissulaires établissent la spécificité de ce peptide pour les cellules cancéreuses par rapport aux tissus pulmonaires normaux. En tant que tel, MGS4 est une molécule de ciblage prometteuse pour l'administration de cytotoxiques à un sous-ensemble de cancers. Ici, nous optimisons notre peptide principal par une série de modifications chimiques pour créer un peptide de haute affinité qui est stable dans le sérum et capable de livrer une charge intracellulaire dans les cellules cancéreuses. Le peptide résultant abrite une tumeur NSCLC dans un modèle animal. Fait important, nous démontrons que le MGS4 optimisé peut délivrer la protéine cytotoxique saporine spécifiquement aux cellules cancéreuses in vitro et in vivo, résultant en un agent anticancéreux efficace.

MGS4 a été initialement sélectionné par phage display biopanning d'une banque de peptides sur des cellules vivantes. Dans la construction de la bibliothèque, les peptides sont génétiquement fusionnés à la protéine d'enveloppe PIII permettant à un seul peptide d'être affiché en 3 à 5 copies par phage. En tant que tel, une liaison multivalente est souvent nécessaire. Pour déterminer si une liaison multivalente est nécessaire pour l'internalisation de MGS4, des peptides monomères (MGS4_V2) et tétramères (MGS4_V1) ont été synthétisés et étiquetés comme décrit (Figure 1 supplémentaire). Après incubation de différentes concentrations de peptides sur des cellules vivantes, le peptide lié à la surface a été éliminé par des lavages à faible pH, ainsi que par trypsinisation. L'internalisation relative a été mesurée par cytométrie en flux pour déterminer une valeur EC50 qui représente la concentration de peptide produisant une internalisation semi-maximale. Cette mesure est dépendante de l'affinité du peptide pour sa cible cellulaire et du taux d'internalisation. Il s'agit d'une représentation plus précise de la situation biologique et utile pour évaluer les peptides en tant qu'agents d'administration de médicaments. Comme prévu pour l'endocytose médiée par les récepteurs, l'absorption de MGS4 est saturable avec une concentration croissante. La tétramérisation n'a pas modifié de manière significative la CE50, ce qui ne suggère aucun changement apparent dans l'affinité de MGS4 avec la multimérisation (Fig. 1a).

a Liaison et internalisation de MGS4_V1 tétramérique et de MGS4_V2 monomère sur des cellules H1299 vivantes en culture. Les cellules ont été incubées avec le peptide conjugué à la streptavidine-phycoérythrine pendant 1 h à 37 ° C. Le peptide non internalisé a été éliminé et les cellules ont été analysées par cytométrie en flux. b Les cellules H1299 ont été incubées avec MGS4_V1 ou MGS4_V2 conjugué à de la streptavidine-Alexa Fluor 555 (rouge) pendant 1 h, lavées, fixées et contre-colorées avec WGA-Alexa Fluor 488 (vert, membrane cellulaire) et DAPI (bleu, noyaux) et analysées par microscopie à fluorescence. La barre d'échelle représente 20 µm. MGS4_V1 et MGS4_V2 s'intériorisent à un degré similaire et se localisent vers une destination similaire. c Les peptides monomériques MGS4 tronqués ont une EC50 similaire à celle du peptide parental de pleine longueur. Les mesures individuelles sont affichées. La moyenne est indiquée par un "X" et les barres d'erreur noires représentent l'erreur standard pour un minimum de trois répétitions expérimentales (SEM). Toutes les données de liaison originales et l'analyse de régression non linéaire des données sont incluses dans les documents supplémentaires.

L'endocytose est souvent déclenchée par la multimérisation des récepteurs à la surface des cellules. Cependant, les données suggèrent que MGS4 s'internalise dans le format monomère. Pour vérifier l'internalisation, le peptide a été conjugué à Streptavidin-Alexa Fluor 555 et incubé avec des cellules vivantes. L'internalisation a été déterminée par microscopie confocale à fluorescence. MGS4_V2 a montré une intériorisation claire comme celle observée pour MGS4_V1. Les deux valences se localisent dans des points ponctuels discrets dans la région périnucléaire (Fig. 1b). Ainsi, MGS4_V2 lie les cellules cancéreuses avec une faible affinité nanomolaire et délivre des cargaisons dans les cellules vivantes. Comme la synthèse du peptide monomère nécessite moins de la moitié du temps et un quart des matériaux à produire, le monomère MGS4_V2 a été utilisé pour d'autres optimisations.

Pour déterminer quels acides aminés sont cruciaux pour la liaison cellulaire, le MGS4 monomère a été synthétisé avec des troncatures séquentielles d'acides aminés à partir des extrémités. L'impact de chaque suppression sur l'internalisation a été déterminé (tableau 1). Deux acides aminés C-terminaux, l'alanine et la proline, peuvent être tronqués avec seulement une diminution d'environ 3 à 5 fois de l'affinité (MGS4_V3 et MGS4_V4). Si le troisième acide aminé, la thréonine, est également supprimé (MGS4_V5), toute absorption est perdue. De même, si le premier acide aminé N-terminal phénylalanine est tronqué (MGS4_V6), l'absorption est supprimée. Bien que tous les acides aminés intermédiaires ne soient pas nécessairement cruciaux pour la liaison, MGS4_V4 ne peut pas être tronqué plus loin des extrémités. Alors que l'affinité est diminuée d'environ 3 fois avec cette troncature, il est avantageux d'éliminer la proline à l'extrémité C-terminale à des fins pratiques ; la proline est sensible à la racémisation lors du couplage peptidique, l'amine secondaire de la proline ralentit le couplage de l'acide aminé suivant et la proline peut réduire le rendement synthétique global12.

La stabilité du sérum est souvent citée comme une limitation des peptides, la dégradation prédominante étant le clivage par les peptidases N-terminales et C-terminales. L'extrémité C-terminale est protégée de la dégradation par l'amidation, un acide aminé biotinylé et un lieur PEG (Figure 1 supplémentaire). L'extrémité N-terminale, cependant, contient un acide aminé naturel non modifié, la phénylalanine, qui, si elle est éliminée, entraîne une perte totale d'internalisation. La protection contre la dégradation est donc cruciale. L'acétylation de l'extrémité amino protège les peptides de la peptidase N-terminale tout en ajoutant un volume stérique minimal13. Cependant, l'acétylation réduit la charge nette et peut altérer la liaison de MGS4 à son récepteur cellulaire.

Pour déterminer si l'acétylation est efficace pour réduire la dégradation sérique de MGS4, des peptides acétylés (MGS4_V8) et non acétylés (MGS4_V4) ont été dissous dans du sérum humain et incubés pendant 48 h à 37 ° C. Les peptides ont été contrôlés par HPLC analytique et les produits ont été vérifiés via MALDI TOF/TOF™ MS. L'acétylation protège MGS4_V8 de la dégradation, avec seulement un peptide de pleine longueur observé (Fig. 2 supplémentaire). En revanche, aucun matériau de départ de MGS4_V4 non protégé n'est observé. Au lieu de cela, un mélange de fragments peptidiques est détecté, dont aucun ne correspond à la masse du peptide de départ (tableau supplémentaire 1 et figure supplémentaire 2). Les produits majeurs sont des fragments plus courts correspondant à la perte des cinq acides aminés N-terminaux. Des fragments liés à QSFYT-PEG11, SFYT-PEG11 et FYT-PEG11 sont observés. Comme nous n'observons pas ces produits de clivage avec MGS4_V8 et que nous sommes incapables d'identifier les masses qui correspondent au fragment FHAVP amino-terminal, les produits de dégradation observés avec le variant non acétylé sont probablement dus au clivage de l'aminopeptidase et non à une endoprotéase.

Pour s'assurer que l'acétylation n'affecte pas l'activité peptidique, les CE50 de MGS4_V4 et MGS4_V8 ont été comparées. L'acétylation n'a pas d'impact significatif sur l'internalisation du MGS4_V8 par rapport au MGS4_V4 non acétylé (tableau 1). De même, il existe une différence négligeable entre le peptide de pleine longueur acétylé MGS4_V7 et le MGS4_V8 tronqué. Bien qu'il y ait une réduction de la liaison de MGS4_V7 par rapport à MGS4_V2, l'affinité en tant que peptide monomère est toujours dans la plage utile pour le ciblage in vivo14,15. Ainsi, l'acétylation est un moyen efficace de protéger l'extrémité N-terminale de MGS4 sans abroger la liaison à la cible cellulaire.

L'optimisation de MGS4 en tant que monomère est efficace, mais la valence optimale du peptide tronqué peut être différente de celle du peptide de pleine longueur. Le peptide a été synthétisé sous forme de monomère (MGS4_V8), de dimère (MGS4_V9) et de tétramère (MGS4_V10). Pour obtenir des données quantitatives, nous sommes passés de la mesure de la fluorescence relative du peptide marqué par un colorant à la détermination du nombre moyen de molécules de colorant intériorisées par cellule. En utilisant cette approche, la CE50 pour MGS4_V8 sur les cellules H1299 est légèrement supérieure à celle précédemment calculée (21 contre 38 nM) mais se situe dans l'erreur du test. Le dimère MGS4_V9 a une EC50 7 fois plus faible, ce qui indique qu'il existe un effet synergique en passant d'un monomère à un dimère (Fig. 2a et Tableau 2). Cependant, il n'y a qu'une diminution de 2 fois pour passer d'un dimère à un peptide tétramérique (MGS4_V10). Nous avons également calculé l'EC50 sur trois autres lignées cellulaires NSCLC (tableau 2 et figure supplémentaire 3). Dans tous les cas, les CE50 sont les mêmes avec une erreur expérimentale suggérant que l'affinité de MGS4 est indépendante du type de cellule. Le nombre moyen de peptides intériorisés par cellule dans des conditions de saturation varie, les cellules H1993 intériorisant le plus grand nombre de peptides aux trois valences (tableau 2). Cela est probablement dû aux différents niveaux d'expression des récepteurs sur le type de cellule. La moyenne des molécules internalisées à 50 nM en une heure suit la même tendance (Fig. 2b). De plus, MGS4_V8 et MGS4_V9 conservent leur spécificité vis-à-vis des lignées cellulaires NSCLC ; une internalisation minimale est observée dans une lignée cellulaire épithéliale bronchique humaine normale (Fig. 2b).

a MGS4_V8, MGS4_V9 ou MGS4_V10 ont été conjugués avec de la streptavidine-Alexa Fluor 647 et des cellules H1299 ont été incubées avec le conjugué marqué pendant 1 h. Le peptide non intériorisé a été éliminé et le nombre moyen de peptides intériorisés par cellule a été déterminé pour calculer la CE50. Les mesures individuelles sont affichées. La moyenne est représentée par un "X". Les barres d'erreur, en noir, représentent les mesures d'erreur standard et sont inférieures à la hauteur des symboles dans certains cas. b Le nombre moyen de molécules peptidiques par cellule à 50 nM à 1 h a été déterminé sur quatre lignées cellulaires NSCLC et une lignée cellulaire épithéliale bronchique humaine normale (HBEC). Les barres d'erreur représentent SEM et les points de données individuels sont affichés. c Les cellules H1299 ont été incubées avec 50 nM de peptide-streptavidine-Qdot605 pendant 1 h, retirées et remplacées par un milieu de croissance normal. Après 24 h, les cellules ont été fixées et contre-colorées avec du DAPI (bleu). Les piles z projetées au maximum représentatives pour chaque groupe ne révèlent aucune différence apparente dans l'internalisation ou la localisation des peptides. La barre d'échelle représente 10 µm.

Alors que l'EC50 diminue avec la valence, le nombre de peptides intériorisés par cellule à saturation affiche peu de dépendance à la valence dans les quatre lignées cellulaires. Ainsi, les variants de MGS4 de valences différentes atteignent la même absorption maximale, mais à des concentrations différentes (Fig. 2b, Tableau 2). De même, toutes les valences s'intériorisent et circulent vers un emplacement similaire (Fig. 2c). L'augmentation du coût en matériaux et en temps pour synthétiser le dimère et le tétramère produit un effet de rendement décroissant. De plus, le monomère a le potentiel d'être cloné directement sur des protéines pour être délivré. Pris ensemble, nous avons avancé avec le monomère MGS4_V8.

Le trafic interne de conjugués médicamenteux après internalisation a des répercussions importantes sur l'efficacité ; la cargaison doit pouvoir atteindre sa cible cellulaire pour produire l'effet biologique recherché. Une série de cellules H1299 stables spécifiques aux organites, marquées à la GFP, ont été générées dans lesquelles les noyaux, le RE, l'appareil de Golgi, le lysosome, les mitochondries, le cytosol ou la membrane plasmique ont été marqués. Chaque lignée cellulaire a été traitée avec MGS4_V8-Streptavidin Alexa Fluor 555. Au bout d'une heure, la colocalisation de MGS4_V8 a été observée dans des cellules marquées au lysosome, sous forme de pixels jaunes indiqués par des flèches rouges sur la figure 3a. MGS4_V8 ne s'est pas accumulé dans les autres emplacements subcellulaires et n'a pas non plus été observé sur la membrane cellulaire.

a Les cellules H1299 ont été marquées avec des protéines spécifiques aux organelles marquées GFP pour ER, Golgi, lysosome, mitochondries, noyau, membrane plasmique et cytosol (vert). Les cellules ont été incubées avec 50 nM de MGS4_V8-Streptavidine Alexa Fluor 555 (rouge) pendant 1 h à 37 °C, puis fixées et contre-colorées avec du DAPI (bleu). MGS4_V8 colocalise avec les lysosomes observés sous forme de points ponctués jaunes indiqués par les flèches rouges. Aucune colocalisation significative n'est observée avec d'autres organites subcellulaires. b Les cellules H1299 marquées au lysosome (vertes) ont été incubées avec 50 nM de MGS4_V8-Streptavidine Alexa Fluor 555 (rouge) pendant 0,5, 1, 4 ou 24 h, puis lavées, fixées et contre-colorées avec du DAPI (bleu). Des images représentatives d'une seule tranche de z sont affichées. On peut voir des vésicules remplies de peptides se diriger vers les lysosomes à 30 min, beaucoup se localisant déjà à 1 h. La plupart des peptides se trouvent dans les lysosomes à 4 h et y sont retenus à 24 h. c Piles z compressées projetées au maximum à partir d'images dans le panneau b. La barre d'échelle dans toutes les images représente 10 µm.

Les cellules marquées au lysosome (vertes) ont été traitées avec MGS4_V8-Streptavidin Alexa Fluor 555 pendant 30 min, 1 h, 4 h ou 24 h. Des vésicules contenant des peptides (rouges) sont observées à 30 min séparées des lysosomes marqués, qui en 1 h ont commencé à colocaliser avec des vésicules lysosomales (jaunes). MGS4_V8 reste colocalisé avec les lysosomes à 24 h avec> 70% du signal colocalisé avec les lysosomes (Fig. 3b). Le trafic, l'accumulation et la rétention dans les lysosomes sont encore plus évidents dans la pile z comprimée projetée au maximum des cellules (Fig. 3c). Il convient de noter que la régénération lysosomale est observée à 24 h, comme en témoigne l'augmentation du signal vert de la GFP qui n'est pas colocalisée avec MGS4_V8 précédemment intériorisé.

La saporine est une protéine inactivant les ribosomes (RIP) qui fonctionne en clivant l'ARNr 28S ribosomique, ce qui arrête la synthèse des protéines16,17,18. L'activité d'inactivation des ribosomes de la saporine est catalytique, nécessitant peu de molécules pour inactiver les ribosomes dans une cellule. Saporin n'a pas de domaine d'internalisation; il n'a pas de tropisme pour les cellules humaines et la toxine n'est pas internalisée à moins qu'elle ne soit liée à un ligand d'internalisation cellulaire. Pour déterminer si MGS4_V8 délivre une toxine protéique active de manière intracellulaire, le peptide biotinylé a été conjugué à de la saporine marquée à la streptavidine. Comme on le voit sur la figure 4a, MGS4_V8 assure la médiation de l'internalisation de la saporine dans les cellules H1299. En revanche, la saporine conjuguée au peptide contrôle MGS4_V6 ne pénètre pas dans les cellules, démontrant l'exigence du peptide de ciblage fonctionnel pour faciliter sa délivrance intracellulaire.

a Les cellules H1299 ont été incubées MGS4_V8 biotinylées conjuguées à la streptavidine-saporine pendant 1 h, puis lavées, fixées et contre-colorées avec un anticorps anti-saporine (rouge), WGA-AF488 (vert) et DAPI (bleu). MGS4_V8 délivre avec succès de la saporine dans les cellules cancéreuses alors que le peptide contrôle, MGS4_V6 ne le peut pas. b Les conjugués de saporine MGS4_V8 et MGS4_V9 ont été dilués en série et incubés avec des cellules H1299 et H2009 pendant 6 h, après quoi les conjugués MGS4-saporine ont été retirés et le milieu de croissance complet remis dans les puits. A 72 h, la viabilité a été mesurée. Les valeurs IC50 sont fournies dans l'encart. Les mesures individuelles sont affichées. La moyenne est représentée par un "X". Les barres d'erreur, en noir, représentent les mesures d'erreur standard. L'analyse de régression non linéaire est incluse dans le matériel supplémentaire. c Évolution temporelle de la colocalisation comme précédemment, en comparant le trafic MGS4_V8-streptavidine-Qdot au trafic MGS4_V8-saporine. Les pixels sont tracés en fonction de l'intensité dans le canal rouge (axe x) et le canal vert (axe y). L'encadré 1 représente la population de saporine ou Qdots non colocalisée avec le lysosome. Inversement, la case 2 représente la coloration lysosomale non associée aux Qdots ou au signal de saporine. La boîte 3 contient des pixels colocalisés, qui sont faussement colorés en jaune et représentent la saporine ou les Qdots colocalisés dans le compartiment lysosomal. Une sous-population de vésicules contenant des saporines reste distincte des lysosomes (encadré 1). La barre d'échelle dans toutes les images représente 10 µm.

La capacité du conjugué MGS4_V8-saporine à induire la mort cellulaire a été déterminée. MGS4_V8-saporine tue les cellules H1299 avec une IC50 de 9,4 nM. Les cellules H2009 sont légèrement plus résistantes, avec une IC50 de 23 nM (Fig. 4b). Dimeric MGS4_V9-saporine a une IC50 de 7,2 nM et 40 nM sur les cellules H1299 et H2009, respectivement. Ni le MGS4_V8 seul ni le MGS4_V9 conjugué à la streptavidine sans saporine n'ont montré de toxicité même jusqu'à des concentrations de 200 nM (Fig. 4a supplémentaire). De plus, le traitement avec le MGS4_V6 inactif complexé à la saporine n'atteint pas 50 % de mort cellulaire dans les cellules H1299 et H2009 à 200 nM. Les cellules HBEC de contrôle normales n'atteignent pas 50% de viabilité cellulaire avec MGS4_V8 ou MGS4_V6 (Fig. 4b supplémentaire). Bien que MGS4_V9 ait une CE50 inférieure pour les deux types de cellules, la dimérisation n'améliore pas la CI50 ou la puissance du conjugué de saporine, validant le choix du peptide monomère comme agent de délivrance.

La coloration à la saporine (Fig. 4) ressemble étonnamment à la coloration MGS4 précédente (Fig. 3c): ponctuée et périnucléaire. Cependant, pour induire la mort cellulaire, la saporine intériorisée doit accéder aux ribosomes dans le cytoplasme. Les résultats de viabilité cellulaire suggèrent qu'au moins une partie de la saporine atteint le cytoplasme. Cela est probablement dû à la fuite endosomale médiée par la saporine avant le trafic vers les lysosomes. Pour observer l'évasion endosomale, une analyse temporelle a été effectuée pour évaluer la colocalisation de la saporine avec les lysosomes. Le MGS4_V8 biotinylé a été conjugué à une streptavidine-Qdot605 ou à une streptavidine-saporine, et le conjugué a été incubé avec des cellules H1299 pendant 30 min, 1 h, 1 h avec une poursuite de 3 heures ou 1 h avec une poursuite de 23 heures. La saporine et les Qdots circulent et s'accumulent dans les lysosomes (jaune) au fil du temps (Fig. 4c). Cependant, il existe une population discrète de vésicules chargées de saporine (rouge) qui échappent au trafic vers le lysosome, qui ne sont pas observées dans l'échantillon Qdot. Ceci est particulièrement évident à 1 heure. Ces vésicules contenant des saporines non colocalisantes sont mises en évidence par le coefficient de Mander; la saporine montre moins de colocalisation par rapport aux Qdots à 1 h (0,334 contre 0,549 respectivement) et 24 h (0,657 contre 0,758 respectivement) (tableau 3). Ces données suggèrent qu'une fraction de la saporine s'échappe du trafic lysosomal dans le cytosol pour exercer la destruction cellulaire. Comme l'activité de la saporine est catalytique, une fraction suffit pour tuer efficacement.

L'utilisation de MGS4 comme agent de délivrance repose sur sa capacité à cibler une tumeur chez un animal. MGS4_V8 et MGS4_V6 (contrôle) ont été conjugués directement à Alexa Fluor 750. Chaque conjugué a été injecté par voie intraveineuse à des souris immunodéprimées porteuses de tumeurs sous-cutanées H2009, et l'accumulation du peptide a été mesurée par imagerie proche infrarouge (Fig. 5a). Le homing tumoral MGS4_V8 est observé à 12 h et 85 % de ce signal est maintenu à 24 h. Le signal MGS4_V8 reste à 48 et 72 h, indiquant une rétention persistante du colorant dans la tumeur. À tout moment, MGS4_V8 a un signal accru de 25 à 40 fois par rapport au peptide témoin. Par comparaison, il n'y a pas de différence statistiquement significative entre le signal issu de MGS4_V6 et les tumeurs non traitées (fond). Les tumeurs imagées ex vivo à 72 h affichaient un schéma similaire. Les tumeurs ont été fixées dans du paraformaldéhyde, suivies d'une imagerie de la tumeur entière sur un LI-COR® Odyssey (Fig. 5b). Une nette différence visuelle existe entre les tumeurs isolées des souris traitées avec MGS4_V8 par rapport à celles traitées avec le contrôle MGS4_V6 ou non traitées. La quantification de la fluorescence entraîne un signal 240 fois plus élevé dans les tumeurs traitées au MGS4_V8 par rapport au groupe MGS4_V6. Des résultats similaires ont été obtenus lorsque des tumeurs H1299 sous-cutanées ont été établies chez des souris (Fig. 5 supplémentaire). Ensemble, ces données ont indiqué que MGS4_V8 a la spécificité, l'affinité et la stabilité nécessaires pour cibler une tumeur in vivo. La rétention du signal à 72 h suggère que MGS4_V8 est intériorisé dans les cellules cancéreuses de la tumeur et que le colorant NIR reste piégé.

une tumeur H2009 portant des souris nues (N = 4) ont reçu une injection IV de MGS4_V8 ou MGS4_V6 conjugué au colorant NIR Alexa Fluor 750. À 12, 24, 48 et 72 h après l'injection, les souris ont été anesthésiées et imagées sur un IVIS® (Perkin Elmer ) pour mesurer l'efficacité radiante totale dans chaque tumeur. MGS4_V8 s'accumule dans la tumeur 25 à 39 fois mieux que le peptide témoin, MGS4_V6. L'accumulation de MGS4_V6 n'est statistiquement pas différente des tumeurs non traitées. L'imagerie NIR ex vivo des tumeurs à la fin de l'expérience reflète les données observées chez les animaux vivants. Les moustaches représentent les valeurs min à max, les 25e à 75e centiles sont représentés par la boîte, la ligne montre la médiane, le symbole + représente la moyenne et les données individuelles sont représentées par un point. Les données pour les animaux individuels sont incluses dans le tableau supplémentaire 8. b Les tumeurs excisées de l'expérience précédente ont été fixées dans du PBS + 4 % de formaldéhyde, puis imagées à nouveau ensemble sur un LI-COR® Odyssey. Les unités de fluorescence arbitraires (AFU) ont été déterminées pour chaque tumeur et la moyenne et le SEM sont indiqués sous l'image. L'intensité moyenne de fluorescence est 240 fois plus élevée pour le conjugué MGS4_V8-Alexa Fluor 750 que pour le conjugué témoin MGS4_V6. c La saporine a été conjuguée soit à MGS4_V8 ciblant soit à MGS4_V6 non ciblant et 7,5 µg du conjugué ont été injectés IV à des souris porteuses de tumeurs sous-cutanées. Les animaux ont reçu une dose 2 fois par semaine pendant 2,5 semaines (indiqué par des flèches). Les tumeurs ont été mesurées tous les deux jours. MGS4_V8-saporine ralentit clairement la croissance tumorale, tandis que la saporine non ciblée n'a aucun effet par rapport aux animaux non traités. Les barres d'erreur représentent SEM, *p-value < 0,05, **p-value < 0,01, ***p-value < 0,001, ****p-value < 0,0001 (ANOVA bidirectionnelle). d La taille de la tumeur (mm3) est indiquée pour les animaux individuels aux jours 0, 6, 12 et 18. La valeur moyenne est représentée par la ligne horizontale et les barres d'erreur représentent l'erreur standard. Il n'y a aucune différence statistique entre MGS4_V6-Saporin et non traité à n'importe quel jour. Aux jours 12 et 18, MGS4_V8-Saporin est statistiquement différent de celui non traité (valeurs p 0,0099 et 0,0029, respectivement) et MGS4_V6-Saporin (valeurs p 0,0069 et 0,0009, respectivement).

Pour établir l'efficacité dans un modèle animal, des tumeurs H2009 ont été implantées par voie sous-cutanée sur les flancs de souris nude femelles. Lorsque les tumeurs H2009 ont atteint environ 100 mm3, les souris ont reçu une injection de 7,5 µg de MGS4_V8-saporine ou 7,5 µg de MGS4_V6-saporine acétylée (peptide témoin) via la veine caudale, 2x/semaine pour un total de 5 injections. La saporine ciblée par MGS4_V8 a considérablement ralenti la croissance tumorale par rapport au peptide témoin (Fig. 5c, d). Bien que la tumeur ne soit pas éliminée au cours du traitement, le volume tumoral est resté statique pendant les 10 premiers jours de traitement. En comparaison, les tumeurs traitées avec la saporine non ciblée avaient augmenté de 3 fois leur taille. Au jour 18, les tumeurs traitées avec la saporine ciblée par MGS4_V8 étaient la moitié de la taille de celles de l'un ou l'autre des groupes témoins. Le traitement de saporine non ciblé de contrôle, MGS4_V6-saporine, n'est pas différent des tumeurs non traitées, soulignant la nécessité de MGS4_V8 pour la délivrance de la saporine.

Les ligands ciblant les tumeurs sont des composants clés des systèmes d'administration de médicaments contre le cancer. Bien que les anticorps monoclonaux soient les agents de ciblage disponibles en clinique les plus avancés, les peptides émergent comme une alternative viable19,20,21. Comparés aux anticorps, les peptides ont un temps de développement plus rapide et des coûts de production inférieurs car ils sont facilement synthétisés, ce qui permet une optimisation rapide et itérative de leur stabilité, affinité, spécificité, solubilité et hydrophobicité. Les peptides sont également plus petits, permettant une pénétration plus profonde dans le traitement des tumeurs solides22. La plupart des peptides de ciblage se sont concentrés sur des ligands peptidiques naturels ou des analogues apparentés qui se lient aux récepteurs régulés positivement dans le cancer, par exemple la bombésine, l'hormone de libération de l'hormone lutéinisante et le tripeptide RGD. 177Lu-Dotatate, un dérivé radiomarqué de la somatostatine a reçu l'approbation accélérée de la FDA au début de 2018 et est le premier conjugué peptide-médicament approuvé23. ANG1005, un peptide ciblant la protéine 1 liée au récepteur LDL conjugué au paclitaxel est en essai clinique pour le traitement des métastases cérébrales24 et TH1902, un conjugué docétaxel à un peptide de liaison à la sortiline, est récemment entré dans les essais cliniques de phase I25.

Le biopanning de bibliothèques de peptides présentés sur phage permet une sélection rapide de peptides qui se lient et initient l'internalisation spécifiquement dans les cellules cancéreuses11. La capacité de dépister l'internalisation est essentielle pour les applications d'administration de médicaments, car la plupart des agents chimiothérapeutiques ont des cibles intracellulaires ; les ligands et/ou les récepteurs qui ne s'intériorisent pas ou qui ont une absorption cellulaire lente sont peu susceptibles d'être de bons candidats. Cette approche est robuste et a conduit à l'identification de nombreux agents de ciblage peptidique à haute spécificité cellulaire10. Le processus de sélection est impartial et ne nécessite pas de connaissance du répertoire de surface cellulaire. Bien que le récepteur cellulaire du MGS4 reste inconnu, la liaison peptidique peut servir de biomarqueur de substitution sans connaître sa cible cellulaire. Des études sont en cours pour identifier le récepteur cellulaire et établir ses niveaux d'expression dans les tissus normaux.

Les résultats initiaux de ces sélections sont des composés principaux, sélectionnés en tant que fusions avec la protéine d'enveloppe pIII sur le phage filamenteux. Ici, nous avons identifié le domaine de liaison minimal de MGS4 et l'avons optimisé chimiquement pour améliorer l'affinité et la stabilité. Les peptides sont souvent cités comme de mauvais agents de ciblage par rapport aux candidats anticorps en raison de leur stabilité sérique limitée et de leurs affinités plus faibles. Cependant, nous démontrons qu'un peptide monomérique a une faible affinité nanomolaire pour ses cellules cibles, comparable aux anticorps tout en étant de 1/100e de la taille. La modification des deux extrémités stabilise le peptide dans le sérum. Surtout, MGS4_V8 déclenche une internalisation rapide dans la cellule. Cela contraste avec de nombreux anticorps thérapeutiques qui ont été développés contre des récepteurs qui ont des taux d'internalisation lents26,27. De manière surprenante, la version monomère s'internalise dans la même mesure que les peptides dimères et tétramères et se dirige vers le même emplacement subcellulaire. Selon le type de cellule, 40 000 à 100 000 molécules de peptide par cellule sont internalisées en 1 h, atteignant une concentration intracellulaire de 40 à 100 nM28. Des études cinétiques complémentaires sont en cours pour déterminer si la concentration intracellulaire du peptide augmente avec le temps. Il convient de noter que le fait d'avoir une série de ligands avec une gamme d'affinités pour une cible spécifique à la tumeur et des taux variables d'internalisation pourrait être utile comme moyen d'aborder la barrière d'affinité14. Ce phénomène gêne parfois la pénétration dans une tumeur car le ligand est rapidement séquestré par les premières cellules tumorales qu'il rencontre.

MGS4_V8 peut être modifié pour transporter une variété de cargaisons dans les cellules sans altérer ses propriétés de liaison cellulaire ou de spécificité. Ceci est clairement indiqué dans cette étude car MGS4 a livré des protéines (streptavidine, saporine), des colorants et des points quantiques. Un traitement idéal pour une administration ciblée devrait avoir plusieurs caractéristiques clés. Premièrement, le produit thérapeutique doit être imperméable aux cellules sauf lorsqu'il est conjugué à un agent de délivrance, limitant les effets potentiels hors cible s'il est libéré prématurément de son support. Deuxièmement, il devrait être efficace à faibles doses, car il est peu probable que l'absorption médiée par les récepteurs atteigne des concentrations intracellulaires réalisables avec des thérapies à petites molécules perméables aux cellules. Troisièmement, il doit s'échapper des vésicules intracellulaires pour atteindre sa cible. Saporin répond à tous ces critères. Il s'agit d'une RIP de type 1 sans tropisme natif pour les cellules de mammifères et incapable de traverser la membrane cellulaire sans véhicule de délivrance. En tant qu'enzyme ARNr N-glycosidase, la saporine inactive catalytiquement la grande sous-unité ribosomale et ne nécessite pas de quantités stoechiométriques pour inactiver sa cible. Cette activité perturbe la synthèse des protéines dans les cellules quiescentes et en division active. La saporine peut s'échapper des vésicules intracellulaires pour atteindre le cytoplasme et d'autres organites subcellulaires29. Enfin, des mécanismes d'action supplémentaires pour la saporine indépendants de son activité N-glycosidase ont été identifiés, augmentant sa cytotoxicité potentielle30,31,32,33. La conjugaison de la saporine à un agent de ciblage spécifique aux cellules qui déclenche l'internalisation ouvre son potentiel thérapeutique.

Le couplage de MGS4_V8 biotinylé à un conjugué saporine-streptavidine donne un agent cytotoxique. L'IC50 est inférieure à l'EC50 pour la liaison et l'internalisation des peptides en raison de la nature catalytique de la saporine. Une préoccupation potentielle est le piégeage et la dégradation potentiels de la saporine dans le lysosome. L'endocytose du peptide MGS4_V8 entraîne une accumulation lysosomale qui augmente avec le temps. À 30 min, MGS4_V8 marqué n'est pas colocalisé avec le lysosome mais est observé dans des vésicules ponctuées qui sont probablement des compartiments endosomaux. En 1h, 70% du peptide est localisé dans le lysosome. Pourtant, le conjugué MGS4_V8-saporine démontre une cytotoxicité cellulaire, probablement due au fait qu'une partie de la saporine échappe au trafic lysosomal. Nos données de microscopie indiquent qu'il existe une sous-population discrète de MGS4_V8-saporine qui n'est pas colocalisée avec le lysosome, ce qui correspond à la capacité de la saporine à s'échapper de l'endosome. Cette population est probablement petite car une coloration cytoplasmique diffuse n'est pas observée mais suffisamment élevée pour affecter la viabilité cellulaire. Les approches visant à faciliter davantage l'échappement endosomal/lysosomal de la saporine peuvent améliorer l'efficacité des conjugués MGS4-saporine34,35,36. Il est important de noter que MGS4_V8 a un potentiel en tant que conjugué peptide-médicament dans lequel le trafic lysosomal de conjugués de médicaments permet l'utilisation de lieurs labiles acides ou clivables par la cathepsine pour libérer le médicament21.

Les conjugués de saporine ont servi d'outils biologiques utiles, mais ont également un potentiel en tant que thérapeutiques cliniques16,17,18. La saporine a été conjuguée à différentes fractions de ciblage, dont la majorité sont à base d'anticorps37. Nous démontrons que MGS4_V8-saporine a une efficacité anti-tumorale dans un modèle murin. L'utilisation du peptide MGS4_V6 non ciblant n'entraîne aucune réduction de la taille de la tumeur par rapport au témoin non traité. Bien qu'un profil pharmacocinétique et de toxicité complet n'ait pas encore été réalisé, aucune toxicité brute n'a été observée. Des études complètes de biodistribution et de toxicologie sont nécessaires pour traiter les effets hors cible. De plus, des améliorations du lieur MGS-saporine sont nécessaires. Cependant, ces données démontrent que MGS4_V8 peut délivrer de la saporine active à une tumeur chez un animal lorsqu'il est administré par voie intraveineuse et appuient une exploration plus approfondie dans des modèles précliniques.

Deux essais cliniques de phase I/II de conjugués immuno-saporines sont terminés. Le premier utilisait un conjugué anticorps anti-CD30 de souris-saporine pour le traitement du lymphome hodgkinien réfractaire38. Malgré des réponses cliniques prometteuses, les patients ont développé une réponse immunitaire contre à la fois l'anticorps et la toxine. Le syndrome de fuite vasculaire (VLS) a été observé comme une toxicité dose-limitante. Un deuxième essai utilisant un anticorps bispécifique contre le CD22 et la saporine a démontré moins d'effets secondaires, y compris une réduction du VLS et aucune réponse immunitaire antisaporine39. Les deux essais ont été menés avec des anticorps de souris de première génération. Bien qu'il n'y ait eu aucun essai clinique récent sur les conjugués de saporine pour le traitement du cancer, la saporine conjuguée à la substance P pour la gestion de la douleur s'est avérée sûre dans un essai clinique de phase I (NCT02036281) et a été utilisée avec succès pour la gestion de la douleur chez les chiens atteints de cancer des os40.

Un nombre croissant d'agents de ciblage contre les biomarqueurs du cancer a accru l'intérêt pour les immunotoxines41,42,43,44,45,46,47. L'ingénierie des toxines pour éliminer les épitopes immunogènes et l'activité VLS continue de progresser48,49,50,51. En plus de la saporine, les toxines RIP d'origine végétale gélonine, ricine et protéine antivirale pokeweed ont été utilisées dans les immunotoxines52, y compris l'achèvement d'un essai de phase I d'un immunoconjugué anti-CD33-gélonine pour le traitement des tumeurs malignes myéloïdes réfractaires53. De plus, des toxines d'origine bactérienne, telles que l'exotoxine A de Pseudomonas et la toxine diphtérique, ont été utilisées comme fractions thérapeutiques pour les immunotoxines54,55,56,57. Ontak, une protéine de fusion interleukine-2-toxine diphtérique, a été approuvée par la FDA pour le lymphome cutané à cellules T, mais a depuis été interrompue en raison de problèmes de production. Tagraxofusp est une toxine diphtérique ciblée sur l'IL-3 dont l'utilisation clinique a été approuvée en 2018 pour le traitement du néoplasme des cellules dendritiques plasmacytoïdes blastiques58. Lumoxiti, un conjugué CD22-PE38 a reçu l'approbation de la FDA en 2018 pour la rechute ou la leucémie à tricholeucocytes réfractaire59. Une réponse complète durable chez 30 % des patients a été obtenue dans l'essai de phase III.

En résumé, nous avons développé un peptide de haute affinité, spécifique du cancer, capable de délivrer des toxines protéiques actives aux cellules NSCLC in vitro et in vivo. Ce peptide peut servir de remplacement d'anticorps dans les ADC traditionnels, réduisant ainsi les coûts et le temps de production. La capacité de conjuguer chimiquement la cargaison d'une manière chimiquement définie est un avantage par rapport à l'ADC. Comme le peptide MGS4 parental se lie à plusieurs types de cellules cancéreuses au-delà du NSCLC, nous prévoyons que MGS4_V8 trouvera une utilité étendue dans d'autres types de cancer. Les variants du peptide MGS4 peuvent être incorporés dans une variété de toxines protéiques différentes, soit par génie génétique, soit par conjugaison chimique, augmentant ainsi sa valeur.

La résine NovaPEG Rink Amide et le FMOC-Glu(biotinyl-PEG)-OH ont été achetés auprès de NovaBiochem® (Millipore Sigma, Billerica, MA). Hexafluorophosphate de 2-(6-chloro-1H-benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tétraméthylaminium (HCTU), N,N-diméthylméthanamide, N-méthylmorpholine, acide 2,2,2-trifluoroacétique et tous les acides aminés FMOC ont été achetés auprès de Gyros Protein Technologies (Tucson, AZ). Le FMOC-NH-(PEG)11-COOH (C42H65NO16) a été acheté chez Polypure (Oslo, Norvège). Le triisopropylsilane et le 1,2-éthanedithiol ont été achetés chez Sigma Aldrich (Livermore, CA). La pipéridine a été achetée chez Alfa Aesar (Tewksbury, MA) et l'acétonitrile, le dichlorométhane, l'éther diéthylique chez VWR (Radnor, PA).

Les constructions marquées GFP suivantes ont été utilisées : le marqueur de membrane plasmique Src-myrisylé-GFP, pmyr GFP (plasmide Addgene # 50528) était un cadeau de Kenneth Yamada. Étiquette de Golgi bêta-1,4-galactosyltransférase 1-GFP, PA-GFP (plasmide Addgene # 57164), lysosome Label Lamp-1-GFP, Emerald-lysosome-20 (plasmide Addgene # 56476). Étiquette ER SigPep-eGFP-KDEL, mEGFP-réticulum endoplasmique (plasmide Addgene # 56455), étiquette mitochondriale sous-unité du récepteur d'importation mitochondriale translocase de la membrane externe sous-unité 20 kDa-GFP, mEmerald-TOMM20-N-10 (plasmide Addgene # 54282), noyau l'étiquette SV40 NLS-GFP, mEmerald-nucleus 7 (plasmide Addgene # 54206) et l'étiquette de cytoplasme Argonaut 3 isoforme A-GFP, mEmerald-EIF2C3-C18 (plasmide Addgene # 54078) étaient des cadeaux de Michael Davidson. Golgi label Tyrosyl protein sulfotransferase 2, TPST2-EGFP était un cadeau de David Stephens (plasmide Addgene # 66618). Les sélections ont été réalisées en G418 ou en dilution limite.

La synthèse, le clivage, la purification et la multimérisation des peptides ont été accomplis par synthèse en phase solide comme précédemment publié60. Des peptides multimériques ont été synthétisés sur un noyau de lysine (dimère) ou de trilysine (tétramère). Les structures peptidiques (Figure 1 supplémentaire) sont fournies dans des documents supplémentaires. Les masses de peptides ont été confirmées par spectrométrie de masse MALDI/TOF et pures à plus de 95 % comme déterminé par HPLC analytique.

Les lignées cellulaires ont été fournies par John Minna et Adi Gazdar (UT Southwestern Medical Center) ou achetées auprès de l'ATCC® et maintenues dans du RPMI additionné de glutamine + 5 % de sérum bovin fœtal (Gemini Bio-Products, Sacramento, CA). Les cellules ont été génotypées (Bio-synthèse, Lewisville, TX) pour confirmer l'identification et l'évaluation mensuelle de l'infection à Mycoplasma.

Le peptide biotinylé a été conjugué à la streptavidine-R-phycoérythrine ou à la streptavidine-Alexa Fluor 647 (rapport molaire 1: 1) pendant 30 min. Les sites de liaison ouverts sur la streptavidine ont été désactivés avec du RPMI 1640 et dilués à la concentration indiquée. Les cellules tumorales ont été cultivées jusqu'à 90 % de confluence dans une plaque à 12 puits, puis incubées avec 500 ul de conjugué peptide-colorant à 37 °C. Après 1 h, le peptide a été retiré et les cellules ont été lavées 3x avec du PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1,8 mM KH2PO4, pH 7,4), 2x avec 0,1 M HCl-glycine pH 2,2 dans 0,9% NaCl et rinçage PBS 1x. Les cellules ont été éliminées par trypsinisation. La cytométrie en flux a été réalisée sur un BD FACSCelesta et les données ont été analysées sur le logiciel Flowing. Les cellules ont été fermées sur la base de la diffusion avant et latérale pour inclure uniquement les cellules viables et un minimum de 10 000 événements ont été comptés. Une région contenant <5 % des cellules dans le contrôle négatif a été établie, et l'absorption relative des peptides par l'intensité de fluorescence moyenne de cette population11. Pour l'absorption absolue de peptides par cellule, une courbe standard a été générée à l'aide de microsphères Quantum™ Alexa Fluor 647 (Bangs Laboratory, Fishers, IN). Une régression linéaire représentative montrant la corrélation entre les équivalents de molécules de fluorophores solubles (MESF) et l'intensité de fluorescence moyenne (MFI) est illustrée à la figure supplémentaire 6. les événements ont été comptabilisés. Le MFI a été déterminé à 50 % à la hauteur du pic. Les molécules internalisées par cellule ont été déterminées par la courbe standard reliant MESF à MFI et divisées par le nombre de molécules de colorant/conjugué MGS. Un exemple est illustré à la figure 7 supplémentaire. GraphPad Prism® a été utilisé pour l'ajustement de la courbe de régression non linéaire afin de calculer une EC50. Des paramètres et une analyse statistique sont fournis (tableaux supplémentaires 2 à 6). Les expériences ont été répétées au moins trois fois.

Les plasmides avec des marqueurs spécifiques aux organelles marqués avec GFP ont été achetés chez Addgene (Cambridge, MA) et électroporés dans des cellules H1299. Les cellules tumorales marquées au GFP ont été étalées sur des lames de chambre à 8 puits. Le peptide biotinylé a été conjugué à la streptavidine-Alexa Fluor 555 (1: 1) pendant 30 min à température ambiante et désactivé avec du RPMI, puis ajouté aux puits à 50 nM. Après 1 heure d'incubation, les cellules ont été lavées comme décrit. Les cellules ont été fixées dans du formaldéhyde à 2 %. Un support de montage EverBrite™ (Biotium, Freemont, CA) contenant du DAPI a été utilisé. Lorsque cela est indiqué, la surface cellulaire a été contre-colorée à l'aide d'agglutine de germe de blé (WGA) marquée avec Alexa Fluor 488. La microscopie a été acquise sur un Zeiss LSM 700 avec un objectif Pln Apo 63x/1,4 huile DIC III. Les images ont été traitées à l'aide du logiciel Zen.

L'évolution temporelle de l'accumulation lysosomale a été réalisée par imagerie aux moments indiqués à l'aide d'un peptide biotinylé conjugué à la streptavidine-Alexa Fluor 555, à la streptavidine-Qdot605 ou à la streptavidine-saporine. La saporine a été détectée en utilisant l'anticorps polyclonal de lapin anti-saporine AB-41AP (dilution 1:100) (Advanced Targeting Systems Bio, San Diego, CA). Des seuils ont été établis pour Ch1, représentant le peptide dans le canal rouge (75), et Ch2, représentant le lysosome dans le canal vert (55). Chaque pixel d'une seule tranche a été évalué pour passer le seuil en rouge (boîte 1), vert (boîte 2) ou les deux (boîte 3) pour la colocalisation. Les coefficients de Mander sont calculés pour chaque tranche, 0 indiquant aucune colocalisation et 1 étant une colocalisation complète.

Le peptide biotinylé a été conjugué à de la streptavidine-saporine (Advanced Targeting Systems Bio, San Diego, CA) dans un rapport molaire de 1:1. Des doses croissantes de conjugué peptide-médicament en triple exemplaire ont été incubées sur les cellules pendant 6 h à 37 ° C. Le médicament a été retiré et remplacé par un milieu de croissance complet. Après 72 h, la viabilité cellulaire a été mesurée à l'aide de CellTiter-GLO® (Promega, Madison, WI). La viabilité cellulaire a été normalisée aux cellules non traitées. Les IC50 ont été calculées à l'aide de GraphPad Prism® en utilisant log(agoniste) vs réponse - pente variable (quatre paramètres). Les données des expériences individuelles ainsi que les paramètres et l'analyse statistique sont fournis dans le matériel supplémentaire. Un minimum de quatre répétitions biologiques ont été réalisées pour chaque variant et lignée cellulaire.

Les expériences sur les animaux ont été approuvées par le comité institutionnel de protection et d'utilisation des animaux de SRI International (Animal Welfare Assurance Number A3025-01, protocole 14008). Des cellules H2009 (106) ou des cellules H1299 (106) ont été implantées par voie sous-cutanée sur le flanc de souris femelles Nu/Nu (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME). Lorsque les tumeurs ont atteint 100 mm3, des expériences in vivo ont été lancées. Pour l'imagerie, les peptides indiqués ont été conjugués directement au colorant proche infrarouge Alexa Fluor 750 (Fig. 1 supplémentaire). Quatre animaux par groupe ont été utilisés. Les peptides ont été injectés dans la veine latérale de la queue pour une dose totale de 15 µg/souris délivrée dans 100 µL. A des périodes de temps déterminées, les animaux ont été anesthésiés et imagés sur un IVIS® (Perkin Elmer). Des régions d'intérêt ont été tracées autour de la tumeur et l'efficacité radiante totale a été mesurée. Pour les expériences thérapeutiques, nous avons choisi d'utiliser le modèle de tumeur H2009 car il a un taux de prise de tumeur plus élevé et un taux de croissance plus constant que le modèle H1299. MGS4_V8 biotinylé (N = 9) ou MGS4_V6 (N = 8) ont été conjugués à de la streptavidine-saporine et administrés par injection dans la veine caudale (7,5 µg/100 µl) 2x/semaine pendant 2,5 semaines pour un total de 5 traitements. Les animaux non traités (N = 8) ont servi de contrôle. La taille de la tumeur a été mesurée avec des compas tous les deux jours et le volume a été calculé comme (π/6)(l*w)3/2. L'analyse statistique a été réalisée sur GraphPad Prism®.

Pour toutes les déterminations EC50, chaque variant peptidique a été testé sur la lignée cellulaire indiquée avec un minimum de 3 réplicats biologiques et analysé individuellement par cytométrie en flux. La mesure de l'erreur standard pour chaque concentration est indiquée par des barres d'erreur dans les figures. Pour les expériences dans lesquelles le nombre absolu de molécules internalisées a été mesuré à différentes concentrations, l'EC50 a été déterminée par GraphPad Prism® en utilisant un ajustement de courbe de régression non linéaire pour log(agoniste) en fonction de la réponse - pente variable (quatre paramètres). Pour les expériences de troncature, les CE50 ont été déterminées en utilisant une liaison spécifique à un site. De même, les IC50 ont été calculées à l'aide de GraphPad Prism® en utilisant log(agoniste) vs réponse – pente variable (quatre paramètres). Un minimum de quatre répétitions biologiques ont été réalisées pour chaque variant et lignée cellulaire. Les données des expériences individuelles sont incluses dans des fichiers supplémentaires. Les paramètres et l'analyse statistique sont fournis dans les tableaux supplémentaires 2 à 7.

Pour les expériences thérapeutiques in vivo, des tailles de groupe d'animaux de N = 9 pour MGS4_V8, N = 8 pour MGS4_V6 et N = 8 pour non traité ont été utilisées. Les tumeurs ont été mesurées par un chercheur indépendant sans aucune connaissance des groupes de traitement. Les SEM sont représentés sous forme de barres d'erreur sur les figures. Pour l'imagerie tumorale, 4 animaux ont été utilisés par groupe, et les barres d'erreur représentent les mesures d'erreur standard. Pour toutes les expériences in vivo, les données pour les souris individuelles sont incluses dans le tableau supplémentaire 9. La signification statistique a été déterminée par ANOVA à deux voies à l'aide du test de comparaison multiple de Tukey. Les valeurs P < 0,05 sont considérées comme significatives et sont représentées sur les figures par : *valeur p < 0,05, **valeur p < 0,01, ***valeur p < 0,001, ****valeur p < 0,0001.

De plus amples informations sur la conception de la recherche sont disponibles dans le résumé des rapports sur le portefeuille Nature lié à cet article.

Société américaine du cancer : faits et chiffres sur le cancer 2022, https://www.cancer.org/research/cancer-facts-statistics/all-cancer-facts-figures/cancer-facts-figures-2022.html.

König, D., Savic Prince, S. & Rothschild, SI Thérapie ciblée dans le cancer du poumon non à petites cellules avancé et métastatique. une mise à jour sur le traitement des altérations les plus importantes des facteurs oncogènes actionnables. Cancers 13, 804–841 (2021).

Article Google Scholar

Verma, S. et al. Trastuzumab emtansine pour le cancer du sein avancé HER2-positif. N. Engl. J. Med. 367, 1783–1791 (2012).

Article CAS Google Scholar

Younes, A. et al. Résultats d'une étude pivot de phase II sur le brentuximab vedotin chez des patients atteints d'un lymphome de Hodgkin en rechute ou réfractaire. J.Clin. Oncol. 30, 2183-2189 (2012).

Article CAS Google Scholar

Pro, B. et al. Brentuximab Vedotin (SGN-35) chez les patients atteints de lymphome anaplasique systémique à grandes cellules en rechute ou réfractaire : résultats d'une étude de phase II. J.Clin. Oncol. 30, 2190-2196 (2012).

Article CAS Google Scholar

Theocharopoulos, C., Lialios, PP, Gogas, H. & Ziogas, DC Un aperçu des conjugués anticorps-médicament dans la pratique oncologique. Là. Adv. Méd. Oncol. 12, 1–20 (2020).

Article Google Scholar

Joubert, N., Beck, A., Dumontet, C. & Denevault-Sabourin, C. Conjugués anticorps-médicament : La dernière décennie. Produits pharmaceutiques 13, 245–276 (2020).

Article CAS Google Scholar

Dean, AQ, Luo, S., Twomey, JD & Zhang, B. Cibler le cancer avec des conjugués anticorps-médicament : promesses et défis. AcM 13, 1951427 (2021).

Marks, S. & Naidoo, J. Antibody Drug Conjugues in Non-Small Cell Lung Cancer: An Emerging Therapeutic Approach. Cancer du poumon 163, 59–68 (2022).

Article CAS Google Scholar

Gray, BP & Brown, KC Bibliothèques de peptides combinatoires : Extraction de peptides de liaison cellulaire. Chim. Rév. 114, 1020-1081 (2014).

Article CAS Google Scholar

McGuire, MJ et al. Identification et caractérisation d'une suite de peptides ciblant les tumeurs pour le cancer du poumon non à petites cellules. Sci. Rep. 4, 4480 (2014).

Article Google Scholar

Synthèse de peptides en phase solide Fmoc : une approche pratique. 346 (Oxford University Press, 2000).

Muttenthaler, M., King, GF, Adams, DJ & Alewood, PF Tendances dans la découverte de médicaments peptidiques. Nat. Rev. Drug Discov. 20, 309–325 (2021).

Article CAS Google Scholar

Rudnick, SI & Adams, GP Affinité et avidité dans le ciblage des tumeurs basé sur les anticorps. Cancer Biother Radiopharm. 24, 155-161 (2009).

CAS Google Scholar

Wittrup, KD, Thurber, GM, Schmidt, MM & Rhoden, JJ Conseils théoriques pratiques pour la conception d'agents ciblant les tumeurs. Méthodes Enzymol. 503, 255-268 (2012).

Article CAS Google Scholar

Polito, L., Bortolotti, M., Mercatelli, D., Battelli, MG et Bolognesi, A. Saporin-S6 : un outil utile dans le traitement du cancer. Toxines 5, 1698–1722 (2013).

Article Google Scholar

Polito, L., Bortolotti, M., Pedrazzi, M. & Bolognesi, A. Immunotoxines et autres conjugués contenant de la saporine-S6 pour le traitement du cancer. Toxines 3, 697–720 (2011).

Article CAS Google Scholar

Bolognesi, A., Bortolotti, M., Maiello, S., Battelli, M. & Polito, L. Protéines inactivant les ribosomes des plantes : un aperçu historique. Molécules 21, 1627 (2016).

Article Google Scholar

Le Joncour, V. & Laakkonen, P. Seek & Destroy, Utilisation de peptides de ciblage pour la détection du cancer et l'administration de médicaments. Biorg. Méd. Chim. 26, 2797–2806 (2018).

Article Google Scholar

Gilad, Y., Firer, M. & Gellerman, G. Innovations récentes dans l'administration ciblée de médicaments à base de peptides aux cellules cancéreuses. Biomédecines 4, 20011 (2016).

Hélas, M., Saghaeidehkordi, A. & Kaur, K. Conjugués peptide-médicament avec différents lieurs pour le traitement du cancer. J. Med. Chim. 64, 216-232 (2021).

Article CAS Google Scholar

Mousavizadeh, A., Jabbari, A., Akrami, M. & Bardania, H. Cell Targeting Peptides as Smart Ligands for Targeting of Therapeutic or Diagnostic Agents: A Systematic Review. Colloïdes Surf. B. Biointerfaces 158, 507–517 (2017).

Article CAS Google Scholar

Strosberg, J. et al. Essai de phase 3 du 177Lu-Dotatate pour les tumeurs neuroendocrines de l'intestin moyen. N. Engl. J. Med. 376, 125-135 (2017).

Article CAS Google Scholar

Kumthekar, P. et al. ANG1005, un conjugué peptide-médicament pénétrant dans le cerveau, montre une activité chez les patientes atteintes d'un cancer du sein avec carcinose leptoméningée et métastases cérébrales récurrentes. Clin. Cancer Rés. 26, 2789–2799 (2020).

Article CAS Google Scholar

Currie, JC et al. Le Conjugué Peptide-Drogue TH1902: Une Nouvelle Thérapeutique Contre Le Cancer Médiée Par Le Récepteur De La Sortiline Contre Les Cancers De L'ovaire Et De L'endomètre. Cancers (Bâle) 14, 81877 (2022).

Okeley, NM et al. Activation intracellulaire de SGN-35, un puissant conjugué anticorps-médicament anti-CD30. Clin. Cancer Rés. 16, 888–897 (2010).

Article CAS Google Scholar

Maass, KF, Kulkarni, C., Betts, AM & Wittrup, KD La détermination des taux de traitement cellulaire pour un conjugué anticorps-médicament trastuzumab-maytansinoïde (ADC) met en évidence les paramètres clés de la conception ADC. AAPS J. 18, 635–646 (2016).

Article CAS Google Scholar

Moran, U., Phillips, R. & Milo, R. SnapShot : chiffres clés en biologie. Cellule 141, 1262-1263 (2010).

Article Google Scholar

Bolognesi, A. et al. Endocytose et localisation intracellulaire de la protéine Saporin-S6 inactivant les ribosomes de type 1. J. Biol. Régul. Homeost. Agents 26, 97-109 (2010).

Google Scholar

Polito, L. et al. La saporine induit plusieurs voies de mort dans les cellules de lymphome avec une intensité et un moment différents par rapport à la ricine. Int J. Biochem Cell Biol. 41, 1055-1061 (2009).

Article CAS Google Scholar

Sikriwal, D., Ghosh, P. & Batra, JK Ribosome Inactivating Protein Saporin Induce Apoptosis Through Mitochondrial Cascade, Independent of Translation Inhibition. Int. J. Biochem. Cell Biol. 40, 2880–2888 (2008).

Article CAS Google Scholar

Polito, L. et al. Immunotoxine ATG-Saporin-S6 : un nouveau médicament puissant et sélectif pour éliminer les lymphocytes activés et les cellules de lymphome. Br. J. Haematol. 147, 710–718 (2009).

Article CAS Google Scholar

Bagga, S., Seth, D. & Batra, JK L'activité cytotoxique de la protéine Saporin-6 inactivant les ribosomes est attribuée à ses activités d'ARNr N-glycosidase et de fragmentation de l'ADN internucléosomal. J. Biol. Chim. 278, 4813–4820 (2003).

Article CAS Google Scholar

Bostad, M. et al. Échappement endosomal contrôlé par la lumière de la nouvelle immunotoxine ciblant le CD133 AC133-saporine par internalisation photochimique - une stratégie de ciblage des cellules souches cancéreuses minimalement invasive. J. Contrôle. Version 206, 37–48 (2015).

Article CAS Google Scholar

Geden, SE et al. Le traitement à la lipopolyamine augmente l'efficacité de l'intoxication avec la saporine et un conjugué anticancéreux à la saporine. FEBS J. 274, 4825–4836 (2007).

Article CAS Google Scholar

Stratford, EW et al. L'internalisation photochimique des immunotoxines ciblant le CD133 épuise efficacement les cellules de sarcome avec des propriétés de type tige et réduit la tumorigénicité. Biochim. Biophys. Acta 1830, 4235–4243 (2013).

Article CAS Google Scholar

Gilabert-Oriol, R. et al. Immunotoxines construites avec des protéines inactivant les ribosomes et leurs activateurs : un cocktail mortel avec une efficacité spécifique aux tumeurs. Courant. Pharm. Dés. 20, 6584–6643 (2014).

Article CAS Google Scholar

Falini, B. et al. Réponse de la maladie de Hodgkin réfractaire à l'immunotoxine monoclonale anti-CD30. Lancette 339, 1195-1196 (1992).

Article CAS Google Scholar

French, RR, Tutt, AL, Glennie, MJ, Hamblin, TJ & Bell, AJ Traitement des lymphomes à cellules B avec combinaison d'anticorps bispécifiques et de saporine. Lancet 346, 223–224 (1995).

Article CAS Google Scholar

Brown, DC & Agnello, K. Substance intrathécale P-saporine chez le chien : efficacité dans la douleur liée au cancer des os. Anesthésiologie 119, 1178-1185 (2013).

Article CAS Google Scholar

Bortolotti, M., Bolognesi, A., Battelli, MG & Polito, L. Haute efficacité anti-tumorale in vitro de l'immunotoxine dimère Rituximab/Saporin-S6. Toxines 8, 192 (2016).

Article Google Scholar

Polito, L. et al. Deux Immunotoxines Contenant De La Saporine Spécifiques Pour CD20 Et CD22 Montrent Un Comportement Différent Pour Tuer Les Cellules De Lymphome. Toxines 9, 182 (2017).

Article Google Scholar

Oh, S. et al. Une nouvelle toxine ciblée bispécifique à immunogénicité réduite reconnaissant simultanément le facteur de croissance épidermique humain et les récepteurs de l'interleukine-4 dans un modèle murin de cancer du sein métastatique. Clin. Cancer Rés. 15, 6137–6147 (2009).

Article CAS Google Scholar

Ehrlich, D., Wang, B., Lu, W., Dowling, P. & Yuan, R. Thérapie intratumorale par immunotoxine anti-HuD pour le cancer du poumon à petites cellules et le neuroblastome. J. Hématol. Oncol. 7, https://doi.org/10.1186/s13045-014-0091-3 (2014).

Knödler, M. & Buyel, JF Blocs de construction d'immunotoxines fabriquées à partir de plantes : feuille de route pour la production de fusions thérapeutiques anticorps-toxine. Biotechnol. Adv. 47, 107683 (2021).

Fleming, BD & Ho, M. Développement d'immunotoxines ciblant le Glypican-3 pour le traitement du cancer du foie : Une mise à jour. Biomolécules 10, 60934 (2020).

Dhez, A.-C. et coll. Thérapie Ciblée Du Glioblastome Humain Via La Livraison D'une Toxine Par Un Peptide Dirigé à La Surface Cellulaire Nucleolin. J.Cell. Physiol. 233, 4091–4105 (2018).

Article CAS Google Scholar

Schmohl, J., Todhunter, D., Taras, E., Bachanova, V. & Vallera, D. Développement d'une immunotoxine bispécifique désimmunisée DT2219 contre les tumeurs malignes des cellules B. Toxines 10, 32 (2018).

Article Google Scholar

Giansanti, F., Flavell, D., Angelucci, F., Fabbrini, M. & Ippoliti, R. Stratégies pour améliorer l'utilité clinique des toxines ciblées à base de saporine. Toxines 10, 82 (2018).

Article Google Scholar

Onda, M. et al. Une immunotoxine avec une immunogénicité considérablement réduite par identification et élimination des épitopes des cellules B. Proc. Natl. Acad. Sci. États-Unis 105, 11311–11316 (2008).

Article CAS Google Scholar

Mazor, R., King, EM & Pastan, I. Stratégies pour réduire l'immunogénicité des immunotoxines recombinantes. Suis. J. Pathol. 188, 1736-1743 (2018).

Article CAS Google Scholar

Rust, A., Partridge, LJ, Davletov, B. & Hautbergue, GM L'utilisation de protéines inactivatrices de ribosomes d'origine végétale dans le développement d'immunotoxines : générations passées, présentes et futures. Toxines 9, 110344 (2017).

Borthakur, G. et al. Étude de phase 1 d'une immunotoxine anti-CD33, l'anticorps monoclonal humanisé M195 conjugué à la gélonine recombinante (HUM-195/rGEL), chez des patients atteints de tumeurs malignes myéloïdes avancées. Haematologica 98, 217–221 (2013).

Article CAS Google Scholar

Kreitman, RJ et al. Essai de phase II de l'immunotoxine recombinante RFB4(dsFv)-PE38 (BL22) chez des patients atteints de leucémie à tricholeucocytes. J.Clin. Oncol. 27, 2983-2990 (2009).

Article CAS Google Scholar

Allahyari, H., Heidari, S., Ghamgosha, M., Saffarian, P. & Amani, J. Immunotoxine : un nouvel outil pour le traitement du cancer. Tumeur Biol. 39, 1010428317692226 (2017).

Article Google Scholar

Shafiee, F., Aucoin, MG et Jahanian-Najafabadi, A. Thérapie ciblée à base de toxine diphtérique : un article de synthèse. Devant. Microbiol. 10, 2340 (2019).

Article Google Scholar

Kim, JS, Jun, SY & Kim, YS Questions critiques dans le développement d'immunotoxines pour la thérapie anticancéreuse. J.Pharm. Sci. 109, 104-115 (2020).

Article CAS Google Scholar

Jen, EY et al. Résumé de l'approbation de la FDA : Tagraxofusp-erzs pour le traitement du néoplasme des cellules dendritiques plasmacytoïdes blastiques. Clin. Cancer Rés. 26, 532–536 (2020).

Article CAS Google Scholar

Lin, AY & Dinner, SN Moxetumomab Pasudotox pour la leucémie à tricholeucocytes : développement préclinique jusqu'à l'approbation de la FDA. Sang Adv. 3, 2905-2910 (2019).

Article CAS Google Scholar

Li, S. et al. Synthèse et caractérisation d'un ligand spécifique de αvβ6 à haute affinité pour des applications in vitro et in vivo. Mol. Cancer Ther. 8, 1239-1249 (2009).

Article CAS Google Scholar

Télécharger les références

Nous remercions Emily Miller pour son assistance technique. Ce travail a été soutenu par les National Institutes of Health [IRO1CA164447-01] et des fonds internes de recherche et développement de SRI International.

SRI International, Division des biosciences, 140 Research Drive, Harrisonburg, VA, 22802, États-Unis

Curtis A. Allred, Claire Gormley, Indu Venugopal, Shunzi Li, Michael J. McGuire et Kathlynn C. Brown

Vous pouvez également rechercher cet auteur dans PubMed Google Scholar

Vous pouvez également rechercher cet auteur dans PubMed Google Scholar

Vous pouvez également rechercher cet auteur dans PubMed Google Scholar

Vous pouvez également rechercher cet auteur dans PubMed Google Scholar

Vous pouvez également rechercher cet auteur dans PubMed Google Scholar

Vous pouvez également rechercher cet auteur dans PubMed Google Scholar

Le concept et la conception de l'étude ont été réalisés par CAAMJM et KCB L'acquisition des données a été réalisée par CAA, CG et IV La synthèse et la caractérisation des peptides ont été réalisées par SL L'analyse et l'interprétation des données ont été réalisées par CAA, CG, IV, MJM et KCB Rédaction de la manuscrition a été réalisée par CAA et KCB Le financement a été obtenu par KCB

Correspondance à Kathlynn C. Brown.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Communications Biology remercie Manish Charan, Andrea Bolognesi et les autres examinateurs anonymes pour leur contribution à l'examen par les pairs de ce travail. Rédacteurs en chef de la manipulation principale : Marina Holz et Karli Montague-Cardoso.

Note de l'éditeur Springer Nature reste neutre en ce qui concerne les revendications juridictionnelles dans les cartes publiées et les affiliations institutionnelles.

Libre accès Cet article est sous licence Creative Commons Attribution 4.0 International License, qui permet l'utilisation, le partage, l'adaptation, la distribution et la reproduction sur n'importe quel support ou format, tant que vous donnez le crédit approprié à l'auteur ou aux auteurs originaux et à la source, fournissez un lien vers la licence Creative Commons et indiquez si des modifications ont été apportées. Les images ou tout autre matériel tiers dans cet article sont inclus dans la licence Creative Commons de l'article, sauf indication contraire dans une ligne de crédit au matériel. Si le matériel n'est pas inclus dans la licence Creative Commons de l'article et que votre utilisation prévue n'est pas autorisée par la réglementation légale ou dépasse l'utilisation autorisée, vous devrez obtenir l'autorisation directement du détenteur des droits d'auteur. Pour voir une copie de cette licence, visitez http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Réimpressions et autorisations

Allred, CA, Gormley, C., Venugopal, I. et al. Livraison intracellulaire spécifique à la tumeur : transport guidé par un peptide d'une toxine catalytique. Commun Biol 6, 60 (2023). https://doi.org/10.1038/s42003-022-04385-7

Télécharger la citation

Reçu : 01 juin 2021

Accepté : 20 décembre 2022

Publié: 17 janvier 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s42003-022-04385-7

Toute personne avec qui vous partagez le lien suivant pourra lire ce contenu :

Désolé, aucun lien partageable n'est actuellement disponible pour cet article.

Fourni par l'initiative de partage de contenu Springer Nature SharedIt

En soumettant un commentaire, vous acceptez de respecter nos conditions d'utilisation et nos directives communautaires. Si vous trouvez quelque chose d'abusif ou qui ne respecte pas nos conditions ou directives, veuillez le signaler comme inapproprié.