Développement d'une cyclodextrine ternaire - Coastwise Ventures Group Co., Ltd.

Communications Biology volume 5, Article number: 1234 (2022) Citer cet article

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La conception de fonctionnalités utiles dans des antibiotiques anciens validés cliniquement promet de fournir la solution la plus économique au manque mondial d'antibiotiques efficaces, qui constitue sans aucun doute une grave menace pour la santé. Ici, nous montrons que l'utilisation de la chimie de surface du cycle de la cyclodextrine (βCD) et de l'arginine (arg) comme lieur, fournit un complexe antibiotique ternaire plus stable (βCD-arg-cpx). Contrairement aux complexes d'inclusion moins stables classiques, qui ne modifient que la solubilité des antibiotiques, le complexe ternaire présenté ici est plus stable et contrôle la libération du médicament. Les composants du complexe intensifient les interactions avec les membranes bactériennes et augmentent la disponibilité du médicament à l'intérieur des cellules bactériennes, améliorant ainsi son efficacité antimicrobienne et son profil d'innocuité. Les antibiotiques multifonctionnels, formulés comme des systèmes d'administration de médicaments en soi, qui amènent le médicament sur le site d'action, maximisent son efficacité et offrent une détectabilité optique sont envisagés comme l'avenir dans la lutte contre les infections. Leur rôle en tant qu'outil contre les souches multirésistantes reste un défi intéressant ouvert à de nouvelles recherches.

La diminution des antimicrobiens efficaces constitue une menace très sérieuse pour la santé mondiale dans le monde moderne, comme l'a récemment souligné l'Organisation mondiale de la santé1. Seuls quelques nouveaux antibiotiques ont atteint le marché au cours des dernières décennies, et aucune nouvelle classe d'antibiotiques n'a été découverte depuis 19802. Avec des coûts énormes et des avantages imprévisibles et à court terme, la découverte de nouveaux antibiotiques n'est pas une priorité majeure pour l'industrie pharmaceutique2,3. La réaffectation, le reprofilage ou la réutilisation de médicaments approuvés cliniquement présentent des avantages importants en termes de temps et de coût par rapport à la découverte de nouveaux candidats-médicaments, en particulier dans les situations émergentes telles que les pandémies4,5. Les principaux avantages sont un profil de sécurité prévisible, des connaissances antérieures sur les procédures de fabrication, des protocoles de test établis, des exigences réglementaires plus simples et des périodes de mise sur le marché plus courtes, entre autres6,7. Par conséquent, il n'est pas surprenant qu'environ un tiers de tous les médicaments approuvés au cours de la dernière décennie aient été d'anciens médicaments réutilisés, qui représentent 25 % des revenus de l'industrie pharmaceutique7,8. Une grande partie des efforts dans le pipeline actuel d'antibiotiques précliniques se concentre sur la modification d'anciens antibiotiques pour augmenter leur efficacité, en particulier en synergie avec d'autres médicaments ou composants auxiliaires non médicamenteux9,10. Les principaux défis scientifiques pour y parvenir sont la pénétration, l'efflux et la toxicité limités associés au traitement à haute dose9,10.

Une approche simple et très efficace pour reconcevoir d'anciens antibiotiques comprend la formation de complexes instables qui modifient des propriétés telles que la solubilité, la stabilité, la biodisponibilité et la perméabilité, influençant ainsi directement leur résultat thérapeutique. Dans ce contexte, les cyclodextrines (CD) sont particulièrement applicables11,12. Avec une structure de cône tronqué, ils ont une coquille hydrophile (avec 7 groupes primaires orientés vers le bord étroit et 14 groupes hydroxyle de sucre secondaires orientés vers le bord le plus large du cône, dans le cas de la β-CD) et un noyau hydrophobe (avec un squelette carboné de 7 unités glucopyranose qui composent la structure de la β-CD) disponible pour les interactions avec les molécules médicamenteuses11,13,14. Le plus souvent, les antibiotiques sont formulés sous forme de complexes d'inclusion lorsque la partie hydrophobe du médicament interagit avec la zone centrale hydrophobe de la CD, ce qui augmente par conséquent sa solubilité de plusieurs fois11. Cette approche a été appliquée à divers antibiotiques (β-lactamines, microlides, fluoroquinolones, sulfamides, tétracyclines et aminoglycosides), et leurs concentrations minimales inhibitrices (CMI) ont été réduites par des facteurs allant de 2 à plus de 10011. C'est une méthode enthalpique processus, et le complexe hôte-invité CD-médicament est en équilibre avec le médicament libre sans liaison chimique12. Cette approche devient encore plus efficace si l'excipient CD est combiné avec des composants auxiliaires spécialement sélectionnés (tels que des polymères hydrophiles, des acides aminés ou des acides hydroxylés) pour former des complexes ternaires15,16,17,18. La partie hydrophobe du médicament forme un complexe d'inclusion CD-médicament, tandis que la partie hydrophile subit simultanément une réaction acide-base avec le composant auxiliaire pour former un sel.

Un bon exemple est l'arginine, un acide aminé basique, qui forme des sels avec des médicaments acides (par exemple, le naproxène, le zoloprofène, l'oxaprozine) complexés avec CD16,17,18. Il en résulte une augmentation importante de la constante de stabilité et de l'efficacité de complexation. Par conséquent, on s'attend à ce que la combinaison d'un antibiotique avec la CD et l'arginine dans un complexe ternaire puisse fortement influencer son activité antimicrobienne. Cependant, seules quelques recherches sur de tels complexes ont été menées jusqu'à présent, parmi lesquelles une étude sur le céfuroxime a montré une solubilité considérablement accrue après la formation de complexes ternaires avec CD et arginine19.

Au lieu des complexes d'inclusion moins stables habituellement formés pour augmenter la solubilité du médicament, nous avons conçu un complexe antibiotique ternaire β-cyclodextrine-arginine-ciprofloxacine (βCD-arg-cpx), dans lequel la ciprofloxacine (cpx) est attachée à la surface hydrophile de βCD via un lieur arginine (arg). Avec cette approche, notre objectif n'était pas simplement d'augmenter la solubilité du médicament comme d'habitude. Ici, notre système complexe synthétisé est surtout plus stable pour contrôler la libération d'antibiotiques, permettre des interactions améliorées avec la paroi cellulaire et les membranes bactériennes, et fournir une perméabilité et une disponibilité plus élevées à l'intérieur des bactéries, améliorant ainsi l'efficacité du traitement antibactérien. Parallèlement à l'amélioration de l'efficacité antimicrobienne, une amélioration considérable du profil d'innocuité a été démontrée.

Le complexe βCD-arg-cpx s'assemble en structures 3D bien organisées (Fig. 1a) sous forme de bâtonnets de quelques micromètres de long (Fig. 1b) avec des structures radiales très ordonnées composées de plaques connectées latéralement de quelques dizaines de nanomètres d'épaisseur (Fig. 1c). Un examen plus approfondi des plaques individuelles et du diagramme de diffraction électronique associé (Fig. 1d) révèle leur nature monocristalline. Morphologiquement, ces assemblages diffèrent de βCD-cpx et les complexes βCD-arg ont été détectés sous forme de particules non assemblées de forme irrégulière (Fig. 1e – g).

Illustration de la structure avec un cœur cristallin arg-cpx et βCD en surface (a). Morphologie SEM montrant de longues structures alignées en forme de bâtonnets du complexe βCD-arg-cpx (b) avec des bords nets et nanoépais (c). Image TEM à plus fort grossissement des bâtonnets βCD-arg-cpx (d) et motif EDS montrant leur nature cristalline (insérer dans (d)). Structures TEM révélant des différences entre βCD-arg-cpx (e), βCD-cpx (f) et βCD-arg (g).

La cartographie élémentaire dans un complexe βCD-arg-cpx à une seule tige (Fig. 2a1) a détecté des éléments C (Fig. 2a2), F (Fig. 2a3), N (Fig. 2a4) et O (Fig. 2a5) répartis de manière homogène le long de la grande surface d'un cristal. Une analyse XPS supplémentaire de la composition de surface a été effectuée sur la référence de médicament cpx ainsi que sur le complexe βCD-arg-cpx avant et après gravure douce avec Arions. Étant donné que N est présent à la fois dans l'antibiotique et l'arginine (pas dans CD), alors que F n'est présent que dans cpx, un rapport N / F plus élevé dans un complexe par rapport à cpx était dû à la liaison à l'arginine. D'autre part, la diminution des rapports C/F et O/F de la surface à la masse du complexe βCD-arg-cpx a confirmé la présence de βCD à la surface. Comme le côté F de cpx n'est pas inclus dans la complexation, le maximum à 687,5 eV dans le spectre F1s (correspondant aux liaisons CF) 20 reste inchangé pour les trois systèmes étudiés (Fig. 2b2). D'autre part, N1s (avec deux maxima à 401,1 eV et 399,7 eV, correspondant aux liaisons CNC et C-NH20, Fig. 2b4) révèle une fraction accrue d'amines principalement dans le complexe puis dans le médicament libre cpx qui est due à la liaison de l'arginine partie. Leur augmentation est observée dans la zone en vrac du complexe. Le spectre C1s (avec des maxima à 287 eV, 285,8 eV et 284,8 eV correspondant respectivement à C=O, CN et CC)20 et O1s (avec des maxima à 533,1 eV et 531,5 eV, correspondant à CO et (C=O)- OH, respectivement)20) montrent une diminution des intensités des maxima appartenant aux groupes CO et CN dans un complexe par rapport à la référence cpx libre qui est due à leur implication dans la complexation.

Image STEM (a1) avec analyse de cartographie élémentaire correspondant au carbone (C) (a2), à l'oxygène (O) (a3), à l'azote (N) (a4) et au fluor (F) (a5) ; Analyse XPS de la surface et de la masse (obtenue après gravure douce) du complexe βCD-arg-cpx par rapport à la référence cpx vierge - C1s (b1), F1s (b2), O1s (b3) et N1s (b4) spectres haute résolution .

Les assemblages complexes βCD-arg-cpx à rapport d'aspect élevé sont hautement cristallins, comme l'indiquent leurs maxima de diffraction polycristallin nets (Fig. 1a supplémentaire). La structure cristalline détectée est similaire à celle du cpx déprotoné de base (comme observé dans la réf. 21), avec des maxima de diffraction décalés et l'apparition de nouveaux pics. Elle diffère également légèrement de la structure détectée pour le complexe βCD-NaOH-cpx (une référence précipitée en remplaçant arg par NaOH) et correspond exactement à la structure de arg-cpx (une référence correspondant au sel de ciprofloxacine-arginine) (Fig. 1a), qui résulte de la réaction acido-basique entre cpx et arg, formation du sel et sa cristallisation. En revanche, la cristallisation des composants cpx et arg séparés dans les agrégats complexes βCD-cpx et βCD-arg est faible, ce qui donne une faible intensité et de larges maxima de diffraction (Fig. 1a supplémentaire). Du fait de l'absence de l'assemblage, l'ordre cristallin dans ces structures est notablement diminué. Par conséquent, la partie cristalline de βCD-arg-cpx était constituée de sel d'arg-cpx avec un composant βCD amorphe associé à la surface du cristal.

De grandes différences structurelles entre les différents types de complexes étaient observables, en particulier dans leurs spectres FTIR (Fig. 1b supplémentaire). Le spectre FTIR du complexe d'inclusion βCD-arg (Fig. 1b supplémentaire) a montré des bandes βCD typiques avec un large étirement OH à 3300 cm-1 et une flexion OH à 1640 cm-1, et un étirement CH à 2925 cm-1 et une vibration annulaire bandes sous forme d'étirement asymétrique COC et CC à 1152 cm-1, 1026 cm-1 et 932 cm-1 17,22,23 et modes d'étirement guanidine CN à partir de l'arginine à 1554 cm-1 (plus de détails dans la Fig. 2 supplémentaire) 24. L'intensité des modes d'étirement et de flexion OH de βCD a été modifiée dans le spectre βCD-arg, mais aucune bande supplémentaire n'a été observée (Fig. 2 supplémentaire). Dans le complexe βCD-cpx, de légers décalages de position ont été observés pour les bandes correspondant aux vibrations du cycle aromatique de cpx et βCD obtenues en raison de l'incorporation de la molécule à l'intérieur du cône βCD, ce qui est typique des complexes d'inclusion (Fig. 3 supplémentaire)25 ,26. De plus, la bande vibrationnelle carboxyle C=O de cpx à 1708 cm−1 indiquait une forme moléculaire neutre25,26. Le complexe βCD-cpx n'a montré aucune bande supplémentaire (Fig. 3 supplémentaire).

Une situation complètement différente a été observée pour le complexe βCD-arg-cpx (Fig. 1b supplémentaire). Le mode de vibration d'étirement carbonyle C=O, détecté à 1708 cm−1 dans βCD-cpx et également dans un mélange physique de composants βCD, arg et cpx, est absent des spectres des deux complexes, βCD-arg-cpx et βCD-NaOH- cpx, tandis que la vibration carboxylate asymétrique des complexes (qui manquait en cas de mélange physique et βCD-cpx) apparaît à 1578 cm-1, indiquant toutes deux des formes de zwitterion cpx dans les βCD-arg-cpx et βCD-NaOH-cpx (Figs. 3 et S4). Contrairement au spectre du complexe d'inclusion βCD-cpx et au spectre d'un mélange physique de composants du complexe, dans βCD-arg-cpx, la vibration d'étirement cpx OH à 3526 cm−1 manquait, une autre indication de sa déprotonation. forme au sein du complexe. De plus, des bandes vibrationnelles typiques observées dans les complexes précédents sont apparues dans le spectre de βCD-arg-cpx avec une intensité plus élevée, des rapports d'intensité modifiés et une résolution plus élevée, indiquant une augmentation de l'ordre structurel et de la cristallinité (comme observé pour les vibrations du groupe carbonyle dans les formulations contenant cpx semi-cristallin)26. De nouvelles bandes vibrationnelles ont été détectées, en particulier dans la zone des empreintes digitales (Fig. 4 supplémentaire), qui n'appartenaient à aucun des composants séparés du complexe (séparément et dans leur mélange physique) mais étaient une conséquence de la nouvelle structure complexe. Il était intéressant d'observer que la plupart des nouvelles bandes obtenues pour βCD-arg-cpx ont également été détectées dans arg-cpx et βCD-NaOH-cpx, ajustées au même pH en utilisant de l'arginine ou du NaOH, ce qui a en outre confirmé la structure similaire de complexes formés à l'aide de ces deux modulateurs d'acidité. Cependant, la présence d'arginine dans βCD-arg-cpx a affecté les vibrations de l'anneau de cycle βCD, observées comme l'absence des vibrations typiques de βCD à 1079 et 996 cm−1 et une liberté de vibration supplémentaire détectée à travers la nouvelle bande à 1178 cm−1 , qui n'a pas été détecté dans βCD-NaOH-cpx. Ces nouvelles interactions au sein de βCD-arg-cpx pourraient être source d'une meilleure stabilité du complexe, ce qui sera montré plus loin. Les recherches sur les propriétés optiques des complexes βCD- ont permis de mieux comprendre leurs caractéristiques structurelles. Les spectres d'émission de fluorescence des complexes βCD-arg-cpx et arg-cpx (Fig. 1c supplémentaire) ont montré un décalage bathochromique lorsque le composant βCD était lié au sel arg-cpx. Un décalage a été observé dans les deux cas lorsque la βCD était liée au complexe βCD-arg-cpx ou βCD-NaOH-cpx (Fig. 1c supplémentaire). Indirectement, cette observation a confirmé la présence de ce composant amorphe au-dessus des cristaux de cpx déprotonés (détectés en XRD et révélés en outre en FTIR) et a fourni la preuve de la position de liaison. La fluorescence observée a été attribuée à la molécule antibiotique, avec les groupes donneur d'électrons pipérazinyle et accepteur d'électrons acide 4-oxoquinoléine-3-carboxylique27. De même, dans le cas présent, cpx est lié via arg à βCD via un groupe pipérazinyle à caractère donneur d'électrons. La liaison de la molécule cpx sur le lieur arginine au βCD (ou directement à la molécule βCD) limite ses mouvements intramoléculaires et élimine les relaxations non rayonnantes, permettant la fluorescence au λmax décalé par rapport à la forme de médicament libre.

La surveillance du pH et du potentiel zêta et le remplacement de l'arg par du NaOH en tant que modificateur de pH ont révélé des étapes critiques vers la formation de complexes (Fig. 3). Initialement, le mélange réactionnel était à pH 7,5, auquel βCD a des groupes OH disponibles, arg est sous forme de zwitterion avec une charge cationique au niveau de la guanidine et des groupes carboxyle déprotonés, et cpx a une amine cationique sur les groupes pipérazinyle et carboxyle déprotonés (comme illustré à la Fig. .3a). La formation du complexe βCD-arg-Cpx commence par une réaction à base d'acide dans laquelle les groupes carboxyle dans arg interagissent avec l'amine cationique du côté pipérazinyl cpx, formant un sel arg-cpx (Fig. 3b). L'étape de cristallisation par précipitation permet la formation de structures en longs bâtonnets. La surface des cristaux formés contient des groupes guanidine libres disponibles pour lier les composants βCD amorphes et assembler le complexe CD-arg-Cpx final (Fig. 3b). Les amines du groupe fonctionnel guanidine dans l'arginine ont une très grande affinité pour les liaisons hydrogène, avec la possibilité de former jusqu'à cinq liaisons impliquant à la fois des amines protonées et non protonées28. Par conséquent, dans le complexe formé, l'arginine a le rôle d'un lieur, qui utilise des groupes guanidine cationiques pour lier βCD à la surface et des groupes carboxyle ioniques pour lier cpx. Le potentiel zêta du βCD (initialement à pH = 6) est modifié après l'ajout d'arginine (tableau de la figure 3), indiquant des interactions entre les groupes cationiques du squelette guanidine et les groupes OH du côté externe hydrophile du βCD.

Structures moléculaires du mélange précurseur avant précipitation (pH 7,5), changement de potentiel zêta pour différents composants complexes et précipitation après 2 h de mélange dans le cas d'un ajustement du pH avec l'arginine (et son retard lorsque arg est remplacé par NaOH (βCD-NaOH- cpx)) (a). Précipitation (pH 6,5) impliquant la formation de sel arg-cpx et la liaison βCD suivie d'une cristallisation et d'un assemblage (b).

La structure complexe CD-arg-cpx formée apparaît sous la forme d'un précipité blanc opale brillant dans les deux heures après le mélange de tous les composants. Lorsque βCD est mélangé directement avec cpx sans ajout d'arginine, la solution reste limpide sans aucune précipitation. La mesure du potentiel zêta de la poudre lyophilisée donne des valeurs neutres correspondant à des agrégats complexes βCD-cpx non stables. Comme observé précédemment, le complexe d'inclusion βCD-cpx se forme en incorporant un fragment acide 4-oxoquinoline-3-carboxylique hydrophobe de la molécule cpx à l'intérieur du cône hydrophobe de βCD29. Lorsque l'acidité du mélange réactionnel initial a été ajustée en utilisant du NaOH (au lieu de l'arginine), la précipitation de βCD-NaOH-cpx sous forme de complexe sans arg a été beaucoup plus lente et n'a pas eu lieu après deux heures de mélange, comme dans le cas de βCD-arg-cpx (illustré sur les photos de la Fig. 3a), mais a été retardé pendant les 24 h suivantes. βCD-NaOH-cpx est un complexe βCD-cpx à pH ajusté et n'a pas la stabilité observée pour βCD-arg-cpx.

Les assemblages βCD-arg-cpx ont émis une lumière fluorescente bleue intense qui est apparue avec leurs structures en forme de tige (Fig. 4a). Une fluorescence similaire a également été observée pour βCD-cpx (suivant la structure de forme irrégulière de l'agrégat complexe) (Fig. 4b) mais pas pour βCD-arg (qui forme également des agrégats irréguliers) (Fig. 4c). Les dérivés de la ciprofloxacine, sous la forme de nanoagrégats sphériques contenant des anneaux perfluoroaryle et phényle liés par des liaisons amidine au groupe pipérazinyle de la ciprofloxacine, ont déjà été observés pour montrer une émission induite par l'agrégation (AIE)27. Cependant, à notre connaissance, l'AIE dans les complexes de ciprofloxacine contenant du βCD n'a pas été détecté auparavant.

Fluorescence bleue des complexes contenant cpx (βCD-arg-cpx et βCD-cpx) (non détectée pour βCD-arg) (a). Spectres de fluorescence de βCD-arg-cpx et cpx libre (et complexe βCD-cpx comparable) avant et après dissolution dans l'eau confirmant différents mécanismes de dissolution (complexe dissous vs médicament libre dissous) (b). Détection de βCD-arg-cpx et de bactéries (100 μg/ml du complexe après 10 min d'exposition à P. aeruginosa PAO1 colorée à l'iodure de propidium (PI, fluorescence rouge, détection des bactéries mortes) (c).

Des différences ont également été observées dans les spectres de fluorescence des complexes βCD-arg-cpx et βCD-cpx, en particulier avant et après dissolution dans l'eau (Fig. 4b). Dans les poudres solides, les spectres de fluorescence du βCD-arg-cpx et du cpx libre n'étaient pas les mêmes, révélant un décalage vers le bleu dans le spectre de la structure complexée à l'arginine. Une fois dissous dans l'eau, le spectre de βCD-arg-cpx est resté le même que celui de la forme complexe solide, tandis que les spectres du médicament libre et du complexe d'inclusion βCD-cpx moins stable étaient décalés vers le rouge avec exactement la même forme de fluorescence maximum. Une analyse plus approfondie des composants dissous dans l'eau a révélé des cpx libres (et ses dimères et trimères identifiés dans les spectres MS, Fig. 5a supplémentaire), tandis que dans le cas du βCD-arg-Cpx, lors du vieillissement en milieu aqueux, le complexe a libéré des cpx libres, cpx-arg, arg et βCD (Fig. 5b supplémentaire).

La fluorescence bleue intensive fournit au βCD-arg-cpx une fonctionnalité de détection supplémentaire. Après exposition au complexe βCD-arg-cpx pendant une courte période, la viabilité des bactéries a été fortement affectée, comme détecté par la fluorescence rouge de l'iodure de propidium dans une fraction élevée de cellules, qui représentent des bactéries mortes. Nous avons également pu détecter la fluorescence bleue des assemblages en forme de bâtonnets βCD-arg-cpx, qui ont libéré le complexe avec une forte activité antimicrobienne (Fig. 4c).

Même dans un contexte quantitatif, βCD-arg-cpx différait du complexe βCD-cpx classique (Fig. 5a). Comme déterminé à partir des spectres UV-vis du cpx restant dans la solution après la formation du complexe, le βCD-arg-cpx contenait trois fois la teneur en cpx du βCD-cpx sans arginine. La présence d'arginine et son rôle dans la formation du complexe ont affecté la teneur en médicament dans le complexe. Une différence de 1,5 fois dans la teneur en cpx pour βCD-cpx et βCD-NaOH-cpx (Fig. 5b) a été observée, montrant qu'une différence de pH affectait la teneur en médicament inclus dans le complexe. Cependant, dans le cas de βCD-arg-cpx, l'effet n'était pas uniquement dû à la contribution du pH lors de la formation du complexe, puisque l'utilisation d'arginine pour modifier le pH au même niveau que pour NaOH dans le complexe βCD-NaOH-cpx a entraîné un contenu cpx deux fois plus élevé dans βCD-arg-cpx.

Cpx dans les surnageants obtenus après synthèse du complexe (et teneurs calculées en cpx dans les complexes βCD) (médicament libéré du complexe CD-arg-Cpx indiqué en bleu, du complexe CD-NaOH-Cpx en orange et du complexe CD-Cpx en noir) (a ) et cinétique comparative de libération de médicament à partir de βCD-cpx (noir), βCD-arg-cpx (gris foncé) et βCD-NaOH-cpx (gris lith) (b); n = 3 ; les barres d'erreur se réfèrent à la SD de la libération du médicament.

En plus de sa contribution à la formation, à l'assemblage et au contenu médicamenteux incorporé, l'arginine a affecté la libération du médicament du complexe. Dans un complexe d'inclusion βCD-cpx classique, un équilibre dynamique moins stable entre le médicament et le cône hydrophobe βCD, la libération de cpx est rapide (Fig. 5b). Après incubation à 37°C dans du tampon PBS, plus de 60% du médicament a été libéré après 10 min d'incubation. La décomposition complète du complexe et la libération de tous les cpx incorporés ont eu lieu dans les premières 24 h. La cinétique de libération était légèrement plus lente dans le cas du βCD-NaOH-cpx (Fig. 5b) : la libération initiale était d'environ 40 %, et au bout de 24 h, le complexe libérait jusqu'à 70 % du médicament incorporé.

Dans les systèmes d'administration de médicaments (comme les sphères polymères encapsulées), la libération de médicaments dépend des propriétés du support de médicament (c. Dans le cas actuel, le médicament, en tant que partie du complexe, fait partie du système d'administration du médicament et sa libération dépend de la stabilité et de la solubilité du complexe. En raison de la différence d'assemblage, le complexe βCD-arg-cpx était plus stable que le complexe d'inclusion de βCD-cpx et le complexe βCD-NaOH-cpx à pH modifié, montrant la libération la plus lente (Fig. 5b). L'auto-assemblage des CD naturels et des complexes médicamenteux est connu pour affecter leur solubilité12. Initialement, ce complexe ne libérait que 20 % du médicament incorporé, et la libération s'est poursuivie lentement, avec jusqu'à 30 % du médicament libéré après 24 h. L'application de βCD en tant qu'excipient ou l'application d'arginine pour créer un sel de médicament dans des complexes βCD-médicament est un moyen pratique d'améliorer la solubilité du médicament. En revanche, le nouveau complexe βCD-arg-cpx se désassemble lentement, diminue la dissolution du médicament et permet de contrôler la libération du médicament. La contribution observée à la solubilité du médicament est une conséquence de la liaison différente du médicament aux deux autres composants (comme illustré sur la figure 3). Au lieu d'incorporer la partie hydrophobe du médicament dans le cône βCD et de lier l'arginine à sa partie hydrophile, qui reste généralement à l'extérieur du cône βCD, le médicament est lié à la surface βCD via un lieur arginine, ce qui rend l'ensemble de la structure plus stable contre dissolution. De plus, les forces qui maintiennent ensemble les longs assemblages en forme de tige de βCD-arg-cpx contribuent également à un démontage plus lent et assurent un contrôle de la libération. Contrairement à toutes les plates-formes associées au CD disponibles utilisées pour modifier les antibiotiques, à notre connaissance, la possibilité d'utiliser l'arginine pour créer un système d'administration de médicaments antibiotiques à libération lente à partir de βCD n'a pas été conférée auparavant.

Après avoir observé la solubilité réduite non conventionnelle et la libération ralentie d'antibiotiques de l'assemblage βCD-arg-cpx, nous avons ensuite étudié l'effet du complexe dans les tests d'efficacité antimicrobienne et de toxicité. Tout d'abord, la sensibilité et les concentrations minimales inhibitrices (CMI) des complexes βCD-arg-cpx et βCD-cpx et de leurs composants précurseurs, βCD, βCD-arg et cpx, ont été étudiées contre plusieurs souches bactériennes, y compris E. coli à Gram négatif MG1655 (ATCC 47076) et P. aeruginosa PAO1 (ATCC 15692) et gram-positif S. aureus Rosenbach (ATCC 12600), comme résumé dans le tableau 1. Aucune des souches bactériennes étudiées n'a montré de sensibilité au βCD ou βCD-arg. Pour βCD-cpx, nous avons trouvé des valeurs de CMI de 0,056 μM pour E. coli et de 0,21 μM pour P. aeruginosa et S. aureus (tableau 1). Si l'on prend en compte la teneur en cpx de 19 % en poids dans le βCD-cpx et jusqu'à 70 % de libération de médicament au cours d'une incubation de 24 h à 37 °C (Fig. 5b), les CMI correspondent à 0,0074 μM et 0,028 μM de médicament libre. équivalents. Par rapport à la référence cpx, le complexe d'inclusion βCD-cpx a fourni des augmentations d'environ 28 fois de l'activité antimicrobienne pour toutes les souches bactériennes testées. L'efficacité antibactérienne de βCD-arg-cpx était supérieure à celles des autres avec des CMI de 0,0045 μM pour E. coli, 0,018 μM pour P. aeruginosa et 0,060 μM pour S. aureus. Avec une teneur en cpx de 58 % en poids et jusqu'à 30 % de libération de médicament (Fig. 5b), la CMI était égale à 0,0008 μM, 0,003 μM et 0,010 μM d'équivalents cpx libres, respectivement. En conséquence, par rapport à la référence cpx, βCD-arg-cpx avait une activité antimicrobienne augmentée de 260 fois, 260 fois et 78 fois pour les souches bactériennes testées, respectivement.

La cytotoxicité dans les cellules de mammifères a été évaluée à l'aide de cellules épithéliales pulmonaires (A549) (tableau 1 et figure 6a). Le complexe βCD-arg-cpx a été caractérisé comme non toxique (avec une valeur CC50 élevée de 2000 μg/ml (1220 μM)). Seules des doses à haute concentration (> 1 000 μg / ml (610 μM)) de βCD-arg-cpx ont montré une réduction dose-dépendante de la viabilité cellulaire (Fig. 6b), ce qui correspondait à environ 100 000 à 800 000 fois plus élevé MIC. La complexation de cpx à βCD diminue la toxicité (tableau 1). De plus, il est important de noter que l'indice de sélectivité (IS) a augmenté dans les différents tests bactériens par rapport à celui du cpx soluble (13 fois pour E. coli, 17 fois pour P. aeruginosa et 42 fois pour S. aureus) ( Tableau 1). En d'autres termes, alors que les concentrations nanomolaires présentaient une activité antimicrobienne efficace, des concentrations millimolaires étaient nécessaires pour les effets toxiques, présentant une fenêtre thérapeutique étendue pour une application sûre du complexe et augmentant l'efficacité in vivo possible par rapport aux cpx commerciaux solubles.

Cytotoxicité de βCD-arg-cpx et de ses composants pour les cellules épithéliales pulmonaires A549 (a). Le graphique montre le pourcentage de viabilité des cellules A549 après incubation avec différentes concentrations de complexes βCD (0 mg/ml (noir), 0,5 mg/ml (motif), 1 mg/ml (gris clair), 1,5 mg/ml (gris foncé ) et 2 mg/ml (bordure noire). Le DMSO a été utilisé comme contrôle positif pour la toxicité, tandis que les monocouches A549 non traitées ont été utilisées comme contrôle négatif pour la cytotoxicité ; n = 3 ; les barres d'erreur se réfèrent à l'écart-type de la viabilité par rapport aux non-traités Comparaison de la croissance de P. aeruginosa PAO1 (blanc) en présence de βCD-arg-cpx (0,03 μg/ml ou 0,020 μM) (violet), βCD-NaOH-cpx (0,2 μg/ml ou 0,132 μM) (vert ), βCD-cpx (0,2 μg/ml ou 0,140 μM) (bleu), βCD-arg (0,03 μg/ml ou 0,0023 μM) (orange) et βCD (0,03 μg/ml ou 0,0026 μM) (rose) (b) ; n = 3 ; les barres d'erreur se réfèrent à la densité optique SD.

Nous avons ensuite étudié l'activité antimicrobienne en analysant les valeurs de CMI et la cinétique de la croissance bactérienne, comme présenté à la Fig. 6b pour le cas de P. aeruginosa. Plus de détails sur le test de microdilution effectué pour les complexes βCD-arg-cpx et βCD-cpx, les composants auxiliaires CD-arg et CD ainsi que la comparaison directe du médicament βCD-arg-cpx avec le médicament cpx libre sont présentés dans la Fig. 6 supplémentaire. les composants complexes, βCD et βCD-arg n'ont pas modifié la croissance bactérienne. D'autre part, à 0,2 μg/ml, le βCD-cpx et le βCD-NaOH-cpx (en tant que version βCD-cpx obtenue en milieu alcalin) (avec des concentrations molaires de 0,140 μM et 0,132 μM, respectivement) ont ralenti la croissance bactérienne avec une bactériostatique claire. tandis que le βCD-arg-cpx a permis des effets bactéricides à 0,03 μg/ml (0,018 μM). Ces résultats ont fourni des preuves claires que l'amélioration de l'activité antimicrobienne pour βCD-arg-cpx n'est pas une conséquence du pH auquel le complexe est formé (bien que βCD-NaOH et βCD-arg-cpx aient des structures similaires). De plus, cela reflète directement le rôle particulier de l'arginine en tant que lieur. La diminution de la CMI entre le complexe d'inclusion βCD-cpx classique moins stable et l'assemblage βCD-arg-cpx plus stable peut être une conséquence de la façon dont ils se libèrent et se désassemblent. En raison des faibles interactions entre les antibiotiques et la βCD dans le complexe d'inclusion, lorsqu'ils se dissolvent, le complexe se décompose, permettant la libération du médicament libre. D'autre part, lorsque l'arginine relie βCD et cpx, les forces de liaison sont plus fortes et le démontage des structures en forme de bâtonnet entraîne une libération progressive de cpx libre et également de cpx-arg en tant que forme médicamenteuse plus active.

Dans un contexte morphologique, après traitement cpx et βCD-arg-cpx de bactéries gram-négatives (E. coli et P. aeruginosa), nous avons observé une filamentation bactérienne (Figs. 7 et 8, respectivement). C'était une preuve que le mécanisme antibactérien principal de cpx n'était pas modifié, et cela a également été observé lorsque le médicament se trouvait dans l'assemblage complexe βCD-arg-cpx. Cpx est bien connu pour affecter la réplication de l'ADN en ciblant l'ADN gyrase, qui inhibe la division cellulaire bactérienne30,31. Sous un stress induit par les antibiotiques, les bactéries qui arrêtent la division cellulaire continuent leur croissance en inhibant la septation cellulaire, en augmentant leur longueur et en formant de longs filaments32. Selon les conditions de stress, les bactéries à l'intérieur des filaments peuvent survivre ou mourir30. Si les unités cellulaires individuelles connectées au sein d'un filament restent viables et forment de longues chaînes multicellulaires, le soulagement du stress se produit dans la souche résistante aux antibiotiques en évolution31. Dans ce contexte, des concentrations sous-inhibitrices de cpx induisent la filamentation de bactéries en forme de bâtonnet comme étape de transition vers leur évolution en souches résistantes à cpx32. Après traitement avec des concentrations de cpx très faibles et subinhibitrices, 0,003 μg/ml (0,008 μM) chez E. coli et 0,03 μg/ml (0,08 μM) chez P. aeruginosa, nous avons observé une filamentation très intense et longue chez E. coli (Fig. 7b, e, h) (comparer à la référence non traitée (Fig. 7a, d, g), tandis que P. aeruginosa n'a montré qu'un allongement cellulaire avec quelques cas de filaments très longs (Fig. 8b, e, h) (qui était non détecté dans la référence (Fig. 8a, d, g). Les septa de division connectés, observés dans les images SEM, résultaient de l'inhibition bactérienne de la division cellulaire. Seules quelques cellules filamenteuses étaient mortes, comme l'a révélé la coloration vivante/morte, tandis que la majorité est resté en vie et a survécu au stress induit par la faible concentration de cpx (Figs. 7e, 8e).La membrane cellulaire bactérienne est restée intacte (comme le montre la coloration avec FM464 uniquement à la surface) et a clairement montré plusieurs nucléosomes le long des filaments (coloré avec DAPI) (Figs. 7h, 8h) Nous avons également observé des bactéries de taille normale connectées aux extrémités des filaments (Fig. 7h), indiquant un débogage et la formation possible de souches résistantes aux antibiotiques.

Morphologie et surface des cellules d'E. coli avant (a) et après exposition à une faible concentration de cpx (0,003 μg/ml ou 0,008 μM) (b) et équivalent de cpx en βCD-arg-cpx (0,003 μg/ml ou 0,002 μM) (c); E. coli vivant coloré avec des colorants vivants/morts (d) et une fraction de cellules viables d'E. coli traitées avec 0,003 μg/ml (0,008 μM) cpx (e) et βCD-arg-cpx (0,002 μM) (f). Structure membranaire d'E. coli de type sauvage colorée avec des colorants FM464/DAPI (g) et des bactéries traitées avec 0,003 μg/ml de cpx pur (0,008 μM) (h) et un complexe CD-arg-cpx (0,002 μM) (i).

Morphologie et surface des cellules PAO1 avant (a) et après exposition à faible concentration cpx (0,03 μg/ml ou 0,08 μM) (b) et équivalent cpx en βCD-arg-cpx (0,03 μg/ml ou 0,02 μM) (c) . P. aeruginosa PAO1 vivant coloré avec des colorants Live/Dead (d) et une fraction de cellules viables traitées avec 0,03 μg/ml cpx (0,08 μM) (e) et βCD-arg-cpx (0,02 μM) (f). Structure membranaire de P. aeruginosa PAO1 de type sauvage colorée avec des colorants FM464/DAPI (g) et des bactéries traitées avec 0,03 μg/ml cpx pur (0,08 μM) (h) et complexe βCD-arg-cpx (0,02 μM) (i) .

Une situation complètement différente a été observée lors du traitement aux mêmes concentrations du complexe βCD-arg-cpx utilisé pour le cpx soluble (Figs. 7, 8). Chez E. coli, une très faible concentration en cpx (0,003 μg/ml (0,002 μM) du complexe βCD-arg-cpx a effectivement arrêté la croissance bactérienne et diminué le nombre de cellules filamentées (Fig. 7c). Les filaments contenaient des membranes cellulaires intactes et entités multinucléosomes (Fig. 7i). Plus important encore, toutes les bactéries détectées, de taille normale et filamentées, ont été confirmées mortes (Fig. 7f). Un résultat similaire a été obtenu pour P. aeruginosa exposé à une faible concentration en cpx. (0,03 μg/ml (0,02 μM)) du complexe βCD-arg-cpx Bien que le nombre de filaments formés ait augmenté, un examen plus attentif de leur surface a révélé de forts dommages, tandis que leur environnement a montré de nombreux fragments cellulaires restant après la décomposition (Fig. 8c) Une décomposition similaire de P. aeruginosa a été détectée après exposition à une dose élevée de cpx (0,2 μg/ml (0,52 μM), ce qui a entraîné une augmentation de la formation de vésicules membranaires induite par un mécanisme explosif de lyse cellulaire30. Comme observé chez E. coli, tous les P. aeruginosa filamenteux étaient morts (Fig. 8f). FM646 / DAPI a révélé leur structure multinucléaire et la déformation de leur membrane en vésicules (Fig. 8i). La déformation de la membrane, la formation de vésicules et les dommages cellulaires par lyse cellulaire explosive étaient progressifs et dépendaient de la concentration du complexe βCD-arg-cpx (Fig. 7 supplémentaire). À des concentrations plus faibles (0,03 μg/ml (0,02 μM), des filaments et des cellules de taille normale ont été détectés. Ils avaient tous des parois cellulaires endommagées contenant de petits trous et étaient partiellement décomposés en vésicules (taille de 200 nm). arg-cpx (0,1 μg/ml (0,06 μM)), les filaments n'ont plus été détectés et toutes les cellules restantes de taille normale ont été complètement lysées en fragments de paroi cellulaire ressemblant à des vésicules d'environ 100 nm. leur réponse au stress croissant induit par le cpx chargé dans le complexe Des changements similaires incluant des déformations intensives de la membrane, des dommages à la structure des cellules, et enfin une activité antimicrobienne lorsque le complexe βCD-arg-cpx était utilisé à des concentrations beaucoup plus faibles que le médicament cpx libre ont également été observés pour S. aureus, une souche gram-positive (Fig. 8 supplémentaire).

La toxicité et l'efficacité in vivo du complexe βCD-arg-cpx ont été étudiées chez les vers Galleria mellonella (Fig. 9) en tant que modèle animal préalablement optimisé pour évaluer l'efficacité antibactérienne et la toxicologie33,34. La toxicité a été étudiée à des concentrations élevées du complexe (jusqu'à 2 421 mg/kg) et une survie de 100 % a été observée pour toutes les concentrations étudiées. Pour l'étude d'efficacité antibactérienne, les vers ont été préinfectés avec P. aeruginosa PAO135. Sans aucun traitement, 100 % de décès ont été obtenus après 24 h. Le traitement post-infection avec βCD-arg-cpx à des concentrations de 5 mg/kg (3,3 mM) et 10 mg/kg (6,6 M) a entraîné une survie de 100 %. À titre de référence, le traitement avec 5 mg/ml (13,3 mM) de cpx libre n'a entraîné que 20 % de survie. Une meilleure efficacité du traitement avec le complexe βCD-arg-cpx par rapport au médicament libre est en outre étayée par le fait que le complexe ne contient que 58% en poids de cpx, qui est lentement libéré des structures assemblées (comme illustré à la Fig. 5) .

Toxicité du complexe βCD-arg-cpx montrant une survie larvaire très élevée pour toute la gamme de concentration testée (jusqu'à 2421 mg/kg) (a). Etude comparative d'efficacité antibactérienne chez des larves infectées par PAO1 (bleu foncé) et traitées par le complexe βCD-arg-cpx (vert clair et marron) et le médicament cpx libre (vert foncé et violet) (teneur équivalente en cpx de 5 et 10 mg cpx/ kg de larve, respectivement) qui montre une survie plus élevée des vers préinfectés après traitement avec le complexe (b). Astérisques : différences statistiquement significatives par rapport au témoin P. aeruginosa PAO1 dans un test du log-rank (** valeur p < 0,01) ; n = 5. Cette figure représente la même expérience répétée plusieurs fois, qui a donné des résultats identiques à chaque fois.

Le mécanisme sous-jacent de base de l'action antimicrobienne dans le médicament complexé βCD-arg-cpx assemblé reste le même que celui de son médicament sous forme libre. Le complexe βCD-arg-cpx a la même capacité à inhiber la progression de la division cellulaire généralement obtenue avec le cpx libre ainsi qu'à induire des changements similaires liés au stress chez les bactéries, tels que la filamentation et la lyse explosive entraînée par la formation de vésicules membranaires. Bien que ces deux formes de médicaments utilisent le même mécanisme d'action, une différence dans leur efficacité est évidente et pourrait être attribuée à une différence dans leur biodisponibilité. La présence du composant βCD, avec la capacité connue d'augmenter les interactions avec les composants de la paroi cellulaire12, favorise certainement le transfert de médicament à travers les membranes et augmente par conséquent l'efficacité antimicrobienne aux concentrations disponibles à l'intérieur de la cellule bactérienne. Cependant, comme on l'a vu après comparaison directe d'une inclusion de βCD-arg moins stable et de complexes βCD-arg-cpx plus stables, l'effet ne peut pas être attribué uniquement à la présence de βCD. En raison de la nature réversible de la liaison dans les complexes d'inclusion, la solubilisation fournit la forme médicamenteuse libre en équilibre avec les molécules de βCD. Ce type d'équilibre améliore le transfert de médicament à travers la membrane mais est beaucoup moins efficace en tant que forme complexe βCD-arg-cpx plus stable. Un βCD-arg-cpx plus stable, dans lequel βCD et cpx sont liés via un lieur arginine, permet au βCD d'agir comme un composant de construction de la molécule de médicament. Avec la βCD, le transfert du médicament à travers la membrane est également affecté par la présence d'arginine et sa liaison à la molécule de médicament.

Par conséquent, le cpx complexé a été transféré plus efficacement vers sa cible (ADN gyrase) et a pu induire le même niveau de stress que des concentrations beaucoup plus élevées de cpx libre. Si les concentrations complexes étaient suffisamment élevées (toujours bien inférieures aux concentrations efficaces de médicament libre), les interactions de la βCD et de l'arginine liées au médicament avec les composants de la paroi bactérienne étaient suffisantes pour désintégrer la structure cellulaire bactérienne et induire un processus de lyse explosif. Tous ces faits indiquent que le stress induit à de très faibles concentrations de βCD-arg-cpx, permet une amélioration importante de l'activité antimicrobienne. Des enquêtes détaillées sur le potentiel de la forme médicamenteuse complexée pour empêcher les processus évolutifs adaptatifs qui produisent des souches résistantes restent un défi intéressant pour l'avenir.

Ce type innovant de complexes βCD, dans lesquels des lieurs sont utilisés pour établir des connexions plus stables entre βCD et un médicament, a le potentiel d'améliorer l'efficacité d'antibiotiques précédemment approuvés et utilisés en clinique. Produits à l'aide d'une chimie très simple, technologiquement peu exigeante et très économique, de tels complexes pourraient être des outils très prometteurs pour la réutilisation, le reprofilage ou la réutilisation de différents médicaments. Les recherches futures dans ce domaine devraient se concentrer sur l'exploration de toutes les possibilités disponibles introduites par l'amélioration de la biodisponibilité des médicaments dans ce type de complexe, y compris leur capacité à développer et à affecter des souches résistantes aux antibiotiques, à atténuer la toxicité des médicaments et à améliorer la biocompatibilité. De tels complexes peuvent offrir des options supplémentaires dans le pipeline d'antibiotiques et encourager l'industrie pharmaceutique à explorer des formes plus efficaces d'anciens antibiotiques et à participer activement à la résolution du manque mondial d'antibiotiques efficaces en tant que problème de santé persistant et très grave à l'ère moderne.

Le complexe a été formé à l'aide de L-arginine (arg, acide L-2-amino-5-guanidinopentanoïque, C16H14N4O2, Sigma–Aldrich, Allemagne), de chlorhydrate de ciprofloxacine (cpx, Cayman Chemical Company) et de β-cyclodextrine (βCD, Sigma– Aldrich C4805, Allemagne). Tous les produits chimiques et réactifs utilisés étaient de qualité analytique. Toutes les expériences ont été réalisées avec de l'eau ultradistillée produite en laboratoire.

Avant de former le complexe, l'arginine (50 ml, 0,4 mg/ml) et la cyclodextrine (50 ml, 2 mg/ml) ont été dissoutes dans de l'eau sous agitation continue (200 tr/min) pendant 15 h à température ambiante. Les solutions prémélangées ont été ajoutées à une solution aqueuse de ciprofloxacine (0,8 mg/ml) et l'agitation (200 tr/min) a été poursuivie pendant les 24 heures suivantes. Le précipité blanc est apparu 2 h après l'addition de ciprofloxacine. Après 24h de mélange, le surnageant a été séparé par centrifugation (8000 rpm), et le précipité a été redispersé dans 5 ml d'eau distillée. La dispersion a été congelée dans de la neige carbonique (pendant 3 h) et lyophilisée (24 h, Christ Alpha 1–4, Martin Christ). Des échantillons témoins ont été formés selon le même protocole mais avec remplacement de l'arginine par une solution aqueuse de NaOH pour former βCD-NaOH-cpx et avec remplacement de l'arginine par de l'eau distillée pour former βCD-cpx. En raison d'un manque de précipitation dans les échantillons témoins, le volume total du mélange a été congelé et lyophilisé. Toutes les poudres ont été conservées dans des récipients en verre couverts et stockées dans des conditions ambiantes pour des tests supplémentaires.

Des analyses par diffraction des rayons X sur poudre (pXRD) ont été effectuées dans la plage 2–70 ° 2Θ avec une taille de pas de 0, 02 ° et un enregistrement de 2 s par étape à l'aide d'un diffractomètre Bruker AXS D4 Endeavour. Les études spectroscopiques infrarouges à transformée de Fourier (FTIR) ont été réalisées par un spectrophotomètre Perkin Elmer Spectrum 400 MIR en utilisant la technique DRIFT. Les spectres ont été enregistrés dans des poudres obtenues en mélangeant 5 mg d'échantillons avec 80 mg de KBr. La spectroscopie photoélectronique à rayons X (XPS) a été réalisée avec le Versaprobe 3 AD (Phi, Chanhassen, États-Unis) en utilisant une source de rayons X Al-Kα monochromatique. Pour chaque mesure, les spectres ont été acquis sur une taille de spot de 200 µm avec le neutraliseur de charge activé, car les pastilles étaient placées sur un double ruban non conducteur. Les spectres d'enquête ont été mesurés à une énergie de passage de 280 eV et un pas de 1 eV, tandis que les spectres à haute résolution ont été mesurés à une énergie de passage de 27 eV et un pas de 0,025 eV. La neutralisation de la charge a été utilisée, de sorte que l'échelle d'énergie des spectres XPS a été corrigée en déplaçant le pic C1s du carbone vers l'énergie de liaison de 284,8 eV. Les données XPS ont été analysées avec le logiciel PHI Multipak. Afin d'éliminer la couche de surface de la pastille pour examiner la surface sous-jacente, la pulvérisation de l'échantillon avec des amas d'argon a été utilisée. L'échantillon a été pulvérisé pendant 1 min à 5 kV et 20 nA sur une zone de 2 × 2 mm, suivi d'une analyse ponctuelle à haute résolution de 200 µm. Les produits de dissolution ont été identifiés par spectrométrie de masse. Les mesures ont été effectuées à l'aide d'un spectromètre de masse à temps de vol à accélération orthogonale hybride Q-Tof PremierTM (Waters-Micromass, Manchester, Royaume-Uni) équipé de sources d'ionisation à pression atmosphérique (API) et couplé à un chromatographe liquide ultra-performant (TOF MS/ UpLC). La détection a été réalisée via une source d'ionisation électrospray (ESI) en mode positif. Pour la microscopie électronique à balayage morphologique (SEM, Nova NanoSEM), les poudres ont été dispersées dans l'eau et déposées sur des membranes filtrantes de 50 nm collées sur du ruban de carbone et recouvertes de carbone de 5 nm. Des analyses structurales en microscopie électronique à transmission (MET, Tecnai Spirit 120 kV) ont été réalisées sur des échantillons dispersés dans l'eau et déposés sur des grilles de cuivre. Les images STEM ont été prises avec un microscope électronique à balayage (SEM) Verios 4 G HP (Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, États-Unis) en mode STEM. Un système de spectroscopie à rayons X à dispersion d'énergie (EDXS) avec détecteur Ultim Max 65 et logiciel AZtec (Oxford Instruments Abingdon, Royaume-Uni) a été utilisé pour la cartographie EDS. L'imagerie de fluorescence a été réalisée sur des poudres dispersées dans l'eau déposées sur des lames de microscope à l'aide d'un microscope à fluorescence inversé Nikon ECLIPSE Ti-S/L100 (Nikon) couplé à une caméra Nikon DS-Qi2. Les potentiels zêta ont été mesurés à l'aide d'un Mavern Nanosizer.

Les tests antibactériens ont été effectués avec Escherichia coli MG1655 (ATCC 47076), Pseudomonas aeruginosa PAO1 (ATCC 15692) et Staphylococcus aureus Rosenbach (ATCC 12600). Les souches ont été cultivées pendant une nuit à 37 ° C dans un milieu de croissance liquide (Luria Bertani, LB) (Scharlab, Espagne) pour E. coli et P. aeruginosa et un bouillon de soja trypsique (TSB) (Scharlab, Espagne) pour S. aureus. Les échantillons bactériens ont été dispersés par ultrasons dans un milieu de croissance pendant 30 s (A = 18 %, W = 250 W, on:off = 2:1 s) pour former des stocks de 2 mg/ml, qui ont ensuite été dilués aux concentrations testées. Les puits de la plaque de microtitration (plaque de dosage à 96 puits, polystyrène traité pour la culture tissulaire ; Costar 3595, Corning Inc., Corning, NY) ont été inoculés avec 100 μl de bactéries (OD550 = 0,05) et 100 μl des dilutions en série spécifiques du test échantillons. Les témoins comprenaient un milieu de croissance et des bactéries sans traitement. L'incubation a été réalisée dans un lecteur de microplaques multimode Infinite M200 Pro (Tecan) à 37 ° C pendant 14 h avec agitation orbitale continue. La croissance bactérienne a été évaluée en mesurant la densité optique à 550 nm toutes les 15 min. Toutes les concentrations ont été testées à plusieurs reprises en trois répétitions (n = 3).

Pour évaluer la viabilité bactérienne, les échantillons testés ont été dispersés dans un milieu de croissance LB ou TSB pendant 30 s (A = 18%, W = 250 W, on:off = 2:1 s) et mélangés avec des bactéries jusqu'à un volume final de 1 ml (OD550 = 0,3). Après incubation pendant 12 h, 100 μl ont été centrifugés pendant 5 min à 6000 rpm, et le surnageant a été remplacé par 25 μl de test de viabilité bactérienne Live/Dead BacLight (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific) contenant du SYTO9 et de l'iodure de propidium (PI) en 1X solution saline tamponnée au phosphate (PBS) dans un rapport de 1:1 et à une concentration de 3 × 10−6 mg/ml. Elle a été suivie d'une incubation de 15 minutes dans l'obscurité pour colorer les bactéries. Les bactéries fluorescentes ont été visualisées par un microscope à fluorescence inversé Nikon ECLIPSE Ti-S/L100 (Nikon) couplé à une caméra Nikon DS-Qi2 (Nikon).

Pour évaluer l'intégrité de la membrane, les échantillons testés ont été dispersés dans un milieu de croissance LB ou TSB pendant 30 s (A = 18 %, W = 250 W, on:off = 2:1 s) et mélangés avec des bactéries jusqu'à un volume final de 1 ml (OD550 = 0,3). Après 12 h d'incubation, 100 μl ont été centrifugés 5 min à 6000 rpm, et le surnageant a été remplacé par 50 μl de FM 464 (N-(3-triéthylammonium propyl)-4-(6-(4-(diéthylamino)phényl )hexatrienyl)pyridinium dibromide, Invitrogen, Thermo Fisher Scientific)/DAPI (diamidino-2-phenylindole (DAPI; Biotium, Fremont, CA) dans une solution saline équilibrée de Hank (HBSS) (contenant 0,4 μl de 5 mg ml-1 FM 464 et 1 μl de DAPI 125x) Les échantillons ont été colorés pendant 15 min dans de la glace, protégés de la lumière, puis analysés à l'aide d'un microscope fluorescent Nikon ECLIPSE Ti-S/L100.

Des analyses morphologiques des cellules bactériennes affectées par le complexe étudié ont été réalisées à l'aide de FEISEM (Nova NanoSEM). Cent microlitres de bactéries incubées avec le complexe pendant 12h ont été centrifugées 5 min à 6000 rpm et fixées après remplacement du milieu de croissance par 50 µl de glutaraldéhyde (3wt%). L'étape de fixation a été réalisée pendant 3 h à température ambiante. Les bactéries fixées ont été déposées sur des membranes poreuses par filtration sous vide doux, lavées trois fois avec du PBS (pendant 15 min pour chaque lavage) et déshydratées dans de l'éthanol dilué en série (30, 50, 70, 90 et 100 % en poids, 30 min à chaque concentration). Les échantillons ont été séchés aux points critiques.

Les tests ont été effectués sur des cellules épithéliales pulmonaires humaines A549 (ATCC® CCL-185™). Les cellules ont été cultivées dans du DMEM/F-12 (Gibco, Thermo Fisher Scientific) additionné de 1 % (v/v) de pénicilline-streptomycine (Gibco, Thermo Fisher Scientific) et de 10 % (v/v) de sérum de veau fœtal décomplémenté (Gibco, Thermo Fisher Scientific) et cultivées dans un incubateur humidifié (Memmert) à 37 °C et 5 % (v/v) de CO2. Le complexe testé a été dispersé par ultrasons dans du DMEM pendant 30 s (A = 18 %, W = 250 W, on:off = 2:1 s) pour former une solution mère (2 mg/ml). Les cellules cultivées à confluence dans une plaque à 96 puits ont été traitées avec des dilutions en série du complexe et incubées à 37 ° C dans 5 % de CO2 pendant 24 h. Le test de cytotoxicité a été réalisé en ajoutant 20 μl de réactif de viabilité cellulaire Presto blueTM 10 x (Molecular Probes, Invitrogen, Thermo-Fisher Scientific) par puits, en incubant pendant 30 min et en enregistrant la fluorescence à excitation λ = 560 nm et émission λ = 590 nm . Les références comprenaient le complexe sans cellules dans du DMEM, le colorant pur dans du DMEM, des cellules sans le complexe (comme témoin négatif) et des cellules avec du DMSO (comme témoin positif). Toutes les concentrations ont été testées à plusieurs reprises en triple exemplaire (n = 3). La viabilité a été normalisée aux cellules sans traitement (% de viabilité par rapport au contrôle négatif).

Les larves de Galleria mellonella, utilisées comme modèle in vivo35, ont été cultivées à 34 °C jusqu'à un poids de 200 à 250 mg. Le complexe étudié a été dispersé dans du PBS au cours de l'étude de toxicité à l'aide d'ultrasons (30 s, A = 18 %, W = 250 W, on:off = 2:1 s) pour former une solution mère de 5 mg/ml. Un inoculum de 10 ul de la dispersion complexe (à différentes concentrations) a été injecté dans la zone supérieure droite de la fausse patte des larves à l'aide d'une seringue Hamilton de calibre 22. Chaque concentration du complexe a été injectée dans cinq larves par groupe de test (n = 5). Le groupe témoin a été inoculé avec 10 μl de PBS 1x (Fisher Scientific) de la même manière. Après inoculation, les larves ont été maintenues à 37 °C pendant 72 h. La mortalité larvaire a été observée toutes les 16 à 24 h. Les tests ont été répétés. Les courbes de survie ont été tracées à l'aide de l'analyse de Kaplan – Meier et les différences statistiquement significatives ont été déterminées par le test du log-rank unilatéral (logiciel GraphPad 9.0).

Au cours de l'étude d'efficacité, les larves de G. mellonella ont reçu une pré-injection de 10 μl d'une dose infectieuse de P. aeruginosa (PAO1) (6,4 × 103 ufc/ml) dans la partie supérieure droite de la fausse patte. Une heure après l'infection, un inoculum de 10 µl contenant différentes concentrations du complexe testé dispersé dans du PBS a été injecté dans la fausse-patte supérieure gauche. La procédure suivante était la même que pour l'étude de toxicité. Les témoins étaient des larves injectées avec du PBS 1x (témoin négatif) et des larves injectées avec de la ciprofloxacine (sans complexe) à 10 mg/kg (témoin positif). Chaque groupe testé contenait cinq larves (n = 5).

Les expériences ont été faites au moins en trois exemplaires et répétées 2 à 3 fois (selon l'expérience). Les résultats sont présentés sous forme de valeur moyenne ± ET. Les différences entre les groupes ont été évaluées par le test du log-rank unilatéral (logiciel GraphPad 9.0).

De plus amples informations sur la conception de la recherche sont disponibles dans le résumé des rapports de recherche sur la nature lié à cet article.

Toutes les données générées ou analysées au cours de cette étude sont incluses dans cet article publié et ses fichiers d'informations complémentaires. Les fichiers source derrière les Figs. 2, 4, 5, 6 et 9 sont présentés dans les fichiers de données supplémentaires 1 à 5, respectivement. Les fichiers source derrière les Figs supplémentaires. 1 à 4 et 6 sont fournis dans les fichiers de données supplémentaires 6 à 10, respectivement.

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Les auteurs sont reconnaissants à Angel Blanco Blanes et au Dr Samuel Sanchez du groupe Smart Nano-Bio-Devices de l'Institut de bio-ingénierie de Catalogne pour les mesures du potentiel zêta ainsi qu'au Dr Dušan Žigon du Centre de spectrométrie de masse de l'Institut Jozef Stefan pour Analyse MS ToF. La Commission européenne a financé ce travail dans le cadre du programme COFUND des actions Marie Skłodowska-Curie d'Horizon 2020 (accord de subvention n° 712754) et par le programme Severo Ochoa du ministère espagnol des sciences et de la compétitivité (subvention SEV-2014-0425 (2015-2019). ). ET a été soutenu par des subventions du Ministère espagnol de l'économie et de la compétitivité (MINECO/FEDER) (RTI2018-098573-B-100), de la Generalitat de Catalunya (2017SGR-1079 et du programme CERCA), des associations catalanes de la mucoviscidose et de la Fondation La Caixa . Un soutien financier supplémentaire a été fourni à MV par des subventions de l'Agence slovène de recherche (ARRS) (subventions J2-8169, N2-0150 et P2-0091).

Département des matériaux avancés, Institut Jozef Stefan, Jamova 39, Ljubljana, Slovénie

Marija Vukomanovic, Lea Gazvoda, Mario Kurtjak & Blaž Jaklic

International Postgraduate School of Jozef Stefan, Jamova 39, Ljubljana, Slovénie

Marija Vukomanovic, Lea Gazvoda et Blaž Jaklic

Centre de microscopie électronique et de microanalyse (CEMM), Institut Jozef Stefan, Jamova 39, Ljubljana, Slovénie

Jitka Hrescak

Infections bactériennes : thérapies antimicrobiennes, Institut de bioingénierie de Catalogne (IBEC), Institut des sciences et de la technologie, Baldiri Reixac 15-21, 08028, Barcelone, Espagne

Laura Moya-Andérico, Maria del Mar Cendra & Eduard Torrents

Section de microbiologie, Département de génétique, microbiologie et statistique, Faculté de biologie, Université de Barcelone, 643, avenue Diagonale, 08028, Barcelone, Espagne

Édouard Torrents

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Concept de recherche MV, synthèse et caractérisation, rédaction d'une première ébauche ; Analyses LG XRD et FTIR, analyses MK TEM et EDS, JH STEM et analyse de cartographie élémentaire, analyse BJ XPS, LM-A. étude in vivo, toxicité MC in vitro, mentorat ET financement. Tous les auteurs ont contribué à l'édition du texte jusqu'à la version finale.

Correspondance à Marija Vukomanovic ou Eduard Torrents.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Communications Biology remercie John-Sigurd Svendsen et les autres examinateurs anonymes pour leur contribution à l'examen par les pairs de ce travail. Rédactrice en chef de la gestion principale : Christina Karlsson Rosenthal.

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Réimpressions et autorisations

Vukomanovic, M., Gazvoda, L., Kurtjak, M. et al. Développement d'un complexe antimicrobien ternaire cyclodextrine-arginine-ciprofloxacine avec une stabilité améliorée. Commun Biol 5, 1234 (2022). https://doi.org/10.1038/s42003-022-04197-9

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Reçu : 12 mai 2022

Accepté : 31 octobre 2022

Publié: 12 novembre 2022

DOI : https://doi.org/10.1038/s42003-022-04197-9

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