Génération d'un parasite mutateur pour conduire la découverte de résistomes chez Plasmodium falciparum

Nature Communications volume 14, Numéro d'article : 3059 (2023) Citer cet article

1631 accès

19 Altmétrique

Détails des métriques

L'évolution in vitro de la résistance aux médicaments est une approche puissante pour identifier les cibles antipaludiques, cependant, les principaux obstacles à l'obtention de la résistance sont la taille de l'inoculum parasitaire et le taux de mutation. Ici, nous avons cherché à augmenter la diversité génétique des parasites pour potentialiser les sélections de résistance en modifiant les résidus catalytiques de l'ADN polymérase δ de Plasmodium falciparum. Les tests d'accumulation de mutations révèlent une élévation d'environ 5 à 8 fois du taux de mutation, avec une augmentation de 13 à 28 fois dans les lignées sous pression médicamenteuse. Lors d'une provocation avec l'inhibiteur de spiroindolone PfATP4 KAE609, une résistance de haut niveau est obtenue plus rapidement et à des inocula inférieurs à ceux des parasites de type sauvage. Les sélections donnent également des mutants résistants à un composé "irrésistible", MMV665794, qui n'a pas réussi à produire de résistance avec d'autres souches. Nous validons des mutations dans un gène jusque-là non caractérisé, PF3D7_1359900, que nous appelons protéine de résistance à la quinoxaline (QRP1), comme cause de la résistance au MMV665794 et à un panel d'analogues de la quinoxaline. Le répertoire génétique accru disponible pour ce parasite "mutateur" peut être exploité pour conduire la découverte du résistome de P. falciparum.

La découverte de médicaments antipaludiques a activement recherché des médicaments nouveaux ou améliorés pour traiter et finalement éliminer le paludisme. Les combinaisons thérapeutiques actuelles à base d'artémisinine (ACT) de première intention contre Plasmodium falciparum ont été compromises par l'émergence de parasites moins sensibles à la fois à l'artémisinine et aux médicaments partenaires en Asie du Sud-Est, un épicentre de la résistance antipaludique1,2. En outre, la résistance à l'artémisinine est une menace pour la santé publique des personnes vivant dans des régions endémiques du monde entier, comme en témoignent les récents rapports sur l'émergence de mutations kelch13 dans des isolats rwandais et ougandais qui entraînent une sensibilité réduite à l'artémisinine3,4. De nombreux composés antipaludiques prometteurs avec une bonne puissance et une activité en plusieurs étapes ont été découverts à l'aide d'un criblage phénotypique de cellules entières5. Cependant, cette approche présente des difficultés pour l'optimisation des pistes en raison du manque de connaissance de la cible moléculaire. Une meilleure compréhension de la cible médicamenteuse, du mode d'action et du mécanisme de résistance pourrait conduire à la conception de meilleurs médicaments capables de résister à la résistance aux médicaments6,7,8. En outre, la connaissance de la cible du médicament ou du gène de résistance fournit des marqueurs moléculaires pour la surveillance épidémiologique génomique sur le terrain afin de surveiller la propagation et le confinement de la résistance aux médicaments9,10.

L'évolution in vitro de la résistance aux médicaments suivie d'une analyse du génome entier est devenue une approche clé pour l'identification des cibles médicamenteuses en aidant à définir les modes d'action ainsi que les mécanismes et les propensions à la résistance11,12,13. Une sélection de résistance in vitro typique est effectuée à l'aide d'inoculums parasitaires allant de 105 à 109 parasites, qui sont exposés à un composé antipaludéen à une concentration capable de tuer tous les parasites sensibles aux médicaments8,14,15. Les parasites recrudescents peuvent ensuite être soumis à un séquençage du génome entier pour identifier le gène sous-jacent responsable du phénotype de résistance. Le principal obstacle au succès est la prolongation ou, dans certains cas, l'incapacité totale à sélectionner des parasites résistants, quel que soit le schéma de sélection ou l'origine de la souche. Ce processus à forte intensité de main-d'œuvre et de temps peut donc échouer à identifier une cible moléculaire ou un mécanisme d'action défini pour les composés de requête. Par exemple, dans un ensemble de sélections de résistance in vitro avec 48 composés par le Malaria Drug Accelerator Consortium (MalDA), 23 composés ont produit des parasites résistants avec une résistance observée après 15 à 300 jours16. Les composés qui ne produisent pas de parasites résistants après de multiples tentatives et conditions ont été qualifiés d'"irrésistibles"17. Bien qu'il puisse y avoir de multiples raisons possibles pour que les composés soient apparemment "irrésistibles", leur faible propension à la résistance est une qualité attrayante du point de vue de la découverte de médicaments antipaludiques et donc des informations sur leur mécanisme d'action seraient précieuses.

La capacité de sélectionner un parasite avec une mutation protectrice dépend, au moins en partie, d'une taille d'inoculum avec une variation génétique suffisante. Cependant, pour des raisons pratiques techniques, l'inoculum maximal pour les sélections de résistance in vitro est généralement plafonné à ~ 5 × 109 parasites par flacon (~ 10% de parasitémie avec 3% d'hématocrite dans une culture de 170 ml), des ordres de grandeur inférieurs à ce qui peut surviennent chez un être humain infecté. Des tailles de culture plus grandes et des temps de sélection prolongés consomment également plus de composé, ce qui peut être limitant. Plusieurs souches de laboratoire, ainsi que des isolats de terrain collectés à partir de l'épicentre de la résistance aux médicaments de l'ouest du Cambodge, se sont avérés avoir une gamme similaire de taux de mutation d'environ 10−9 à 10−10 substitutions de bases par site par cycle de vie asexué18,19, 20,21.

Dans ce travail, pour augmenter la diversité génétique représentée dans un volume de culture donné et potentiellement raccourcir l'échelle de temps expérimentale de sélection, nous utilisons CRISPR-Cas9 pour générer un parasite Dd2 mutant de P. falciparum qui a une activité de relecture déficiente de l'ADN polymérase sous-unité catalytique δ, inspirée d'une approche similaire chez le parasite du paludisme des rongeurs Plasmodium berghei22,23. Nous montrons que cette lignée de P. falciparum modifiée a un taux de mutation accru, réduisant l'inoculum et raccourcissant le temps nécessaire pour sélectionner la résistance à KAE609, un composé avec une cible connue24. Lorsqu'ils sont mis au défi avec un composé irrésistible précédemment identifié MMV665794 qui avait précédemment échoué dans les sélections avec les parasites 3D7 et Dd2 de type sauvage16,25, nous obtenons plusieurs clones résistants avec des mutations dans un gène de fonction inconnue, PF3D7_1359900. L'édition CRISPR-Cas9 de ces mutations candidates dans des parasites de type sauvage confère un niveau similaire de résistance à la lignée sélectionnée, démontrant le rôle de ce gène dans la résistance aux composés à base de quinoxaline. Nos résultats soutiennent le potentiel de ce parasite "mutateur" pour identifier de nouvelles cibles antipaludiques et comprendre les mécanismes de résistance aux médicaments.

Pour augmenter le répertoire génétique des parasites P. falciparum en culture, nous avons cherché à générer des parasites avec une activité de relecture 3ʹ−5ʹ altérée à partir de la sous-unité catalytique de l'ADN polymérase δ (PF3D7_1017000) afin d'augmenter le niveau de mutations spontanées basales, sur la base sur des travaux antérieurs sur la levure et le parasite du paludisme des rongeurs Plasmodium berghei22,23,26. L'ADN polymérase réplicative haute fidélité δ est une enzyme majeure pour la synthèse du brin retardé et contient une activité d'exonucléase 3ʹ−5ʹ qui peut exciser les nucléotides mal incorporés lors de la réplication de l'ADN27,28. La perturbation de deux résidus catalytiques conservés du domaine exonucléase de l'ADN polymérase δ (Fig. 1 supplémentaire) entraîne une altération de l'activité de relecture 3ʹ−5ʹ, entraînant une fidélité réduite de la réplication de l'ADN. Cela provoque une augmentation de la variation de la séquence nucléotidique et un taux de mutation plus élevé dans le génome29,30. Les deux résidus catalytiques conservés de la sous-unité de relecture de P. falciparum 3ʹ−5ʹ, D308 et E310, ont été remplacés par de l'alanine à l'aide de CRISPR-Cas9 dans le contexte de la souche Dd2 (Fig. 1A, B).

A Les résidus D308 et E310 ont été remplacés par l'alanine dans P. falciparum Dd2 en utilisant le plasmide pDC2-Cas9-gRNA contenant le sgRNA, Cas9 et la matrice du donneur. Les deux sites de liaison sgRNA et les mutations silencieuses du bouclier sont indiqués. Les parasites édités par CRISPR-Cas9 B ont été sélectionnés avec 5 nM de WR99210 et les clones édités ont été isolés par dilution limite. Trois parasites mutants clonaux de l'ADN polymérase δ (Dd2-Polδ) ont été sélectionnés pour le séquençage du génome entier et le test d'accumulation de mutations. C Fitness du parasite mutant Dd2-Polδ. Des tests de fitness compétitifs ont mélangé la lignée de référence fluorescente Dd2-GFP dans un rapport 1: 1 avec le clone H11 Dd2-WT ou Dd2-Polδ. La croissance a été déterminée par cytométrie en flux tous les deux jours pendant un total de 20 jours, avec la proportion de parasites GFP-positifs par rapport au total des globules rouges infectés détectés par MitoTracker Deep Red. Deux expériences biologiques indépendantes (n = 2) avec des triplicats techniques ont été réalisées, les données sont présentées sous forme de valeurs moyennes +/- SD. Les données source sont fournies sous la forme d'un fichier de données source.

L'ADN polymérase δ de P. falciparum devrait être essentielle à la survie du parasite31. Pour examiner si l'ablation de la fonction de relecture de l'ADN polymérase δ a entraîné un coût de remise en forme pour le parasite, nous avons effectué un test de remise en forme compétitif. Dd2-GFP, un parasite modifié qui exprime fortement la protéine de fluorescence verte (GFP), a été utilisé comme référence de croissance32. La lignée de référence Dd2-GFP a été mélangée dans un rapport 1: 1 avec Dd2 de type sauvage (Dd2-WT) ou le mutant Dd2 ADN polymérase δ (Dd2-Polδ), et les proportions relatives des deux lignées ont été mesurées par flux cytométrie tous les deux jours pendant 20 jours (~10 générations). Dd2-Polδ n'a montré qu'une remise en forme légèrement réduite par rapport à Dd2-WT en fonction de la rapidité avec laquelle chaque lignée a pu surpasser la référence Dd2-GFP à prolifération plus lente (Fig. 1C).

Pour tester les changements dans la diversité des séquences nucléotidiques et le taux de mutation, nous avons effectué un test d'accumulation de mutations en combinaison avec le séquençage du génome entier (Fig. 2A), comparant Dd2-Polδ à Dd2-WT. Trois clones de Dd2-Polδ (E8, F11, H11) et un clone de Dd2-WT ont été cultivés en milieu complet en continu pendant 100 jours (~ 50 générations) (Fig. 2A). Les parasites ont été collectés tous les 20 jours et les clones isolés par dilution limite. Un total de 12 clones de Dd2-WT et 37 clones de Dd2-Polδ, correspondant à un à trois clones par point de temps, ont été sélectionnés au hasard pour le séquençage du génome entier. Les génomes de tous les parasites ont été cartographiés sur le génome de référence Dd2 (PlasmoDB-44_PfalciparumDd2_Genome). Le génome central Dd2 comprenant les régions codantes et non codantes a été utilisé comme référence pour les appels de variantes à un seul nucléotide (SNV). La famille des gènes de l'antigène de surface variable (var) et la région subtélomérique de tous les chromosomes ont été exclues du génome central. Les coordonnées du génome central Dd2 sont définies dans le tableau supplémentaire 1. Les SNV de novo pour chacun des clones ont été déterminés par comparaison avec leurs lignées parentales au jour 0. Le nombre de SNV de novo dans Dd2-WT était en moyenne inférieur à 1 SNV par clone dans la séquence codante sur la période de culture de 100 jours. En revanche, chacun des clones Dd2-Polδ avait en moyenne 3 à 6 SNV par clone dans les régions codantes (exome) (Fig. 2B, Fig. 2A, B supplémentaires et Tableau supplémentaire 2 et Données supplémentaires 1). La différence dans le nombre de SNV dans les régions non codantes entre les clones Dd2-WT et Dd2-Polδ était moins prononcée (Fig. 2B). Néanmoins, chacun des clones Dd2-Polδ avait un plus grand nombre de SNV de tous types, en particulier des variants non synonymes, répartis sur les 14 chromosomes (Fig. 2C et Supplémentaires Fig. 3A, B). Nous avons examiné s'il existait des grappes de mutations (survenant dans les 20 pb), en identifiant 12 exemples, cependant, ceux-ci se trouvaient tous dans des régions intergéniques riches en AT (tableau supplémentaire 3). Nous n'avons identifié que quatre gènes contenant de multiples mutations faux-sens (Fig. 3C supplémentaire). La comparaison des substitutions de paires de bases pour les événements de transition (Ts) et de transversion (Tv) a montré une diminution modérée du rapport Ts:Tv dans Dd2-Polδ et une augmentation des transitions G:C → A:T de 2 à 4 fois (Fig. .4A, B).

Un test d'accumulation de mutation comparant Dd2-WT à trois clones de Dd2-Polδ. Toutes les lignées ont été cultivées en parallèle pendant 100 jours (~50 générations). Les parasites ont été échantillonnés pour l'isolement clonal tous les 20 jours et ensuite récoltés pour l'extraction de l'ADN génomique. Le séquençage du génome entier a été réalisé sur des échantillons prélevés aux jours 0, 20, 40, 60, 80 et 100. B Le nombre de SNV uniques dans les régions exome, non codante et centrale du génome des lignées Dd2-WT et Dd2-Polδ était identifié en soustrayant des SNV trouvés au jour 0. Chaque point représente un clone, où n = le nombre suivant de clones indépendants (WT:12, E8:12, F11:14, H11:11). La ligne médiane est indiquée et le 25e/75e centile délimité par la boîte, avec des moustaches indiquant min-max. Un test de rang signé Wilcoxon à paires appariées à deux queues a montré des différences statistiquement significatives pour les clones Dd2-Polδ par rapport à Dd2-WT, avec des valeurs de p comme indiqué (a : 0,0049 ; b : 0,0015 ; c : 0,002 ; d : 0,002 ; e : 0,002 ; f : 0,0298 ; g : 0,0005 ; h : 0,001). C Position génomique des SNV, code couleur par lignée parasitaire. D Les taux de mutation des clones Dd2-WT (n = 12) et Dd2-Polδ E8 (n = 12), F11 (n = 14) et H11 (n = 11), les données sont présentées en moyenne + /−SD (avec valeurs et intervalles de confiance à 95 % indiqués dans le tableau 1). Les données source sont fournies sous la forme d'un fichier de données source.

Nous avons ensuite déterminé les taux de mutation pour Dd2-WT et les trois clones Dd2-Polδ E8, F11 et H11 sur la base du nombre moyen de SNV de novo pour tous les clones de chaque lignée par génération, par génome ou exome (voir Méthodes). Chacun des clones Dd2-Polδ a montré des taux de mutation plus élevés que Dd2-WT, variant de 2 à 3 fois dans le génome central (régions codantes et non codantes) à 5 à 8 fois dans les régions codantes (exome) (Fig. 2D, Tableau 1 et données supplémentaires 2). Les clones Dd2-Polδ F11 et H11 ont montré un taux de mutation plus élevé que le clone E8 (Fig. 2D et Tableau 1), et ainsi toutes les expériences ultérieures ont été réalisées avec le clone H11. Pour examiner si les différences modestes de taux de mutation entre les clones pouvaient être attribuées à des mutations spontanées dans les gènes de réparation de l'ADN, nous avons également examiné si les gènes jouant un rôle dans la réparation de l'ADN étaient mutés dans les lignées Dd2-Polδ au cours de la période de culture de 100 jours ( Données supplémentaires 1). Bien que des SNV à l'intérieur ou à proximité des gènes de réparation de l'ADN aient été observés dans chacune des lignées Dd2-Polδ, aucun SNV unique n'a été partagé entre tous les clones. Le clone Dd2-Polδ E8 possédait des SNV dans la région codante de deux gènes putatifs de réparation de l'ADN : un changement G435E dans l'ADN polymérase thêta (PfDd2_130037000) et un changement N420K dans la protéine de réparation de l'ADN RHP16 (PfDd2_120056000). Le clone F11 de Dd2-Polδ présentait un changement de P225L dans l'hélicase 3 de type RuvB (PfDd2_130068000). Le clone Dd2-Polδ H11 n'avait pas de SNV dans la région codante d'aucun gène de réparation de l'ADN; cependant, un SNV a été observé dans la région non codante à proximité de l'antigène nucléaire cellulaire proliférant 2 (PfDd2_120031600) (Données supplémentaires 1).

Partant de l'hypothèse qu'un répertoire génétique plus diversifié disponible pour les cultures Dd2-Polδ augmenterait l'efficacité de la sélection des parasites résistants aux médicaments, nous avons réalisé une expérience de preuve de concept comparant Dd2-WT à Dd2-Polδ en utilisant un médicament avec un mode d'action bien caractérisé. KAE609 (cipargamine), actuellement en essais cliniques de phase II, cible le gène de l'ATPase sodique de type P de P. falciparum (Pfatp4, PF3D7_1211900) avec des SNV connus pour conférer une résistance24. Une sélection de résistance aux médicaments in vitro a été réalisée avec une gamme d'inoculums de départ fixés à 2 × 106, 2 × 107, 2 × 108 et 1 × 109 cellules parasitées, cultivées en présence de 2,5 nM KAE609 (~ 5 fois IC50 de Dd2 -WT) dans trois flacons indépendants par inoculum.

Après 5 jours de traitement médicamenteux, aucun parasite viable n'a été détecté par microscopie. La recrudescence de Dd2-WT n'a été observée qu'avec l'inoculum de départ le plus élevé de 1 × 109, avec des parasites observés aux jours 18, 21 et 30 dans les trois flacons de sélection indépendants. En revanche, la lignée Dd2-Polδ a renvoyé des parasites au jour 12 et avec un inoculum de départ inférieur (Fig. 3A). Les trois flacons contenant 2 × 108 et 1 × 109 parasites étaient positifs, et un flacon sur trois contenant 2 × 107 parasites présentait également des parasites recrudescents au jour 12. Aucun des trois flacons n'était positif pour les parasites avec l'inoculum de départ de 2 × 106 (Fig. 3A).

Un Dd2-WT (ligne bleue) et un Dd2-Polδ (ligne rouge) ont été cultivés en continu en présence de 2,5 nM de KAE609 (5 × IC50). Les inoculums de parasites variaient de 2 × 106 à 1 × 109 cellules, dans des flacons en triple, et les parasites ont été détectés par microscopie au cours de la période de sélection de 30 jours. Les parasites Dd2-Polδ ont été observés au jour 12 avec l'inoculum de départ de 2 × 107, 2 × 108 et 1 × 109, alors que les parasites Dd2-WT n'ont été détectés qu'avec l'inoculum de 109, apparaissant dans trois flacons aux jours 18, 21 et 30 , respectivement. B Courbes dose-réponse de KAE609 pour les lignées parentales non exposées à la pression médicamenteuse et les lignées sélectionnées par médicament (R1-R3) pour Dd2-WT (panneau de gauche) et Dd2-Polδ (panneau de droite). Montré est un essai représentatif (avec deux répétitions techniques, barres d'erreur montrant SD), avec des valeurs IC50 représentées comme moyenne +/- SD dérivée des répétitions biologiques suivantes (Dd2-WT, n = 6 ; Dd2-R1, n = 3 ; Dd2-R2, n = 3 ; Dd2-R3, n = 3 ; ADN-Polδ, n = 6 ; Polδ-R1, n = 6 ; Polδ-R2, n = 6 ; Polδ-R3, n = 5). C Modèle AlphaFold de PfATP4 montrant des mutations de résistance KAE609 situées dans ou à proximité des domaines transmembranaires. Les résidus bleus provenaient des sélections Dd2-WT, les rouges de Dd2-Polδ. Les données source sont fournies sous la forme d'un fichier de données source.

Avant la sélection, les lignées parentales Dd2-WT et Dd2-Polδ avaient une CI50 similaire d'environ 0,3 à 0,6 nM. Les lignées sélectionnées par KAE609 à partir du fond Dd2-WT avaient des valeurs IC50 comprises entre 3 et 9 nM (Fig. 3B). En comparaison, les lignées sélectionnées par le médicament à partir du fond Dd2-Polδ étaient sensiblement plus résistantes avec des valeurs d'IC50 d'environ 700 à 900 nM (Fig. 3B), trois ordres de grandeur plus élevées que leur lignée parentale.

Pour identifier les déterminants de la résistance à l'origine de ces phénotypes, l'ensemble des lignées sélectionnées a été examiné par séquençage du génome entier ainsi que par séquençage Sanger direct du gène pfatp4. Les deux approches ont révélé des mutations dans pfatp4 (PF3D7_1211900) dans ces lignées résistantes, provoquant des mutations protéiques à L350H et G199V dans le fond Dd2-WT du flacon 1 et du flacon 3, respectivement, et G358S dans toutes les lignées du fond Dd2-Polδ (Données supplémentaires 3). Il est prévu que les trois mutations soient situées dans ou à proximité de la région transmembranaire PfATP433 (Fig. 3C). Les mutations L350H et G358S ont été précédemment rapportées à partir d'une expérience de résistance in vitro dans Dd2 et 3D7 respectivement avec la dihydroisoquinolone SJ733, un autre composé ciblant PfATP434. L350H a également été sélectionné en utilisant KAE609 dans un isolat cambodgien25. En plus de PfATP4, des SNV non synonymes dans cinq autres gènes ont été observés (Données supplémentaires 3), illustrant que lors de la sélection avec la lignée Dd2-Polδ, des critères supplémentaires peuvent être nécessaires pour hiérarchiser les candidats lorsqu'aucune connaissance préalable de la cible n'est disponible. Sur les cinq gènes supplémentaires (PF3D7_0318500, PF3D7_0520800, PF3D7_1002200, PF3D7_1004200, PF3D7_1428400), l'examen du dépistage de la mutagenèse piggyBac31 en a identifié deux comme non essentiels, la mutation pour un troisième gène était dans une région de faible complexité, et pour le quatrième la mutation a également été observée dans certains clones de l'expérience d'accumulation de mutations sans médicament et est donc probablement une mutation de fond.

Dans l'ensemble, ces résultats ont confirmé que la lignée Dd2-Polδ peut sélectionner des parasites résistants aux médicaments dans la cible moléculaire attendue24,25,34, avec un nombre inférieur de parasites de départ (2 × 107 vs 1 × 109) et dans une période de sélection plus courte que Dd2-WT (12 jours contre 18–30 jours).

Nous avons ensuite défié la lignée Dd2-Polδ avec un composé "irrésistible". La classe « irrésistible » de composés fait généralement référence à des composés qui ne parviennent pas à produire un parasite résistant aux médicaments lors de sélections in vitro avec des souches standard (généralement Dd2 ou 3D7). L'identification du mécanisme d'action de ces composés est d'un grand intérêt en raison de leur faible propension à la résistance35. MMV665794, également connu sous le nom de TCMDC-124162 (2-N,3-N-bis[3-(trifluorométhyl)phényl]quinoxaline-2,3-diamine), est un antipaludéen à base de quinoxaline identifié à partir d'un criblage phénotypique à haut débit36. Des sélections initiales de résistance aux médicaments in vitro ont été effectuées avec ce composé dans des souches 3D7 et Dd2 de type sauvage en utilisant différentes approches, mais sans succès (tableau supplémentaire 4).

Nous avons traité Dd2-Polδ et Dd2-WT avec 95 nM (1 × IC50) du composé de quinoxaline par intermittence. Pour maximiser les chances d'obtenir une lignée résistante, nous avons utilisé un inoculum de départ élevé de 1 × 109 parasites par flacon, en triple exemplaire (Fig. 4A). Après 10 à 12 jours de pression, aucun parasite n'a pu être détecté par microscopie pour les deux lignées, et la pression médicamenteuse a été supprimée après le jour 20. Dd2-WT n'a pas récupéré pendant la période d'exposition de 60 jours (Fig. 4A), conformément à la précédente sélections infructueuses (tableau supplémentaire 4). En revanche, les trois flacons de la lignée Dd2-Polδ se sont rétablis au jour 21. La concentration de médicament a ensuite été augmentée à 2 × IC50, ce qui a entraîné une suppression des parasites. Au jour 40, les cultures ont été remplacées par un milieu complet sans médicament, et au jour 60, des parasites ont de nouveau été détectés dans les trois flacons. Les lignées clonales isolées à partir des parasites sélectionnés par médicament avaient une CI50 accrue d'environ 2 à 2, 5 fois par rapport à la lignée parentale non exposée à la pression médicamenteuse (Fig. 4B). Les parasites de deux flacons ont proliféré normalement lorsqu'ils ont été réexposés à une pression médicamenteuse constante à 2 × IC50, mais les parasites du troisième flacon n'ont pas survécu.

Un schéma de sélection montrant l'incapacité à développer une résistance à MMV665794 avec Dd2-WT, mais un isolement réussi de la résistance avec Dd2-Polδ. Panneau supérieur : Dd2-WT exposé à 1 × IC50 (95 nM) pendant 60 jours. Panneau inférieur : la pression de sélection Dd2-Polδ a été portée à 2 × IC50 (190 nM), avec une recrudescence observée après 60 jours dans 3 flacons indépendants, mais seuls 2 flacons sur 3 ont pu croître de manière stable sous la pression du médicament. Les parasites recrudescents ont ensuite été testés avec 3 × et 4 × IC50 mais n'ont pas survécu. B Courbes dose-réponse de MMV665794 pour les lignées parentales et les deux lignées résistantes (C1-2) qui ont pu survivre sous une pression de 2 × IC50. Montré est un essai représentatif (deux répliques techniques, barres d'erreur montrant SD), avec des valeurs IC50 représentées comme des valeurs moyennes +/- SD dérivées des répliques biologiques suivantes (DNA-Polδ, n = 7 ; Polδ-R1, n = 5 ; Polδ-R2, n = 5). Les données source sont fournies sous la forme d'un fichier de données source.

Pour déterminer si une résistance de niveau supérieur pouvait être obtenue, les cultures de parasites de deux flacons de recrudescence ont été chacune divisées en deux autres flacons (chacun avec 4,5 × 108 parasites) qui ont été soumis à une pression supplémentaire à 3 × IC50 ou 4 × IC50. Les parasites sont morts après 4 jours dans les deux traitements et ont ensuite été cultivés dans un milieu complet sans médicament (Fig. 4A). Cependant, aucun parasite n'a récupéré après 60 jours, ce qui indique que seule une résistance de faible niveau a pu être obtenue contre MMV665794.

Pour identifier les mutations de résistance causales dans les lignées sélectionnées par MMV665794 (Fig. 4), nous avons effectué un séquençage du génome entier sur six clones isolés à partir de deux sélections indépendantes. Le seul gène muté en commun entre toutes les lignées sélectionnées à la quinoxaline était PF3D7_1359900 (PfDd2_130065800), codant pour une protéine membranaire de Plasmodium conservée de fonction inconnue. La protéine de 2126 acides aminés code quatre domaines transmembranaires prédits (Fig. 5A). Chacun des 6 clones contenait l'un des deux SNV distincts, soit G1612V (quatre clones du flacon 2) ou D1863Y (deux clones du flacon 3), équivalents à G1616V et D1864Y dans Dd2, respectivement (Fig. 5A et Données supplémentaires 3). Aucune nouvelle variante du nombre de copies n'a été détectée dans les clones sélectionnés par médicament (données supplémentaires 4).

Un PfQRP1 (PF3D7_1359900) code pour une protéine de 250 kDa avec quatre domaines transmembranaires prédits. Les deux mutations G1612V et D1863Y trouvées dans deux sélections indépendantes avec MMV665794 sont situées dans un domaine C-terminal qui partage la conservation avec les hydrolases α/β. Modèle B des 656 résidus C-terminaux (1471–2126) de PfQRP1 montrant la triade catalytique putative de Ser-Asp-His (jaune) et les mutations de résistance G1612V et D1863Y (violet). C, D Valeurs IC50 de CRISPR-Cas9 édité QRP1. Les lignées Dd2 codant pour les mutations équivalentes G1612V et D1863Y ont montré une sensibilité significativement réduite contre MMV665794 et étaient résistantes de manière croisée à MMV007224, une molécule structurellement apparentée partageant l'échafaudage quinoxaline, en comparaison avec Dd2-WT et des contrôles silencieux édités. Chaque point représente un réplicat biologique, avec n = 6 réplicats indépendants avec une moyenne ± SD montrée, et une signification statistique par rapport aux contrôles silencieux édités déterminés par le test Mann-Whitney U bilatéral. Les données source sont fournies sous la forme d'un fichier de données source.

Pour mieux comprendre la fonction potentielle de PF3D7_1359900, qui n'a que des orthologues évidents dans l'Apicomplexa (Fig. 5 supplémentaire), nous avons examiné un modèle structurel de la région contenant les mutations de résistance à l'aide de trRosetta et AlphaFold37,38. Cette région est située vers l'extrémité C-terminale de la protéine, en aval des 4 segments transmembranaires prédits (Fig. 5A). La comparaison de la structure des protéines à l'aide du serveur DALI a indiqué une homologie structurelle potentielle avec les estérases / lipases, avec une triade catalytique Ser-Asp-His putative située à proximité immédiate du modèle protéique et hautement conservée entre les orthologues (Fig. 5B et Supplémentaire Fig. 5), cependant, d'autres études seront nécessaires pour caractériser toute activité hydrolase potentielle.

Pour valider les mutations sélectionnées par le médicament dans PF3D7_1359900, nous avons généré des lignées modifiées CRISPR-Cas9 en introduisant l'équivalent Dd2 de la mutation G1612V ou D1863Y. De plus, des lignées de parasites témoins ont été générées qui n'ont été modifiées qu'avec les mutations silencieuses correspondantes (G1612sil et D1863sil) et les mutations de bouclier d'ARNg communes à toutes les lignées éditées. Les deux lignées mutantes, mais pas les témoins silencieux, ont affiché le même changement modeste de CI50 vers MMV665794 observé dans les parasites sélectionnés par le médicament (Fig. 5C).

Pour examiner si des mutations dans PF3D7_1359900 étaient apparues dans le contexte d'autres expériences d'évolution in vitro, nous avons examiné la base de données des SNV identifiées par le Malaria Drug Accelerator Consortium dans 262 lignées de P. falciparum sélectionnées avec 37 composés et identifié un seul clone avec une mutation de décalage de cadre au résidu D100 de PF3D7_135990016. Notamment, le clone avait été mis sous pression avec MMV007224, un composé avec un échafaudage de quinoxaline similaire à MMV665794 (Fig. 5D). La présence d'une mutation de décalage de cadre près du début de la protéine (Fig. 6A supplémentaire), ainsi que la mutagenèse dans le dépistage du génome entier de piggyBac31 indiquent que ce gène n'est pas essentiel au stade sanguin asexué.

Nous avons testé si les parasites édités par CRISPR portant les mutations de résistance à MMV665794 pouvaient conférer une résistance croisée à son analogue, MMV007224. Les lignées mutantes G1612V et D1863Y ont toutes deux montré une résistance de bas niveau similaire à MMV007224, comme observé avec MMV665794 (Fig. 5D). De même, la lignée sélectionnée par MMV007224 portant la mutation de décalage de cadre dans PF3D7_1359900 présentait une résistance de bas grade équivalente au MMV665794, mais pas aux composés non apparentés KAE609 et à la chloroquine (Fig. 6B supplémentaire).

Ces résultats suggèrent que la protéine codée par PF3D7_1359900, que nous avons désignée sous le nom de protéine 1 de résistance à la quinoxaline (PfQRP1), peut conférer une résistance générale aux composés de type quinoxaline. Pour déterminer si les mutations de PfQRP1 induisent une résistance plus large contre les composés dotés d'un échafaudage de type quinoxaline, nous avons synthétisé six analogues de MMV665794 (matériel supplémentaire) et acheté cinq autres analogues dans le commerce, évaluant ce panel par rapport au parasite édité par QRP1-D1863Y CRISPR. Tous les analogues de quinoxaline sauf un ont montré une résistance de faible niveau dans la lignée mutante QRP1 significativement différente des témoins, contrairement à BQR695 et KDU69139, les antipaludiques ciblant la phosphatidylinositol 4-kinase devraient avoir un mode d'action non lié aux composés de quinoxaline (Fig. . 7). Nos données suggèrent que PfQRP1 est une protéine précédemment non caractérisée qui confère une résistance de faible qualité aux composés à base de quinoxaline.

La capacité accrue de la lignée Dd2-Polδ à générer une résistance à la fois à KAE609 et à MMV665794 était cohérente avec une augmentation de la diversité génétique disponible pour la sélection. Nous avons déterminé le taux de mutation de Dd2-Polδ sous pression médicamenteuse, en comparant les parasites sélectionnés avec KAE609, MMV665794 et deux sélections de résistance supplémentaires avec les composés irrésistibles non apparentés Salinopostin A et KM15HA40,41. Les SNV de novo des lignées sélectionnées par le médicament ont été déterminées par rapport aux lignées parentales utilisées dans le lot correspondant d'expériences de sélection (Fig. 6A et Fig. 8 supplémentaire). Le changement du taux de mutation dans ces lignées a été comparé à Dd2-WT sans pression, reflétant les facteurs combinés d'une ADN polymérase δ défectueuse et de la pression médicamenteuse. Dd2-Polδ sous pression médicamenteuse a affiché un taux de mutation accru dans les régions codantes de 13 à 28 fois et d'environ 3 à 6 fois dans le génome par rapport à Dd2 de type sauvage sans pression médicamenteuse (Fig. 6B et Tableau 1). Par rapport à Dd2-Polδ non traité par un médicament, ces changements se traduisent par une augmentation d'environ 1, 5 à 3, 5 fois des régions codantes et essentiellement inchangées (~ 0, 8 à 1, 9 fois) à travers le génome. Le rapport Ts: Tv de Dd2-Polδ sous pression médicamenteuse variait et ne montrait pas de tendance perceptible (Fig. 9 supplémentaire).

A Le nombre de SNV dans Dd2-Polδ sélectionnés avec différents composés antipaludéens. Ces sélections, à l'exception de KAE609, n'ont pas donné de parasites résistants avec Dd2-WT. Notez le nombre plus élevé de SNV dans les sélections KAE609 avec Dd2-Polδ par rapport à Dd2-WT (voir le tableau supplémentaire 6). Chaque point représente un clone séquencé, avec le nombre de clones indépendants entre parenthèses : Dd2-WT + KAE609 (2) ; Dd2-Polδ+KAE609 (3); Dd2-Polδ+MMV665794 (6); Dd2-Polδ+SalA (6); Dd2-Polδ+KM15HA (2). Les barres bleues et oranges représentent respectivement l'exome et le génome central, avec les moyennes ± SD indiquées. B Les taux de mutation de Dd2-WT et Dd2-Polδ sous pression médicamenteuse. Chaque point représente un clone séquencé, avec le nombre de clones indépendants sous médicament comme noté pour (A) ci-dessus, et comme suit : Dd2-WT-médicament (12) ; Dd2-Polδ-médicament (11). Les données sont présentées sous forme de moyenne +/- SD (voir le tableau 1 pour les valeurs et les intervalles de confiance à 95 %). Les données des clones H11 Dd2-WT et Dd2-Polδ non traités avec un médicament (voir Fig. 2D) sont incluses à des fins de comparaison. Les données source sont fournies sous la forme d'un fichier de données source.

Le taux de mutation de Dd2-WT sous pression médicamenteuse a également augmenté d'environ 3 fois dans les régions codantes par rapport à Dd2-WT sous pression non médicamenteuse. Cependant, cela était relativement inchangé sur l'ensemble du génome (tableau 1), conformément aux rapports précédents18.

Collectivement, nos données indiquent que la lignée Dd2-Polδ a un taux de mutation accru qui offre un potentiel accru de sélection de parasites résistants aux médicaments, même avec des composés auparavant irrésistibles, tout en étant suffisamment faible pour maintenir l'intégrité du génome et la robustesse du parasite.

Nous proposons que le parasite mutateur Dd2-Polδ P. falciparum est un nouvel outil puissant pour identifier les cibles et les mécanismes de résistance des antipaludiques. La relecture défectueuse résultant de la modification technique de l'ADN polymérase δ entraîne une augmentation du taux de mutation spontanée. En élargissant l'espace des séquences génétiques dans les parasites cultivés, nous révélons une capacité accrue à produire des lignées tolérantes aux médicaments dans le cadre de l'évolution in vitro des régimes de résistance. Nous avons observé que pour les sélections avec un médicament au mode d'action connu, KAE60924, nous obtenions des parasites résistants avec un inoculum 10 à 100 fois inférieur et dans une fenêtre de sélection plus courte en utilisant la lignée Dd2-Polδ. Dans le cas d'un composé irrésistible, la quinoxaline MMV665794, la lignée Dd2-Polδ a donné des parasites modérément résistants là où auparavant les sélections avaient échoué. Une considération potentielle découlant du taux de mutation élevé est la présence d'un plus grand nombre de mutations génétiques non apparentées survenant lors de la sélection de la résistance aux médicaments. Le séquençage d'au moins deux clones de plus d'une sélection indépendante, couplé à la validation de l'édition du génome, sera donc important pour identifier les mutations causales.

L'utilisation d'un test d'accumulation de mutations combiné au séquençage du génome entier nous a permis de déterminer un taux de mutation basé sur les données du génome entier, ne dépendant pas des locus rapporteurs représentatifs42. Nous avons suivi les parasites de type sauvage et Dd2-Polδ pendant 100 jours pour en déduire un taux de mutation. Pour les parasites Dd2-Polδ, ce taux était environ 3 fois plus élevé que Dd2-WT à travers le génome, et jusqu'à 8 fois lors de la comparaison des changements dans l'exome, avec la mise en garde que le taux de mutation pour l'exome de type sauvage peut être sous-représentés car 7 des 13 clones Dd2 parentaux n'ont acquis aucun SNV au cours de la période de l'expérience. Ainsi, Dd2-Polδ nécessite un plus petit nombre de parasites pour qu'une mutation se produise dans son génome haploïde que Dd2-WT (parasites 5.08E7 contre 1.63E8 ; données supplémentaires 2).

En présence de composés antipaludéens, le taux de mutation à travers l'exome était 1,5 à 3,5 fois plus élevé dans la lignée Dd2-Polδ par rapport à la lignée non traitée. Bien qu'une explication puisse être le stress mutagène potentiel des traitements eux-mêmes, le taux de mutation sur l'ensemble du génome n'a été que légèrement augmenté (0,8 à 1,9 fois) par rapport aux lignées non traitées, conformément à une étude précédente qui a trouvé moins de Triplement du taux de mutation sous sélection par atovaquone18. Cette augmentation apparente au sein de l'exome peut donc refléter la sélection positive de mutations fonctionnelles qui ont un impact sur la capacité à survivre à la pression médicamenteuse ou à maintenir la forme physique en soutenant les mutations de résistance primaire. Alternativement, les clones qui accumulent un plus grand nombre de mutations de voisinage peuvent être sélectionnés en l'absence de pression médicamenteuse, mais surpasseraient les clones avec un fardeau de mutation inférieur s'ils possèdent une résistance fortuite SNV.

Le phénotype mutateur doux de Dd2-Polδ peut être avantageux à deux égards, en ne créant pas trop de mutations sous sélection pour permettre l'identification des mutations causales probables, et en maintenant l'aptitude malgré la génération potentielle de mutations nuisibles. En comparaison avec Dd2-WT, la lignée Dd2-Polδ n'a montré qu'une perte mineure de fitness et nous n'avons pas observé de réversion des mutations D308A / E310A modifiées dans l'ADN polymérase après une culture à long terme. En revanche, le mutant équivalent de l'ADN polymérase δ chez P. berghei a montré une réduction significative de la forme physique et la présence d'une mutation antimutatrice de l'ADN polymérase δ a été observée22,23. Le taux de mutation plus élevé du mutant δ de l'ADN polymérase de P. berghei, environ 90 fois supérieur à celui du type sauvage, et potentiellement les conditions de croissance plus strictes in vivo peuvent expliquer le plus grand impact sur la forme physique du parasite chez le parasite du paludisme des rongeurs. Aucune mutation de ces deux résidus sur l'ADN polymérase δ n'a été trouvée dans les isolats cliniques existant dans la base de données Pf6K43.

Les mutations antimutatrices dans les ADN polymérases agissent pour augmenter la fidélité et peuvent elles-mêmes avoir des coûts de remise en forme inhérents (Herr et al., 2011). Nous n'avons observé de mutations antimutatrices connues dans l'ADN polymérase δ dans aucun des clones séquencés de P. falciparum Dd2-Polδ, peut-être le reflet de la pression sélective limitée imposée par l'élévation modérée du taux de mutation. Néanmoins, les trois clones Dd2-Polδ possédaient des SNV dans ou à proximité de gènes qui jouent un rôle dans la réplication et la réparation de l'ADN, bien que l'on ne sache pas si ces mutations confèrent des effets fonctionnels. Le SNV non codant proche de l'antigène nucléaire cellulaire proliférant 2 (PCNA2) dans le clone H11 (Données supplémentaires 1) peut potentiellement moduler l'expression génique de pcna2, l'une des deux protéines PCNA de P. falciparum, pour faciliter une processivité élevée de l'ADN polymérase δ44, 45,46. De plus, le clone Dd2-Polδ E8, qui présentait un taux de mutation plus faible que les deux autres clones (F11 et H11), a un SNV non synonyme (G435E) dans l'ADN polymérase putative thêta (PF3D7_1331100) Gly435, équivalent à Gly226 dans l'ADN polymérase θ humaine qui se trouve dans la région de l'hélicase à boîte DEAD/DEAH. L'ADN polymérase θ possède une activité ADN polymérase et hélicase de faible fidélité et joue un rôle dans la réparation de l'ADN, comme la réparation des cassures double brin par la jonction d'extrémités canoniques non homologues, la jonction d'extrémités médiée par la microhomologie et la recombinaison homologue. La polymérase θ a un impact sur la stabilité du génome et la réparation des cassures formées par les structures quadruplex G446,47.

La capacité de la lignée Dd2-Polδ à provoquer des parasites résistants a été évaluée à l'aide de deux composés, KAE609 (cipagarmin) et MMV665794. KAE609, actuellement en essais cliniques de Phase II, cible l'ATPase de type P PfATP4 qui est responsable du transport de Na+ à travers la membrane plasmique du parasite (Rottmann et al., 2010 ; Spillman et al., 2013). Les trois mutations obtenues à partir de nos sélections se trouvaient dans la région transmembranaire prédite de PfATP4, ce qui correspond à la plupart des mutations observées précédemment (Rottmann 2010 ; Jimenez-Diaz et al., 2014 ; Viadya et al., 2015 ; Lee et Fidock, 2016). Notamment, les sélections avec la lignée Dd2-Polδ ont donné un mutant G358S qui a été récemment observé dans la majorité des échecs de traitement lors d'un essai de phase II de KAE609 (Schmitt et al., 2021), indiquant que l'évolution in vitro avec cette lignée peut donner des résultats avec pertinence clinique. Cette mutation de résistance de haut niveau a également été observée précédemment dans des sélections avec un composé dihydroisoquinolone (+)-SJ733 (Jimenez-Diaz et al., 2014), ainsi qu'en parallèle des sélections KAE609 avec notre lignée Dd2-Polδ par un autre groupe48. Qui et al. a généré une lignée éditée par CRISPR avec le SNV G358S, démontrant que cette mutation est suffisante pour entraîner un changement important de l'IC50 et a montré qu'elle protège l'activité Na + -ATPase de PfATP4 de l'inhibition par KAE609, mais au prix d'une baisse de l'affinité de la protéine en Na+48. Malgré cet effet fonctionnel sur PfATP4, les parasites mutants n'ont pas un fort coût de fitness48. Cela peut expliquer en partie pourquoi nous n'avons observé le mutant G358S que dans les sélections avec la lignée Dd2-Polδ, car il peut supplanter les mutants à croissance plus lente ou moins résistants dans la culture en vrac.

En plus d'obtenir une résistance plus facile avec un nombre de parasites inférieur, le principal potentiel de la lignée Dd2-Polδ est d'accéder à un nouvel espace de séquence pour des composés auparavant irrésistibles. Nous avons défié la lignée Dd2-Polδ avec MMV665794, un composé irrésistible avec un échafaudage chimique quinoxaline et un groupe fonctionnel de type flutamide16,49. Nos sélections avec Dd2-Polδ ont donné un parasite modérément résistant après environ 60 jours, alors que les sélections avec des lignées de type sauvage 3D7 ou Dd2 ont échoué (tableau supplémentaire 4)16.

Le séquençage du génome entier des clones résistants à MMV665794 a révélé des mutations dans PF3D7_1359900 dans les six clones sélectionnés à partir de deux flacons de sélection indépendants. Le gène est prédit comme non essentiel sur la base d'un seul site d'insertion de piggyBac à environ 0,8 kb dans le gène de 7 kb31 ainsi que sur notre observation d'un mutant de décalage de cadre près du début du gène. L'édition CRISPR-Cas9 des mutations G1612V et D1863Y a confirmé leur rôle dans le phénotype de résistance. De plus, ces parasites présentaient une résistance croisée à plusieurs composés de type quinoxaline structurellement apparentés. La protéine codée par PF3D7_1359900, que nous avons appelée protéine de résistance à la quinoxaline 1 (PfQRP1), devrait contenir 4 domaines transmembranaires vers l'extrémité N-terminale et un domaine vers l'extrémité C-terminale dans laquelle se trouvent les mutations de résistance qui partage la conservation avec hydrolases classiques. La nature non essentielle de PfQRP1 suggère que ce n'est pas la cible des composés de quinoxaline mais un mécanisme de résistance. Bien que nous ne sachions pas si les mutations G1612V et D1863Y confèrent une perte de fonction, la présence de la mutation de décalage de cadre dans la lignée sélectionnée par MMV007224 est suggestive. On ne sait pas si QRP1 agit directement sur les composés de quinoxaline, d'une manière apparentée à l'estérase PfPARE qui convertit un promédicament en une forme active50 ou a un effet indirect. Néanmoins, le niveau de résistance suscité est modeste avec seulement une double perte de puissance. Ainsi, la difficulté d'obtenir une résistance au MMV665794, ainsi que le changement limité de puissance, suggèrent que les composés de cette classe chimique pourraient être des candidats antipaludiques prometteurs pour une exploration plus approfondie. Plus généralement, comme des composés plus auparavant "irrésistibles" sont explorés à l'aide de la lignée Dd2-Polδ, il sera intéressant de déterminer si cette approche produit plus fréquemment des mutations dans les gènes de résistance plutôt que des cibles directes. La nature des composés « irrésistibles » peut signifier que la mutation de la cible directe entraîne un parasite non viable, ou le composé peut atteindre plusieurs cibles ou cibles d'origine hôte. Ces possibilités peuvent conduire à des mutations de résistance comme résultat le plus probable.

L'évolution de la résistance in vitro couplée à l'analyse du génome entier s'est avérée être une technique très efficace pour comprendre le mécanisme d'action de nouveaux composés ainsi que pour identifier les marqueurs de la résistance aux médicaments sur le terrain13,51. Une limitation de cette approche a été la difficulté relative d'obtenir une résistance à certaines classes chimiques. En augmentant la complexité génétique des cultures in vitro, la lignée parasitaire Dd2-Polδ développée ici a le potentiel de réduire l'inoculum parasitaire, d'accélérer le temps de sélection et de permettre l'exploration de composés auparavant irrésistibles.

La souche P. falciparum Dd2 a été utilisée pour toutes les manipulations génétiques utilisant CRISPR-Cas9. Pour générer la lignée "mutatrice", les résidus d'acides aminés catalytiques conservés D308 et E310 de la sous-unité catalytique de l'ADN polymérase δ (PF3D7_1017000) ont été mutés en alanine. Deux ARN à guide unique différents (sgRNA) et un modèle de réparation de donneur (longueur de 699 bp, avec une homologie flanquante de 363 bp/289 bp) hébergeant les doubles mutations D308A/E310A avec des mutations bouclier supplémentaires pour empêcher la liaison du complexe sgRNA-Cas9 ont été clonés séquentiellement dans un seul plasmide qui contient SpCas9 et le marqueur sélectionnable hdhfr (voir Fig. 1A)52. Pour introduire les mutations de résistance putatives G1612V et D1863Y dans PF3D7_1359900, deux ARNsg et un modèle de réparation de donneur pour chaque mutation ont été construits comme ci-dessus. Pour G1612V, une matrice de donneur de 746 pb (homologie flanquante de 443 pb/235 pb) a été générée, et pour D1863Y, une matrice de donneur de 671 pb (homologie flanquante de 252 pb/307 pb) a été générée. Les ARN guides ont été synthétisés sous forme d'amorces oligo (IDT). Des matrices de réparation de donneur et des matrices de donneur témoin codant uniquement pour des mutations silencieuses au niveau des sites ciblés ont été synthétisées par GeneArt (Thermo Fisher Scientific). Les 5 'et 3' des matrices d'ADN du donneur étaient flanquées d'une séquence supplémentaire de 20 à 21 pb avec une homologie avec le plasmide de destination pDC2-Cas9-gRNA pour l'insertion aux sites AatII et EcoRI à l'aide de NEBuilder HiFi DNA Assembly52. Les constructions plasmidiques ont été vérifiées par séquençage Sanger. Les sgARN et les amorces de séquençage Sanger sont présentés dans le tableau supplémentaire 5.

Les parasites ont été cultivés dans du milieu complet RPMI 1640 (Gibco) constitué de 0,5 % d'Albumax II (Gibco), 25 mM HEPES (qualité culture), 1x GlutaMAX (Gibco), 25 μg/mL de gentamicine (Gibco) et alimentés en O+ human red les cellules sanguines (GR) obtenues auprès de donneurs sains anonymes des services nationaux de santé du sang et de la transplantation (NHSBT) ou de la Croix-Rouge (Madrid, Espagne). L'utilisation des globules rouges a été effectuée conformément aux directives et réglementations pertinentes, avec l'approbation du comité d'éthique de la recherche du NHS Cambridgeshire et du comité de gestion des matériaux et des données humaines du Wellcome Sanger Institute pour les expériences réalisées au Royaume-Uni. Les globules rouges provenaient de sources éthiques et leur utilisation pour la recherche était conforme aux termes des consentements éclairés dans le cadre d'un protocole approuvé par l'IRB/CE pour les expériences réalisées en Espagne. Les parasites ont été régulièrement maintenus à une parasitémie de 0,5 à 3 % avec un hématocrite de 3 % et ont été cultivés sous gaz paludéen (1 % d'O2, 3 % de CO2 et 96 % de N2). Une étape en anneau synchrone a été obtenue par un traitement à 5 % de sorbitol dans le cycle précédant l'électroporation. Au cycle suivant, le stade de l'anneau (0 à 16 h) à 10 % de parasitémie a été récolté pour l'électroporation. Le plasmide donneur pDC2-Cas9-gRNA a été transfecté dans la lignée Dd2 de P. falciparum à l'aide d'un Gene Pulser Xcell (BioRad). Des plasmides contenant soit sgRNA1 ou sgRNA2 (50 µg) ou un mélange des deux plasmides (100 µg) ont été mélangés avec 150 μl de concentré de globules rouges infectés par un parasite et un cytomix complet (KCl 120 mM, CaCl2 0,2 mM, EGTA 2 mM, 10 mM MgCl2, 25 mM HEPES, 5 mM K2HPO4, 5 mM KH2PO4 ; pH 7,6) pour obtenir un volume total de 420 μl52. Les transfectants ont été sélectionnés dans du milieu complet contenant 5 nM de WR99210 (Jacobus Pharmaceuticals) pendant 8 jours. La culture a ensuite été maintenue dans un milieu complet sans médicament jusqu'à la réapparition des parasites. Une dilution limite a été réalisée pour isoler les parasites clonaux modifiés par des gènes (Fig. 1B). Les transfectants provenant de cultures en vrac et clonales ont été génotypés par PCR allèle spécifique et séquençage Sanger. Les amorces sont présentées dans le tableau supplémentaire 5.

Le test d'accumulation de mutations a été réalisé avec Dd2-WT et trois clones Dd2-Polδ. Les parasites de stade mixte à 1–5% de parasitémie dans 10 ml ont été cultivés en continu pendant 100 jours. Les parasites ont été retirés des cultures continues aux jours 0, 20, 40, 60, 80 et 100 pour l'isolement clonal en limitant la dilution dans des plaques à 96 puits. Un à trois clones de parasites à chaque instant ont été propagés pour l'extraction d'ADN génomique par DNeasy Blood & Tissue Kits (Qiagen) pour le séquençage du génome entier sur un Hiseq X (Illumina).

Le test a été réalisé en mélangeant les parasites test et contrôle à un rapport 1:1 avec 1% de parasitémie chacun. Dd2-GFP, une lignée Dd2 exprimant la protéine fluorescente verte du promoteur ER hsp7032, a été utilisée comme parasite de référence qui a concouru contre Dd2-WT ou Dd2-Polδ dans une plaque à 6 puits. L'hématocrite de la requête et des cultures concurrentes a été déterminé à l'aide du Cellometer Auto 1000 (Nexcelom Bioscience). La parasitémie a été déterminée en colorant les parasites avec MitoTracker Deep Red FM (Invitrogen) et en comptant à l'aide d'un cytomètre en flux CytoFlex S (Beckman Coulter) exécutant le logiciel CytExpert v2.4 et analysée plus avant à l'aide de FlowJo v10, avec comptage et stade du parasite confirmés par examen microscopique après Giemsa coloration (VWR Chemicals). Les globules rouges non infectés ont été utilisés comme fond de signal pour le déclenchement sur le cytomètre en flux. La forme physique compétitive a été déterminée en mesurant la parasitémie totale par coloration MitoTracker Deep Red et la proportion de parasites témoins GFP-positifs sur le cytomètre en flux tous les deux jours pendant 20 jours (environ 10 générations). Les échantillons ont été préparés dans une plaque à fond rond à 96 puits (Costar) en prélevant 4 μL de culture dans 200 μL de tampon phosphate salin (PBS) (Gibco) contenant 100 nM de Mitotracker Deep Red FM. La plaque a été incubée à 37°C pendant 15 min et soumise à une analyse sur le cytomètre en flux. Les portes ont été configurées pour les canaux FITC (gain 5 ou 10) et APC (gain 3 ou 5) pour les signaux GFP et Mitotracker Deep Red FM, respectivement. Une stratégie de déclenchement représentative est illustrée à la Fig. 10 supplémentaire. Deux expériences biologiques indépendantes avec trois répétitions techniques ont été réalisées.

Deux composés ont été utilisés pour l'évolution in vitro de la résistance, KAE609 (cipargamine) et MMV665794, un composé antipaludique identifié dans le Tres Cantos Antimalarial Set et inclus dans la Medicines for Malaria Venture Malaria Box36,49. Pour déterminer l'inoculum minimum pour la résistance (MIR) pour KAE609, trois flacons indépendants contenant des cultures en stade anneau de Dd2-WT et Dd2-Polδ clone H11 ont été testés sur une gamme d'inoculums allant de 2 × 106, 2 × 107, 2 × 108 , et 1 × 109 parasites. Chaque flacon a été cultivé en continu dans un milieu complet contenant 2,5 nM (~ 5 × IC50) de KAE609. Cette concentration était capable de tuer les parasites à un niveau indétectable par microscopie de frottis minces colorés au Giemsa (minimum de 30 champs de 100 globules rouges). La mort et la recrudescence des parasites après le traitement médicamenteux ont été surveillées par coloration au Giemsa de frottis minces, avec un examen microscopique tous les un à deux jours. Les sélections avec MMV665794 ont été effectuées avec Dd2-WT et Dd2-Polδ avec une exposition intermittente au médicament dans trois flacons indépendants (illustrés sur la figure 4A). Les parasites à un inoculum initial de 1 × 109 ont été exposés en continu à 95 nM de MMV665794 (1 × IC50) pendant 20 jours. Ensuite, Dd2-WT a été maintenu dans un milieu complet sans médicament jusqu'au jour 60. Les parasites Dd2-Polδ qui sont réapparus après la sélection ont ensuite été exposés à un doublement de MMV665794 à 190 nM jusqu'au jour 40. La pression médicamenteuse a été supprimée jusqu'à ce que les parasites soient éliminés. détecté, et la concentration a ensuite été augmentée jusqu'à 3 × IC50 et 4 × IC50 avec un inoculum de 4,5 × 108 parasites. Pour toutes les lignées sélectionnées, les clones de parasites ont été isolés par dilution limite et propagés pendant 18 à 25 jours. Les parasites avant la pression médicamenteuse et les parasites survivants après la pression médicamenteuse ont été récoltés pour l'extraction de l'ADN génomique et le séquençage du génome entier.

Des tests de sensibilité aux médicaments ont été effectués dans des plaques à 96 puits en utilisant des parasites synchronisés au stade anneau préparés en utilisant du sorbitol à 5 %. Les parasites au stade annulaire du cycle suivant ont été dilués à 1 % de parasitémie avec 2 % d'hématocrite (concentration finale dans la plaque d'essai) pour effectuer l'essai de concentration inhibitrice de croissance demi-maximale (IC50). La plage de concentration a été préparée par une dilution en série de deux fois du composé dans un milieu complet. Les parasites non traités ou traités avec de l'artésunate 5 μM et des globules rouges uniquement (hématocrite 2%) ont été inclus dans la plaque d'essai en tant que témoins. La croissance des parasites a été déterminée après 72 h d'incubation du médicament en utilisant un tampon de lyse 2x contenant 2 × SYBR Green I (Molecular Probes)53 et une mesure sur un FluorStar Omega v5.11. L'analyse IC50 a été réalisée à l'aide de GraphPad Prism v8/v9 et la signification statistique a été déterminée par des tests Mann-Whitney U bilatéraux. Tous les tests ont été effectués dans trois à six expériences biologiques indépendantes avec deux répétitions techniques chacune.

Les échantillons de parasites ont été lysés dans de la saponine à 0, 1%, lavés avec du PBS 1 × et l'ADN génomique (ADNg) a été extrait à l'aide du kit QIAamp DNA Blood Midi (Qiagen). La concentration d'ADNg a été quantifiée à l'aide du kit de test Qubit dsDNA BR et mesurée avec un fluoromètre Qubit 2.0 (Thermo Fisher Scientific) avant le séquençage. Les échantillons ont été cisaillés en fragments d'environ 450 pb et la bibliothèque a été construite à l'aide du kit de bibliothèque d'ADN NEBNext UltraII (NEB), suivi d'une qPCR pour le regroupement d'échantillons et la normalisation pour la plate-forme de séquençage Illumina. Un séquençage apparié (2 × 150 pb) et un séquençage du génome entier sans PCR ont été réalisés sur un HiSeq X (Illumina)54. Les échantillons sélectionnés pour leur résistance à la salinopostine A et au KMHA15 ont été séquencés sur une plateforme de séquençage Illumina MiSeq ou NextSeq 550, respectivement, pour obtenir des lectures appariées de 300 ou 150 pb à une profondeur de couverture moyenne de 30 ×.

Les séquences génomiques des clones Dd2-Polδ ont été analysées en suivant le flux de travail des meilleures pratiques GATK455. Les lectures de séquençage appariées de chaque clone de parasite ont été alignées sur la séquence de référence P. falciparum 3D7 (PlasmoDB-44_Pfalciparum3D7) et Dd2 (PlasmoDB-44_PfalciparumDd2) à l'aide de bwa mem (bwa/0.7.17 = pl5.22.0_2). Les doublons de PCR ont été supprimés par GATK MarkDuplicates (picard/2.22.2--0) (tableau supplémentaire 6). L'appel de variante a été effectué par GATK HaplotypeCaller (gatk/4.1.4.1). Les SNV devaient passer les critères de filtrage (ReadPosRankSum ≥ −8.0, MQRankSum ≥ −12.5, QD ≥ 20.0, SOR ≥ 3.0, FS ≤ 60.0, MQ ≥ 40.0, GQ ≥ 50.0, DP ≥ 5.0). Les variantes qui avaient des appels hétérozygotes ou étaient situées en dehors du génome central ont été exclues (les coordonnées du génome central Dd2 sont indiquées dans le tableau supplémentaire 1). L'annotation des variantes génétiques et la prédiction de l'effet fonctionnel ont été déterminées à l'aide de snpEff (v4.3t)56. Les sites de début de transcription ont été cartographiés en fonction du récent ensemble de données raffinées57

Le nombre de SNV de novo survenant au cours du test d'accumulation de mutations a été identifié en utilisant le génome de Dd2-WT et Dd2-Polδ collecté au jour 0 pour soustraction dans chaque lignée de parasites. Pour la condition de pression médicamenteuse, les SNV de novo ont été identifiés en utilisant le génome de la lignée parentale qui n'a pas été exposée à la pression médicamenteuse pour la soustraction. Le changement significatif des nombres de SNV dans Dd2-WT et Dd2-Polδ dans l'état sans médicament a été déterminé par des tests de rang signé Wilcoxon à paires appariées bilatérales (GraphPad Prism v8 / v9).

Les CNV ont été détectés par le workflow GATK 458 adapté pour P. falciparum59. En bref, les comptages de lecture ont été collectés dans les régions codant pour les gènes du génome central de P. falciparum60 et les rapports de copie log2 débruités ont été calculés par rapport à un panel de normaux construits à partir d'échantillons Dd2 non sélectionnés par des médicaments. Les CNV ont été retenus si au moins 4 gènes séquentiels présentaient un rapport de copie log2 débruité supérieur ou égal à 0,5 (augmentation du nombre de copies) ou inférieur ou égal à -0,5 (diminution du nombre de copies).

Le taux de mutation (µ) de chaque lignée parasitaire a été déterminé par le nombre moyen de variants nucléotidiques simples de novo (S) de tous les clones (C) qui se sont produits pendant la culture continue du parasite et qui différaient de la lignée parasitaire au jour 0. La durée des cycles de vie érythrocytaires (L) et la taille du génome (G) ont été calculés comme indiqué ci-dessous20,21. Un seul cycle de stade sanguin asexué pour Dd2 a été calculé à 44,1 h20. Les tailles du génome central Dd2 et de la région codante ont été fixées à 20 789 542 bp et 11 553 554 bp, respectivement (Données supplémentaires 2). Le test de normalité de Shapiro-wilk a été utilisé pour examiner les ensembles de données SNV pour la distribution normale. Un test t d'échantillon a été utilisé pour examiner les échantillons moyens et les intervalles de confiance à 95 % (données supplémentaires 2). Tous les tests ont été exécutés par programmation R (v4.1.3) et les données rassemblées dans Microsoft Excel (v16).

Les structures protéiques de PfATP4 (PF3D7_1211900) et PfQRP1 (PF3D7_1359900) ont été modélisées par AlphaFold37 et des comparaisons effectuées à l'aide du serveur DALI61. Les structures ont été affichées à l'aide du système graphique moléculaire PYMOL.

De plus amples informations sur la conception de la recherche sont disponibles dans le résumé des rapports sur le portefeuille Nature lié à cet article.

Les données sous-jacentes à cet article sont disponibles dans les fichiers de données supplémentaires et sources. Toutes les données de séquence associées sont disponibles au NCBI Sequence Read Archive sous le code d'accession ERP110649 (BioProject : PRJEB28444). Noms de bibliothèque DN581642P : A7, D7, E7 et DN573783H : A5-12, B5-B12, C5-C12, D5-D8, D10-D12, E5-E12, F5-F12, G6-G7, G9-G12, H4- H12. Les génomes de référence pour Dd2 et 3D7 et les données d'annotation des gènes sont disponibles sur PlasmoDB (Dd2 sur https://plasmodb.org/common/downloads/release-44/PfalciparumDd2/ ; 3D7 sur https://plasmodb.org/common/downloads/ release-44/Pfalciparum3D7/). Les données sources sont fournies avec ce document.

Dondorp, AM et al. Résistance à l'artémisinine dans le paludisme à Plasmodium falciparum. N. Engl. J. Med. 361, 455–467 (2009).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Amato, R. et al. Marqueurs génétiques associés à l'échec de la dihydroartémisinine-pipéraquine dans le paludisme à Plasmodium falciparum au Cambodge : une étude d'association génotype-phénotype. Lancette infectée. Dis. 17, 164-173 (2017).

Article CAS PubMed Google Scholar

Uwimana, A. et al. Association des génotypes de Plasmodium falciparum kelch13 R561H avec une clairance parasitaire retardée au Rwanda : une étude ouverte, à un seul bras, multicentrique, d'efficacité thérapeutique. Lancette infectée. Dis. 21, 1120-1128 (2021).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Balikagala, B. et al. Preuve du paludisme résistant à l'artémisinine en Afrique. N. Engl. J. Med. 385, 1163-1171 (2021).

Article CAS PubMed Google Scholar

Tse, EG, Korsik, M. & Todd, MH Le passé, le présent et l'avenir des médicaments antipaludiques. Malar. J. 18, 93 (2019).

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Yuthavong, Y. et al. La dihydrofolate réductase du paludisme comme paradigme pour le développement de médicaments contre une cible à résistance compromise. Proc. Natl Acad. Sci. États-Unis 109, 16823–16828 (2012).

Article ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Yoo, E. et al. Définir les déterminants de la spécificité des inhibiteurs du protéasome de Plasmodium. Confiture. Chim. Soc. 140, 11424–11437 (2018).

Article MathSciNet CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Duffey, M. et al. Évaluation des risques de résistance de Plasmodium falciparum pour sélectionner les antipaludiques de nouvelle génération. Tendances Parasitol. 37, 709–721 (2021).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kumpornsin, K., Kochakarn, T. & Chookajorn, T. Le résistome et la reconnaissance génomique à l'ère de l'élimination du paludisme. Dis. Modèle mécanique. 12, dmm040717 (2019).

Article PubMed Central Google Scholar

Neafsey, DE, Taylor, AR & MacInnis, BL Progrès et opportunités dans la génomique des populations du paludisme. Nat. Rév.Genet 22, 502–517 (2021).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Cowell, AN et al. Cartographie du génome médicamenteux du parasite du paludisme en utilisant l'évolution in vitro et la chimiogénomique. Sciences 359, 191-199 (2018).

Article ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Ding, XC, Ubben, D. & Wells, TN Un cadre pour évaluer le risque de résistance aux antipaludéens en cours de développement. Malar. J. 11, 292 (2012).

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Luth, MR, Gupta, P., Ottilie, S. & Winzeler, EA Utilisation de l'évolution in vitro et de l'analyse du génome entier pour découvrir des cibles de nouvelle génération pour la découverte de médicaments antipaludiques. ACS Infect. Dis. 4, 301–314 (2018).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Ng, CL & Fidock, DA Plasmodium falciparum sélections in vitro de résistance aux médicaments et édition de gènes. Méthodes Mol. Biol. 2013, 123-140 (2019).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Nzila, A. & Mwai, L. Sélection in vitro de lignées de parasites résistants aux médicaments Plasmodium falciparum. J. Antimicrobe. Chimimère. 65, 390-398 (2010).

Article CAS PubMed Google Scholar

Corey, VC et al. Une large analyse du développement de la résistance chez le parasite du paludisme. Nat. Commun. 7, 11901 (2016).

Article ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Yang, T. et al. MalDA, accélérant la découverte de médicaments contre le paludisme. Tendances Parasitol. 37, 493-507 (2021).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Bopp, SE et al. L'évolution mitotique de Plasmodium falciparum montre un génome central stable mais une recombinaison dans les familles d'antigènes. PLoS Genet 9, e1003293 (2013).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

McDew-White, M. et al. Mode et rythme du changement de longueur des microsatellites dans une expérience d'accumulation de mutations du parasite du paludisme. Génome Biol. Évol. 11, 1971-1985 (2019).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Claessens, A. et al. Génération de diversité antigénique chez Plasmodium falciparum par réarrangement structuré des gènes Var au cours de la mitose. PLoS Genet 10, e1004812 (2014).

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Hamilton, WL et al. Biais de mutation extrême et teneur élevée en AT chez Plasmodium falciparum. Nucleic Acids Res 45, 1889-1901 (2017).

CAS PubMed Google Scholar

Honma, H. et al. Tendance à la mutation du mutateur Plasmodium berghei avec une ADN polymérase delta déficiente en relecture. Sci. Rep. 6, 36971 (2016).

Article ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Honma, H. et al. Génération de parasites du paludisme chez les rongeurs avec un taux de mutation élevé en détruisant l'activité de relecture de l'ADN polymérase delta. ADN Res 21, 439–446 (2014).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Rottmann, M. et al. Spiroindolones, une classe de composés puissants pour le traitement du paludisme. Sciences 329, 1175-1180 (2010).

Article ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Lee, AH & Fidock, DA Preuve d'un phénotype mutateur léger chez les parasites cambodgiens du paludisme à plasmodium falciparum. PLoS One 11, e0154166 (2016).

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Simon, M., Giot, L. et Faye, G. L'activité exonucléase 3 'à 5' située dans la sous-unité delta de l'ADN polymérase de Saccharomyces cerevisiae est nécessaire pour une réplication précise. EMBO J. 10, 2165-2170 (1991).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Swan, MK, Johnson, RE, Prakash, L., Prakash, S. & Aggarwal, AK Base structurelle de la synthèse d'ADN haute fidélité par l'ADN polymérase delta de levure. Nat. Structure. Mol. Biol. 16, 979–986 (2009).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Byrnes, JJ, Downey, KM, Black, VL & So, AG Une nouvelle ADN polymérase de mammifère avec une activité exonucléase 3' à 5' : l'ADN polymérase delta. Biochimie 15, 2817–2823 (1976).

Article CAS PubMed Google Scholar

Bebenek, A. & Ziuzia-Graczyk, I. Fidélité de la réplication de l'ADN - une question de relecture. Courant. Genet 64, 985–996 (2018).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kunkel, TA Vues évolutives de la (in)fidélité de la réplication de l'ADN. Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 74, 91-101 (2009).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Zhang, M. et al. Découverte des gènes essentiels du parasite du paludisme humain Plasmodium falciparum par mutagenèse à saturation. Sciences 360, eaap7847 (2018).

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Baragana, B. et al. Un nouvel agent antipaludique en plusieurs étapes qui inhibe la synthèse des protéines. Nature 522, 315-320 (2015).

Article ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Spillman, NJ & Kirk, K. Le cation parasite du paludisme ATPase PfATP4 et son rôle dans le mécanisme d'action d'un nouvel arsenal de médicaments antipaludiques. Int J. Parasitol. Médicaments Drug Resist 5, 149–162 (2015).

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Jiménez-Diaz, MB et al. (+)-SJ733, un candidat clinique pour le paludisme qui agit via l'ATP4 pour induire une clairance rapide de Plasmodium médiée par l'hôte. Proc. Natl Acad. Sci. États-Unis 111, E5455–E5462 (2014).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Okombo, J., Kanai, M., Deni, I. & Fidock, DA Approches génomiques et génétiques pour étudier la résistance aux médicaments antipaludiques et la biologie du plasmodium. Tendances Parasitol. 37, 476–492 (2021).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Gamo, FJ et al. Des milliers de points de départ chimiques pour l'identification des pistes antipaludiques. Nature 465, 305–310 (2010).

Article ADS CAS PubMed Google Scholar

Jumper, J. et al. Prédiction très précise de la structure des protéines avec AlphaFold. Nature 596, 583–589 (2021).

Article ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Yang, J. et al. Amélioration de la prédiction de la structure des protéines à l'aide des orientations inter-résidus prédites. Proc. Natl Acad. Sci. États-Unis 117, 1496-1503 (2020).

Article ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Meister, S. et al. Imagerie des stades hépatiques de Plasmodium pour favoriser la découverte de médicaments antipaludiques de nouvelle génération. Sciences 334, 1372-1377 (2011).

Article ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Yoo, E. et al. Le produit naturel antipaludéen salinipostine A identifie les hydrolases alpha/bêta sérine essentielles impliquées dans le métabolisme des lipides chez les parasites P. falciparum. Chimie cellulaire. Biol. 27, 143–157 et 145 (2020).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Knaab, TC et al. 3-Hydroxy-propanamidines, une nouvelle classe d'antipaludiques actifs par voie orale ciblant Plasmodium falciparum. J. Med Chem. 64, 3035–3047 (2021).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Katju, V. & Bergthorsson, U. Vieux métier, nouvelles astuces : aperçu du processus de mutation spontanée à partir du partenariat d'expériences classiques d'accumulation de mutations avec des approches génomiques à haut débit. Génome Biol. Évol. 11, 136-165 (2019).

Article CAS PubMed Google Scholar

Malaria Gen et al. Un ensemble de données ouvert sur la variation du génome de Plasmodium falciparum dans 7 000 échantillons mondiaux. Bienvenue Open Res. 6, 42 (2021).

Article PubMed Central Google Scholar

Cai, J. et al. Reconstitution du facteur C de réplication humain à partir de ses cinq sous-unités dans des cellules d'insectes infectées par des baculovirus. Proc. Natl Acad. Sci. États-Unis 93, 12896–12901 (1996).

Article ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Uhlmann, F. et al. Reconstitution in vitro du facteur C de réplication humain à partir de ses cinq sous-unités. Proc. Natl Acad. Sci. États-Unis 93, 6521–6526 (1996).

Article ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Sheriff, O. et al. La sous-unité 1 du facteur de réplication C de Plasmodium falciparum est impliquée dans la réponse au stress génotoxique. Microbiol cellulaire. 23, e13277 (2021).

Article CAS PubMed Google Scholar

Beagan, K. & McVey, M. Lier la structure et la fonction de l'ADN polymérase thêta dans la santé et la maladie. Cellule Mol. Vie Sci. 73, 603–615 (2016).

Article CAS PubMed Google Scholar

Qiu, D. et al. Une mutation G358S dans la pompe Na(+) de Plasmodium falciparum PfATP4 confère une résistance cliniquement pertinente à la cipargamine. Nat. Commun. 13, 5746 (2022).

Article ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Van Voorhis, WC et al. Découverte de médicaments open source avec la collection de composés antipaludiques pour les maladies négligées et au-delà. PLoS Pathog. 12, e1005763 (2016).

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Istvan, ES et al. La mutation de l'estérase est un mécanisme de résistance aux composés antipaludiques. Nat. Commun. 8, 14240 (2017).

Article ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Ariey, F. et al. Un marqueur moléculaire du paludisme à Plasmodium falciparum résistant à l'artémisinine. Nature 505, 50–55 (2014).

Article ADS PubMed Google Scholar

Adjalley, S. & Lee, édition MCS CRISPR/Cas9 du génome de Plasmodium falciparum. Méthodes Mol. Biol. 2470, 221–239 (2022).

Article CAS PubMed Google Scholar

Smilkstein, M., Sriwilaijaroen, N., Kelly, JX, Wilairat, P. & Riscoe, M. Technique simple et peu coûteuse basée sur la fluorescence pour le dépistage à haut débit des médicaments antipaludiques. Antimicrobien. Agents Chemother. 48, 1803–1806 (2004).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kozarewa, I. et al. La préparation de la bibliothèque de séquençage Illumina sans amplification facilite l'amélioration de la cartographie et de l'assemblage des génomes biaisés (G+C). Nat. Méthodes 6, 291–295 (2009).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

DePristo, MA et al. Un cadre pour la découverte de variations et le génotypage à l'aide de données de séquençage d'ADN de nouvelle génération. Nat. Genet 43, 491–498 (2011).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Cingolani, P. et al. Un programme pour annoter et prédire les effets des polymorphismes mononucléotidiques, SnpEff : SNP dans le génome de la souche w1118 de Drosophila melanogaster ; iso-2; iso-3. Voler. (Austin) 6, 80–92 (2012).

Article CAS PubMed Google Scholar

Chappell, L. et al. Affinage du transcriptome du parasite du paludisme humain Plasmodium falciparum à l'aide d'ARN-seq sans amplification. BMC Genomics 21, 395 (2020).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

McKenna, A. et al. La boîte à outils d'analyse du génome : un cadre mapreduce pour l'analyse des données de séquençage d'ADN de nouvelle génération. Génome Res. 20, 1297-1303 (2010).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Summers, RL et al. La chimiogénomique identifie l'acétyl-coenzyme A synthétase comme cible pour le traitement et la prévention du paludisme. Chimie cellulaire. Biol. 29, 191-201 et 198 (2022).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Miles, A. et al. Les indels, la variation structurelle et la recombinaison entraînent la diversité génomique chez Plasmodium falciparum. Génome Res. 26, 1288-1299 (2016).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Holm, L., Kaariainen, S., Rosenstrom, P. & Schenkel, A. Recherche de bases de données sur la structure des protéines avec DaliLite v.3. Bioinformatique 24, 2780–2781 (2008).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Télécharger les références

Nous tenons à remercier les membres actuels et anciens du laboratoire Lee pour leurs commentaires constructifs. Nous sommes reconnaissants à Liz Huckle et au personnel de Sanger Scientific Operations pour leur soutien au séquençage. Nous remercions Kotanan N. pour les illustrations. Nous tenons à souligner le financement de la Fondation Bill et Melinda Gates à MCSL, DAF, GSK et EAW (OPP1054480) et à DAF (INV-033538), le financement du Wellcome Institutional Translational Partnership award (ITPA) et l'Université de Mahidol pour TK et TC, et financement de Wellcome [206194/Z/17/Z] au MCSL et au Wellcome Sanger Institute.

Wellcome Sanger Institute, Wellcome Genome Campus, Hinxton, Royaume-Uni

Krittikorn Kümpornsin, Johanna Hoshizaki, Mukul Rawat, Richard D. Pearson & Marcus CS Lee

Calibr, Division du Scripps Research Institute, La Jolla, Californie, États-Unis

Krittikorn Kümpornsin

Laboratoire de médecine moléculaire des infections Suède et Département de biologie moléculaire, Université d'Umeå, Umeå, Suède

Theerarat Kochakarn & Thanat Chookajorn

Département de microbiologie et d'immunologie, Columbia University Irving Medical Center, New York, NY, États-Unis

Thomas Yeo, John Okombo, Kyra A. Schindler, Sachel Mok et David A. Fidock

Département de pédiatrie, École de médecine, Université de Californie, San Diego, La Jolla, Californie, États-Unis

Madeline R. Luth et Elizabeth A. Winzeler

Center for Malaria Therapeutics and Antimicrobial Resistance, Division of Infectious Diseases, Department of Medicine, Columbia University Irving Medical Center, New York, NY, États-Unis

Sachel Mok, Anne-Catrin Uhlemann & David A. Fidock

Division des maladies infectieuses, Département de médecine, Columbia University Irving Medical Center, New York, NY, États-Unis

Heekuk Park & Anne-Catrin Uhlemann

TCG Lifesciences Private Limited, complexe électronique Salt-lake, Kolkata, Inde

Gouranga P. Jana & Bikash C. Maity

Medicines for Malaria Venture, Centre international Cointrin, Genève, Suisse

Benoît Laleu, Elodie Chenu & James Duffy

Recherche et développement sur les médicaments de santé mondiale, GlaxoSmithKline, Tres Cantos, Madrid, Espagne

Sonia Moliner Cubel, Virginia Franco, Maria G. Gomez-Lorenzo & Francisco Javier Gamo

Unité de génomique et de médecine évolutive, Centre d'excellence en recherche sur le paludisme, Faculté de médecine tropicale, Université Mahidol, Bangkok, Thaïlande

Thanat Chookajorn

Chimie biologique et découverte de médicaments, Wellcome Centre for Anti-Infectives Research, Université de Dundee, Dundee, Royaume-Uni

Marcus CS Lee

Vous pouvez également rechercher cet auteur dans PubMed Google Scholar

KK et MCSL ont conçu l'étude. KK a généré les lignées parasitaires Dd2-Polδ et réalisé les expériences d'accumulation de mutations. KK et MR ont effectué des transfections parasitaires. KK, KAS, SMC, VF et MGG ont réalisé les expériences de sélection de médicaments in vitro. Des tests de sensibilité aux médicaments et de résistance croisée ont été effectués par KK, JO, MR, KAS et MCSLHP et ACU ont contribué à la génération de données de séquençage du génome entier. GPJ, BCM, BL, EC et JD ont contribué à la synthèse des composés. Les données de séquençage du génome entier ont été analysées par KK, TK, TY, MRL, JH, RP et SMKK, FJG, EAW, DAF, TC et MCSL ont conceptualisé et planifié les expériences et supervisé l'étude. Tous les auteurs ont contribué à la rédaction de l'article.

Correspondance à Marcus CS Lee.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Nature Communications remercie Shiroh Iwanaga, Toshihiro Mita et les autres évaluateurs anonymes pour leur contribution à l'évaluation par les pairs de ce travail. Un dossier d'examen par les pairs est disponible.

Note de l'éditeur Springer Nature reste neutre en ce qui concerne les revendications juridictionnelles dans les cartes publiées et les affiliations institutionnelles.

Libre accès Cet article est sous licence Creative Commons Attribution 4.0 International License, qui permet l'utilisation, le partage, l'adaptation, la distribution et la reproduction sur n'importe quel support ou format, tant que vous donnez le crédit approprié à l'auteur ou aux auteurs originaux et à la source, fournissez un lien vers la licence Creative Commons et indiquez si des modifications ont été apportées. Les images ou tout autre matériel tiers dans cet article sont inclus dans la licence Creative Commons de l'article, sauf indication contraire dans une ligne de crédit au matériel. Si le matériel n'est pas inclus dans la licence Creative Commons de l'article et que votre utilisation prévue n'est pas autorisée par la réglementation légale ou dépasse l'utilisation autorisée, vous devrez obtenir l'autorisation directement du détenteur des droits d'auteur. Pour voir une copie de cette licence, visitez http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Réimpressions et autorisations

Kümpornsin, K., Kochakarn, T., Yeo, T. et al. Génération d'un parasite mutateur pour conduire la découverte de résistomes chez Plasmodium falciparum. Nat Commun 14, 3059 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-38774-1

Télécharger la citation

Reçu : 23 août 2022

Accepté : 12 mai 2023

Publié: 27 mai 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s41467-023-38774-1

Toute personne avec qui vous partagez le lien suivant pourra lire ce contenu :

Désolé, aucun lien partageable n'est actuellement disponible pour cet article.

Fourni par l'initiative de partage de contenu Springer Nature SharedIt

En soumettant un commentaire, vous acceptez de respecter nos conditions d'utilisation et nos directives communautaires. Si vous trouvez quelque chose d'abusif ou qui ne respecte pas nos conditions ou directives, veuillez le signaler comme inapproprié.