Une mauvaise absorption des acides aminés entraîne un déséquilibre métabolique global des biofilms de Candida albicans

npj Biofilms et Microbiomes volume 8, Numéro d'article : 78 (2022) Citer cet article

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La maturation du biofilm de Candida albicans s'accompagne d'une expression accrue des gènes d'acquisition d'acides aminés. Trois techniques omiques de pointe ont été appliquées pour détailler l'importance de l'absorption active des acides aminés pendant le développement du biofilm. Des analyses comparatives de biofilms normoxiques de type sauvage ont été réalisées dans trois conditions métaboliquement difficiles : vieillissement, hypoxie et absorption d'acides aminés désactivée à l'aide d'une souche dépourvue du régulateur des perméases d'acides aminés Stp2. Acquisition d'acides aminés induite par le vieillissement et réponses au stress pour résister à un environnement de plus en plus restreint. L'hypoxie a paralysé le métabolisme énergétique global avec une consommation retardée d'acides aminés, mais après une adaptation prolongée, les empreintes métaboliques se sont alignées sur les biofilms normoxiques âgés. Le métabolome extracellulaire des biofilms stp2Δ a révélé une absorption déficiente de 11 acides aminés, entraînant des modifications transcriptionnelles et métaboliques importantes, notamment l'induction de la biosynthèse des acides aminés et l'absorption des glucides et des micronutriments. Dans l'ensemble, cette étude souligne l'importance cruciale d'une homéostasie équilibrée des acides aminés pour le développement du biofilm de C. albicans.

L'incidence des infections nosocomiales associées aux dispositifs est en augmentation en raison de l'utilisation croissante des implants médicaux, en particulier chez les patients dont les défenses immunitaires sont affaiblies. Ces infections sont principalement associées à la formation de biofilms, et Candida albicans en est un excellent exemple1. Ce champignon pathogène se classe régulièrement parmi les principales causes d'infections associées aux cathéters2,3, qui sont difficiles à traiter en raison de la résistance élevée associée au biofilm à la thérapie antifongique conventionnelle4.

Un circuit de neuf facteurs de transcription principaux et de 50 facteurs de transcription auxiliaires contrôle l'intégrité structurelle (adhérence, filamentation), la résistance aux médicaments et au stress et le métabolisme pendant la formation du biofilm de C. albicans5,6. Parmi les régulateurs métaboliques figurent des facteurs jouant un rôle primordial dans le métabolisme du glucose et des acides aminés, tels que Gal4, Tye7 (contrôle de la glycolyse7) et Arg81, Gcn4, Stp2 et Leu3 (contrôle de l'utilisation et de la biosynthèse des acides aminés6,8,9), pointant vers l'importance du métabolisme dans la croissance du biofilm. En effet, les biofilms de C. albicans présentent des caractéristiques transcriptionnelles et métaboliques caractéristiques par rapport aux cultures planctoniques. Ainsi, la maturation du biofilm s'accompagne d'une expression génique accrue et d'une plus grande abondance de métabolites concernant la glycolyse et la réduction du cycle du TCA et des métabolites respiratoires10,11. Ces profils métaboliques ressemblent à une réponse de privation d'oxygène, indiquant le développement de niches hypoxiques au sein du biofilm10,11,12. De plus, la croissance robuste du biofilm est associée à une capacité accrue à métaboliser certains acides aminés au lieu des glucides enchaînés13. En effet, plusieurs gènes de perméases d'acides aminés comme CAN2 sont parmi les transcrits les plus induits lors de la croissance du biofilm5,14,15,16. Dans une étude récente, nous avons décrit le rôle important du régulateur transcriptionnel des perméases d'acides aminés, Stp2, dans l'adhérence et la maturation du biofilm17. Les biofilms de type sauvage entièrement formés avaient une proportion accrue de cellules endommagées ou lysées par rapport aux biofilms stp2Δ à biomasse égale, ce qui suggère qu'un métabolisme réduit des acides aminés favorise la longévité du biofilm en raison de la restriction calorique. Ces données soulignent que l'absorption active d'acides aminés est nécessaire pour la formation de biofilm de C. albicans, mais comment ce processus contribue à la maturation du biofilm et comment les cellules du biofilm se comportent sous une importation restreinte d'acides aminés reste inconnue. Nous émettons l'hypothèse que la détection des nutriments et en particulier l'homéostasie des acides aminés jouent un rôle important pour assurer un approvisionnement énergétique adéquat pour la croissance du biofilm15,18,19,20.

Notre présent travail aborde les questions clés de la façon dont l'acquisition et le métabolisme des acides aminés contribuent à la formation du biofilm et comment cette homéostasie nutritionnelle est équilibrée. Nous avons appliqué une approche multi-omique intégrative pour étudier les processus métaboliques accompagnant la maturation du biofilm sous limitation d'oxygène ou d'acides aminés (stp2Δ) afin d'obtenir une image complète des stratégies d'adaptation au stress dans la croissance du biofilm. Notre analyse omique a révélé que les cellules du biofilm sont exposées à des conditions de plus en plus stressantes, ce qui rend plus essentielles l'acquisition de nutriments alternatifs et l'adaptation à la limitation de l'oxygène. Les biofilms matures de type sauvage sont utilisés comme source d'énergie des acides aminés libérés des cellules lysées ou des polypeptides extracellulaires par la sécrétion de protéases et de gènes de perméase régulés à la hausse pour faciliter une absorption suffisante. Les biofilms développés par l'hypoxie ont nécessité une adaptation métabolique prolongée par rapport à leurs homologues normoxiques, ce qui a entraîné une absorption altérée des nutriments, une activation de la glycolyse et de l'expression des gènes du cycle TCA et une altération globale de la production d'énergie. Des réponses transcriptionnelles similaires ont été observées dans des biofilms normoxiques âgés. L'absorption médiée par Stp2 a été attribuée à un ensemble défini d'acides aminés. Outre l'utilisation altérée des acides aminés, les biofilms mutants stp2Δ ont montré des changements dans l'absorption des glucides, le métabolisme de l'azote et l'acquisition des macro et micronutriments, démontrant une restructuration métabolique de grande envergure pour maintenir l'homéostasie des acides aminés, ce qui est essentiel pour le maintien du biofilm de C. albicans.

Pour étudier les processus métaboliques et régulateurs sous-jacents de la maturation et du vieillissement des biofilms, des biofilms de C. albicans ont été échantillonnés à 8, 24 et 48 h et analysés pour le transcriptome, le métabolome intracellulaire et extracellulaire et le profil du protéome sécrété. Les biofilms ont été cultivés dans du RPMI, un milieu de type hôte largement utilisé qui est particulièrement adapté aux analyses métabolomiques en raison de sa formulation définie.

L'analyse transcriptionnelle a comparé des biofilms âgés (24 et 48 h) à des biofilms plus jeunes (8 h) et a révélé que l'expression des gènes diminue de manière significative avec le temps pour de nombreux processus métaboliques et autres processus cellulaires (Fig. 1). Les processus régulés à la baisse comprenaient le métabolisme des glucides, des purines, des acides aminés et de l'énergie, indiquant une population accrue de cellules métaboliquement inactives. Outre le métabolisme, les gènes du cycle et de la division cellulaires, la réplication de l'ADN, l'organisation du cytosquelette et la croissance filamenteuse ont été réprimés de manière transcriptionnelle au cours du vieillissement du biofilm, suggérant une prolifération ralentie, voire arrêtée. En effet, les biofilms de 48 h avaient des gènes de réponse au stress significativement régulés, indiquant des conditions de plus en plus restreintes. Les gènes codant pour les transporteurs de nutriments figuraient parmi les rares termes régulés à la hausse dans les biofilms plus anciens, ce qui démontre la demande croissante d'acquérir les nutriments disponibles.

Les gènes régulés de manière différentielle (log2FC ± 1 ; p < 0,05) dans les biofilms tardifs ont été comparés à des points temporels antérieurs (24 vs. 8 h ; 48 vs. 8 h ; 48 vs. 24 h) et les termes GO pour les processus moléculaires ont chacun été résumés à l'aide REVIGO avec un seuil de dispensabilité de 0,5. Les processus liés au métabolisme ont été séparés des autres. Les termes réglementés à la hausse sont affichés en vert et les termes réglementés à la baisse sont en rouge. Les données source sont fournies sous la forme d'un fichier de données source.

Comme la maturation du biofilm a considérablement modifié l'expression génique des gènes liés au métabolisme, nous avons étudié le métabolome global au cours du temps avec une approche non ciblée. Dans l'ensemble, nous avons pu détecter 547 métabolites intracellulaires et 270 métabolites dans le milieu biofilm. Des analyses comparatives de différents moments de formation de biofilm ont montré un pic d'acides aminés et d'intermédiaires lipidiques à 24 h (Fig. 2a). Notamment, les composés contenant de l'azote tels que les acides aminés et les nucléotides ont été fortement réduits dans les biofilms de 48 h, ce qui reflète la famine progressive et l'état dormant des cellules matures du biofilm. La composition du milieu de biofilm usé a fourni des informations sur l'absorption des nutriments et l'excrétion des produits finaux cellulaires. Les métabolites extracellulaires peuvent provenir des composants résiduels du milieu de culture, des lysats de cellules mortes ou des substrats activement excrétés. Le métabolome extracellulaire était fortement enrichi dans toutes les classes de métabolites à des stades ultérieurs, un résultat qui est en corrélation avec l'accumulation progressive de cellules mortes au cours du vieillissement du biofilm (Fig. 2b). L'enrichissement en composés d'acides aminés extracellulaires à 48 h était principalement dû à la libération de dérivés d'acides aminés acétylés, de polyamines et d'acides aminés sulfonés (fichier de données supplémentaire 2). Cette dernière classe comprend les intermédiaires du métabolisme de la cystéine et de la taurine qui ont été appauvris au niveau intracellulaire tout en étant enrichis dans la fraction extracellulaire, ce qui implique une exportation dirigée. Comme les protéines et l'ADN extracellulaire sont des composants majeurs de la matrice du biofilm extracellulaire (ECM)21, l'augmentation observée des acides aminés et des nucléotides pourrait provenir en partie de la production de la matrice. Un composant glucidique central de l'ECM de C. albicans est le β-1,3-glucane, mais nous n'avons pas pu détecter ce polymère. Le glucide le plus extracellulairement enrichi pendant la maturation du biofilm était le tréhalose.

Les métabolites différentiellement abondants de chaque famille de métabolites ont été comptés et tracés sous forme de carte thermique. L'étendue des changements métaboliques est codée par couleur avec des remplissages plus foncés pour les changements plus importants. La barre d'échelle indique le nombre de métabolites au sein d'une famille de métabolites. Aucun changement significatif n'est indiqué en gris. Seuil p < 0,05 et log2FC ± 1. Les données sources sont fournies sous forme de fichier Source Data. a La teneur en métabolites intracellulaires a augmenté après 24 h, mais après 48 h de formation de biofilm, de nombreux métabolites ont diminué de manière significative. La plus forte baisse a été observée pour les substrats azotés (acides aminés et nucléotides). b De nombreux métabolites accumulés dans le métabolome extracellulaire dans les biofilms matures, car les acides aminés et les nucléotides étaient les plus abondants à la fin du temps.

En réponse à la famine, C. albicans sécrète généralement des enzymes hydrolytiques pour acquérir des nutriments à partir de macromolécules22. Pour étudier l'acquisition de nutriments par les cellules du biofilm, une analyse du sécrétome du support du biofilm usé a été effectuée. Au total, 1103 protéines ont été identifiées, dont 801 présentes dans le surnageant du biofilm après 24 h et 1067 après 48 h, indiquant une libération progressive des protéines au cours du vieillissement (Fig. 3a). L'analyse in silico a identifié des peptides signal (SP) dans 150 protéines (14 %), censés être sécrétés par la cellule ou insérés dans les membranes cellulaires par la voie conventionnelle. L'analyse des termes de l'ontologie génique (GO) de l'ensemble central de sécrétomes de protéines SP aux deux moments (Fig. 3b) a montré un enrichissement dans les processus associés au biofilm tels que l'adhésion, la formation de biofilm d'une seule espèce et l'interaction interspécifique. En outre, nous avons noté une agrégation cellulaire améliorée et des protéines d'organisation de la paroi cellulaire, y compris des protéines liées à la filamentation et à l'intégrité structurelle des biofilms. Le transport des glucides reflète le besoin cellulaire d'acquisition des nutriments. L'évaluation de la fonction biologique a confirmé la sécrétion d'enzymes hydrolytiques à fonction peptidase, glucosidase ou chitinase ainsi que des adhésines. Ainsi, les protéines sécrétées pourraient contribuer considérablement aux changements métaboliques et structurels au cours de la maturation du biofilm. L'enrichissement des protéines non-SP a montré des termes sensibles au stress (fichier de données supplémentaire 3), qui relient les processus de lyse cellulaire et correspondent également aux données du transcriptome.

un diagramme Volcano illustrant le rapport log2 des protéines sécrétées dans les biofilms de 48 et 24 h à la valeur padj correspondante (-log10). Les lignes pointillées symbolisent le seuil (p < 0,05 et log2FC ± 2). Un total de 1103 protéines différentes ont été identifiées dans tous les biofilms examinés, avec 801 protéines détectées à 24 h et 1067 protéines détectées à 48 h. Seulement 14 % contenaient un peptide signal (SP) pour la sécrétion dirigée. La fraction avec et sans SP a montré une qualité protéique supérieure après 48 h. b Analyse à terme GO de toutes les protéines détectées contenant un SP. Les comptages représentent l'abondance de protéines observée par rapport au nombre de protéines attribuées au terme (taille). Les résultats pour la fonction moléculaire et le processus biologique ont chacun été résumés à l'aide de REVIGO avec un seuil de dispensabilité de 0,5. Les données source sont fournies sous la forme d'un fichier de données source.

L'adaptation métabolique au cours de la maturation du biofilm a affecté les processus exigeants en oxygène, tels que la respiration aérobie. Pour mieux comprendre, les biofilms normoxiques ont été comparés à leurs homologues hypoxiques aux stades précoces et tardifs. Les milieux pour les environnements appauvris en oxygène ont été pré-incubés dans une chambre hypoxique pour réduire les niveaux d'oxygène et tous les biofilms ont été cultivés dans des plaques à six puits scellées. Fait intéressant, les projections des données transcriptionnelles et métaboliques en ce qui concerne l'évolution temporelle et les niveaux d'oxygène ont montré un schéma de regroupement distinct (Fig. 4). Dans l'analyse en composantes principales (ACP) du transcriptome, seuls les biofilms normoxiques de 8 h se sont séparés des biofilms normoxiques et hypoxiques plus anciens, alors que ces derniers se sont regroupés. Cette découverte montre une réponse transcriptionnelle à la limitation progressive de l'oxygène dans les biofilms matures indépendamment de l'apport initial en oxygène. À l'opposé, les métabolomes extracellulaires et intracellulaires se sont regroupés en fonction de leur apport initial en oxygène dans des échantillons de biofilm normoxique et hypoxique, et ils se sont divisés en sous-groupes plus petits reflétant des points temporels uniques. Ces données indiquent un impact plus important de la disponibilité initiale en oxygène sur la composition métabolique que le moment de la maturation du biofilm. Étant donné que des différences majeures se sont produites à 8 h de formation de biofilm, le point de temps précoce a été sélectionné pour d'autres analyses. Comme prévu, la plupart des processus régulés à la baisse, le métabolisme de l'ATP et le transport d'électrons mitochondrial, reflétaient la privation d'oxygène (Fig. 5). L'expression génique des processus liés au biofilm était plus élevée dans les biofilms hypoxiques, ce qui pourrait résulter d'une croissance plus rapide du biofilm sous normoxie, où la transcription des gènes liés au biofilm s'était déjà aplatie au bout de 8 h (Fig. 5). D'autres processus régulés de manière différentielle sous hypoxie comprenaient l'autophagie induite et le transport des glucides et le processus catabolique des acides aminés régulé négativement via la voie d'Ehrlich (Fig. 5). Dans les premiers biofilms, le métabolisme énergétique réprimé sous hypoxie se reflétait également dans le métabolome cellulaire, où seuls 12 métabolites étaient enrichis et 322 métabolites de toutes les voies métaboliques étaient nettement moins abondants par rapport aux biofilms normoxiques (Fig. 6a). Les métabolites les plus réduits comprennent les acides aminés, les lipides et les intermédiaires du cycle TCA, ce qui reflète le métabolisme mitochondrial altéré et les réarrangements dans le lipidome cellulaire. Bien que les métabolomes intracellulaires et extracellulaires forment des grappes distinctes dans le PCA (Fig. 4), seul un petit nombre de métabolites, se référant en particulier aux acides aminés et aux nucléotides, différaient dans le milieu épuisé hypoxique. Les tendances temporelles du métabolome intracellulaire et extracellulaire étaient similaires : dans les deux cas, le nombre absolu de différents métabolites abondants a diminué (Fig. 6b, c). Le plus petit nombre de métabolites différentiels a été détecté après 48 h, indiquant une similitude croissante entre les deux conditions de biofilm. Les différences restantes au cours de la phase tardive comprenaient des modifications intracellulaires des acides aminés et des métabolites lipidiques, ainsi qu'une forte diminution des dérivés azotés extracellulaires. Les niveaux intracellulaires d'acides aminés protéinogènes étaient relativement faibles, à l'exception de l'arginine (Fig. 6d). Simultanément, la plupart des acides aminés extracellulaires ont été retenus plus longtemps dans le milieu sous hypoxie (Fig. 6e), mais à des moments tardifs, les niveaux d'acides aminés étaient similaires à ceux du témoin normoxique.

Le modèle d'expression génique des biofilms normoxiques de 8 h forme un groupe distinct, tandis que les biofilms normoxiques plus anciens se regroupent avec les biofilms hypoxiques de tous les instants. Les métabolomes intra- et extracellulaires se regroupent fortement selon l'état d'oxygène et montrent une distribution principalement indépendante du point de temps. Les données source sont fournies sous la forme d'un fichier de données source.

Des termes GO enrichis ont été déterminés pour les gènes régulés positivement par l'hypoxie (741 au total) et les gènes régulés négativement par l'hypoxie (488 au total) contrairement aux homologues normoxiques. Le nombre décrit le nombre de gènes régulés différentiellement mesurés d'un processus (fréquence de cluster) et la taille mesure la fréquence de fond génomique. Tous les termes GO ont été résumés à l'aide de REVIGO avec des paramètres stricts (seuil : dispensabilité de 0,7). Les données source sont fournies sous la forme d'un fichier de données source.

Les métabolomes des cellules et des milieux des biofilms hypoxiques ont été comparés aux biofilms normoxiques et le nombre de changements significatifs (seuil p < 0, 05 et log2FC ± 1) a été tracé pour les principales voies métaboliques. Les nombres de métabolites différentiellement abondants ont été analysés et résumés selon les voies respectives pour (a) 8 h, (b) 24 h et (c) 48 h biofilms. Des changements significatifs (log2FC) dans l'abondance des acides aminés intracellulaires (d) et extracellulaires (e) ont été tracés. Les données source sont fournies sous la forme d'un fichier de données source.

L'analyse multi-omique a révélé des différences dans les adaptations métaboliques au fil du temps : bien que le métabolisme énergétique ait été généralement réduit sous hypoxie par rapport à la normoxie, les gènes, ainsi que certains intermédiaires métaboliques associés de la glycolyse et du métabolisme du TCA, ont été régulés à la hausse par rapport au temps hypoxique précoce. points (Fig. 1b, d supplémentaires). En revanche, ces voies métaboliques centrales ont été fermées chez les homologues cultivés sous normoxie (Fig. 1a, c supplémentaires). Nous concluons donc que la croissance dans des conditions hypoxiques nécessite une longue période d'adaptation au cours de laquelle les voies métaboliques centrales sont restructurées pour compenser le manque de respiration cellulaire.

La caractérisation de la maturation du biofilm de C. albicans de type sauvage a révélé que les gènes transporteurs transmembranaires et la réponse au stress étaient les quelques termes enrichis positivement dans le transcriptome au fil du temps, alors que de nombreux processus métaboliques et de préservation de l'énergie étaient régulés à la baisse (Fig. 1). Les intermédiaires des voies de biosynthèse des acides aminés se sont avérés enrichis en cellules et en milieu de biofilm au cours de la maturation. Pour aborder l'importance de l'absorption d'acides aminés dans les biofilms matures, nous avons étudié en détail les processus qui accompagnent la formation de biofilm du mutant stp2Δ, qui est altéré dans cette fonction17,19. L'ACP des ensembles de données de type sauvage et stp2Δ omiques a révélé un regroupement en ce qui concerne les points de temps d'échantillonnage et les niveaux d'oxygène avec moins d'influence sur les génotypes (Fig. 2 supplémentaire). Les transcriptomes de stp2Δ et les biofilms normoxiques de type sauvage ont été comparés à chaque instant (8, 24 et 48 h). Comme prévu, les termes GO les plus affectés dans l'ensemble de base indépendant du point temporel appartenaient aux transporteurs d'acides aminés et à l'importation et à l'utilisation de composés azotés (Fig. 7a). À des moments précis, les biofilms stp2Δ présentaient une expression accrue de gènes pour le transport des glucides à 8 h et pour l'homéostasie des ions zinc et le métabolisme de la réserve d'énergie à 48 h. Ces processus pointent vers une fonction plus large de Stp2 en plus de faciliter l'absorption des acides aminés. Les données du transcriptome ont été ajustées au temps pour élucider les effets liés au génotype, l'analyse du terme GO identifiant le métabolisme de la glutamine et la réduction des sulfates trouvés en plus de l'ensemble de base (Fig. 7b). La régulation à la hausse de l'assimilation du sulfate dans le fond stp2Δ suggère l'acquisition de sulfate pour la biosynthèse des acides aminés soufrés.

Les transcriptomes de stp2Δ et les biofilms de type sauvage cultivés pendant 8, 24 et 48 h dans des conditions normoxiques et les gènes exprimés de manière différentielle (p < 0,05 et log2FC ± 1) ont été analysés pour les enrichissements en terme GO et résumés avec REVIGO (dispensabilité < 0,5 et p < 0,05 étaient affichés). Les données source sont fournies sous la forme d'un fichier de données source. un diagramme VENN des effets spécifiques à un point dans le temps montre les effets les plus importants pour stp2Δ aux premiers points dans le temps. b Les différences indépendantes du moment (le moment comme variable confusionnelle) ont été analysées pour les effets spécifiques au génotype pendant la formation du biofilm.

Les jeunes biofilms stp2Δ (8 h) ont montré une expression accrue des gènes HGT appartenant à la famille des transporteurs de glucose23 (Fig. 7, Fichier de données supplémentaire 1 et Tableau supplémentaire 1). Chez Saccharomyces cerevisiae, il a été démontré que les membres de cette famille transportent la quinine en plus des hexoses et que l'expression des transporteurs d'hexoses peut être induite chimiquement24. La quinine a été utilisée pour inhiber le transport du glucose chez les champignons et le mutant S. cerevisiae stp2Δ a montré une sensibilité élevée à cet agent24. Fait intéressant, une combinaison de quinine et de bicarbonate a bloqué le transport des acides aminés et des sulfates chez C. albicans25. Nous avons examiné l'effet de la quinine sur la croissance des souches de type sauvage C. albicans, stp1Δ, stp2Δ et stp1Δstp2Δ double mutant. Alors que l'ajout de quinine ou de bicarbonate seul n'a pas affecté la croissance des souches de C. albicans testées (Fig. 4 supplémentaire), la combinaison des deux produits chimiques a entraîné un léger défaut de croissance du type sauvage et du mutant stp1Δ et une grave altération de la croissance du mutant stp2Δ. Le mutant de surexpression de STP2 et, dans une moindre mesure, le révertant de STP2 ont complété la croissance de type sauvage. Fait intéressant, le double mutant stp1Δstp2Δ a montré un défaut de croissance moins grave par rapport à la souche stp2Δ. Ainsi, la suppression de STP1 dans le fond mutant stp2Δ a atténué le transport altéré des nutriments.

Les comparaisons métaboliques des cellules du biofilm et des surnageants pour les effets spécifiques au génotype ont révélé un enrichissement en acides aminés, alors que toutes les autres classes de métabolites n'étaient que légèrement affectées (Fig. 8a). Les intermédiaires des voies de biosynthèse des acides aminés à chaîne ramifiée (BCAA), de la lysine et des polyamines étaient les plus réduits dans les cellules mutantes stp2Δ. D'autre part, les métabolites liés au métabolisme de l'aspartate / asparagine et au cycle de l'urée ont augmenté dans les cellules du biofilm stp2Δ (Fig. 8b et Fig. 3a supplémentaire). L'analyse combinée de la voie KEGG a été utilisée pour relier les ensembles de données du transcriptome et du métabolome (Fig. 3 supplémentaire). Bien que la biosynthèse des BCAA ait été régulée de manière transcriptionnelle précoce, les acides aminés n'ont été enrichis qu'à des moments tardifs (Fig. 3b supplémentaire). Cette biosynthèse tardive pourrait être due au manque d'intermédiaires précurseurs directs, trouvés à de faibles niveaux à tout moment. De plus, le gène de la transaminase, qui code pour l'enzyme finale dans la biosynthèse des BCAA, a été régulé à la baisse par la transcription. Un exemple contrasté est la voie de biosynthèse de la citrulline, dans laquelle la citrulline, l'arginine et l'ornithine ont été enrichies dans le métabolome intracellulaire des biofilms stp2Δ (Fig. 8b et Fig. 3a supplémentaire). En particulier, l'arginine semble être retenue pour la biosynthèse des protéines, ainsi les voies métaboliques en aval ont été supprimées transcriptionnellement, y compris les gènes CAR1 arginine transaminase et CAR2 ornithine transaminase. Enfin, la biosynthèse ultérieure des polyamines putrescine, spermidine et spermine était plus faible dans le métabolome des biofilms stp2Δ, et la formation et la sécrétion d'urée étaient également réduites (Fig. 3c supplémentaire).

Les métabolomes des cellules et des milieux ont été analysés pour des changements métaboliques significatifs dans les biofilms mutants stp2Δ et de type sauvage. Les contrastes analysés ont été ajustés dans le temps. Les nombres de métabolites avec des changements significatifs (Cutoff p < 0,05 et log2FC ± 1) ont été tracés pour les principales familles métaboliques (a) et les sous-groupes d'acides aminés (b). Les données sur les métabolites ont été ajustées dans le temps (le temps comme variable confusionnelle) avant l'analyse comparative. c Le diagramme en boîte montre l'abondance relative (log2FC, médiane, quartiles supérieur et inférieur) des acides aminés extracellulaires des milieux de type sauvage (noir) et stp2Δ (rouge), qui ont été normalisés aux concentrations respectives d'acides aminés du milieu vierge RPMI. Les différences statistiques entre les souches ont été calculées à l'aide du test t de Student et tracées à côté de l'acide aminé correspondant (* pour p < 0,05). Les données source sont fournies sous la forme d'un fichier de données source.

La composition extracellulaire en acides aminés a été analysée dans le temps pour surveiller l'absorption des acides aminés pour les deux souches dans des conditions normoxiques (Fig. 8c et Tableau supplémentaire 2). Nous avons trouvé une absorption médiée par Stp2 pour les acides aminés suivants : arginine, asparagine, isoleucine, leucine, lysine, phénylalanine, sérine, thréonine, tryptophane, tyrosine et valine. Fait intéressant, lorsque nous avons comparé ces acides aminés à l'ensemble publié d'acides aminés qui induisent le traitement et l'activation de Stp2, nous n'avons trouvé que cinq métabolites communs : l'arginine, l'asparagine, la lysine, la sérine et la thréonine (tableau supplémentaire 2). La proline était le seul acide aminé avec une importation accrue par les cellules stp2Δ par rapport au type sauvage. L'alanine, la cystéine et la glutamine se sont accumulées dans le milieu usé au fil du temps. De nombreux autres produits du métabolisme des acides aminés ont été enrichis dans le surnageant du biofilm (Fig. 8, Fichier de données supplémentaire 2), y compris les acides aminés acétylés et le tyrosol, un sous-produit sécrété du métabolisme de la tyrosine. Le tyrosol, une molécule de détection de quorum qui prend en charge la formation d'hyphes27, était enrichi en milieu de biofilm de type sauvage et était significativement plus faible en contrepartie stp2Δ.

Les mutants de délétion STP2 sont gravement altérés dans l'absorption des acides aminés et les mécanismes compensatoires dans l'acquisition des nutriments deviennent de plus en plus importants au cours du temps de formation du biofilm. Dans ce contexte, la sécrétion d'enzymes hydrolytiques qui cassent les nutriments macromoléculaires extracellulaires, tels que les polypeptides et les lipides, pourrait fournir des sources de nutriments supplémentaires. Les sécrétomes des biofilms stp2Δ ont été comparés au type sauvage et ont révélé une quantité de protéines qualitativement réduite dans stp2Δ à 63 % à 24 h et 77 % à 48 h, respectivement. Par conséquent, davantage de protéines ont été différentiellement enrichies en sécrétomes de type sauvage (Fig. 5a, b supplémentaires). Un ensemble de base de protéines sécrétées spécifiques au génotype des deux moments a été défini (tableau supplémentaire 3). Le sécrétome du biofilm spécifique de stp2Δ contenait deux enzymes hydrolysantes agissant dans l'acquisition des acides gras de la lysophosphatidylcholine par la phospholipase B (Plb1) et des peptides des protéines par l'aspartyl protéase 2 sécrétée (Sap2). Le sécrétome spécifique de type sauvage contenait également des enzymes pour l'acquisition de nutriments comme la carboxypeptidase Cpy2 et la glucoamylase Gca2. D'autres protéines apparentées au type sauvage ont été connectées à l'assemblage de la paroi cellulaire, telles que les glucosidases et les mannosyltransférases. La dernière observation peut indiquer le rôle de Stp2 dans la composition protéique de la paroi cellulaire des biofilms matures. La présence extracellulaire de l'enzyme adénylate kinase Adk1 peut être utilisée comme marqueur de la lyse cellulaire28 et nous avons noté une augmentation constante de l'abondance d'Adk1 dans le sécrétome de type sauvage (fichier de données supplémentaire 3). L'abondance enzymatique était plus faible, bien que non significative, dans le sécrétome stp2Δ par rapport au type sauvage. Néanmoins, les données ont indiqué une lyse cellulaire progressive, en particulier dans les biofilms de type sauvage.

C. albicans est un colonisateur commun de l'hôte humain, où il pousse principalement dans des biofilms multicouches. Les infections superficielles des muqueuses sont causées par des biofilms à partir desquels les cellules de dispersion peuvent se détacher et ainsi se propager de manière systémique. Vivre dans ces structures complexes protège le champignon des agressions extérieures lors d'une réponse immunitaire ou d'un traitement antifongique29,30.

Les cellules incorporées ont un accès limité aux nutriments préférentiels et à l'oxygène en raison de la compartimentation et de la structure du biofilm. Au cours de la maturation du biofilm, des sous-populations spécialisées se différencient pour s'adapter aux conditions de stress telles que la carence en nutriments31,32. L'homéostasie des acides aminés est essentielle à la croissance et au maintien cellulaires et ce processus comprend trois mécanismes principaux : l'absorption des acides aminés, la synthèse de novo et le recyclage par autophagie33. Des études antérieures ont montré un lien entre la régulation transcriptionnelle des gènes d'utilisation des acides aminés et la formation de biofilms de C. albicans15,18,19,20, mais l'importance de l'absorption active des acides aminés et ses conséquences métaboliques n'ont pas été abordées. À l'aide d'un ensemble complet de données multi-omiques, des biofilms normoxiques de type sauvage ont été comparés à des conditions hypoxiques et à un mutant stp2Δ avec une utilisation altérée des acides aminés pour examiner les effets de la limitation progressive de l'oxygène et des nutriments, respectivement. Nous avons délibérément choisi des conditions de biofilm définies et statiques pour permettre une comparaison directe des données, même si ces conditions ne peuvent pas représenter pleinement les biofilms cliniques.

Nos données transcriptomiques ont montré une diminution de l'expression des gènes impliqués dans le métabolisme des glucides, des acides aminés et des nucléotides, ainsi que la production d'énergie via le cycle TCA et la respiration pendant la maturation du biofilm de C. albicans dans des conditions normoxiques. De plus, nous avons noté une régulation précoce de la glycolyse, du métabolisme des acides aminés et de la biosynthèse des lipides, alors qu'à des moments ultérieurs, l'utilisation de nutriments alternatifs a été augmentée, ce qui correspond bien aux observations précédentes14,34. La régulation transcriptionnelle des gènes métaboliques a entraîné des changements dans le métabolome, où les acides aminés intracellulaires et les intermédiaires lipidiques ont culminé à 24 h et ont chuté plus tard, indiquant des processus mitochondriaux actifs précoces et des taux métaboliques globalement réduits au cours du vieillissement. Des observations similaires ont été faites par Zhu et al. qui ont montré que les métabolites appartenant au cycle TCA, les acides aminés et les glucides intermédiaires étaient prédominants dans la phase médiane de la formation du biofilm11.

À des stades ultérieurs, nous avons observé une diminution spectaculaire de l'expression génique de plusieurs voies métaboliques, mais avec une augmentation particulière des gènes de perméase d'acides aminés qui sont probablement nécessaires pour maintenir l'homéostasie intracellulaire des acides aminés. La régulation à la hausse des transporteurs d'acides aminés et de peptides semble être une caractéristique conservée des biofilms microbiens signalés pour les bactéries gram-négatives et gram-positives, les levures et les champignons filamenteux5,10,16,34,35,36,37. Fait intéressant, les travaux antérieurs de Traven et al. ont montré que les gènes du métabolisme des acides aminés et de la fermentation étaient fortement exprimés dans les couches cellulaires supérieures des colonies de S. cerevisiae par rapport aux structures inférieures. Ces derniers montrent une expression particulièrement élevée des gènes de la respiration mitochondriale, ce qui indique un métabolisme ralenti dans les couches inférieures et une croissance active dans les couches supérieures du biofilm38.

La diffusion restreinte des gaz et les environnements pauvres en oxygène sont également considérés comme des caractéristiques communes des biofilms bactériens et fongiques29,35,39. Pour les agents pathogènes humains, la formation de niches hypoxiques dans les biofilms revêt une importance thérapeutique particulière car, comme l'illustre Aspergillus fumigatus, l'état métabolique réduit est associé à une résistance antifongique accrue29. Nous avons démontré une déficience croissante en oxygène des biofilms initialement normoxiques au niveau de l'expression génique, à mesure que les profils se rapprochaient des biofilms développés par hypoxie à des moments ultérieurs. La régulation négative de la transcription de la production d'énergie s'est traduite par des niveaux considérablement réduits de métabolites intracellulaires et par conséquent une sécrétion plus faible de métabolites azotés dans le milieu. Le faible taux métabolique a conduit à l'induction de gènes d'autophagie, qui est une réponse générale à la privation de divers nutriments essentiels, où les protéines cytosoliques sont ciblées vers la vacuole pour la dégradation en masse et le recyclage des acides aminés33,40. Une compensation métabolique supplémentaire a été obtenue par induction transcriptionnelle de l'importation de nutriments, qui ressemble à une transcription améliorée des gènes de perméase d'acides aminés dans les cellules planctoniques cultivées sous hypoxie41. Les profils métaboliques étaient plus stables dans le temps que l'empreinte transcriptionnelle et les schémas métaboliques normoxiques et hypoxiques séparés à chaque instant. La croissance hypoxique nécessite des réarrangements des voies métaboliques chez C. albicans, comme une transcription accrue des gènes glycolytiques est nécessaire pour l'adaptation à la carence en oxygène10. De la même manière, la glycolyse et, dans une certaine mesure, le cycle du TCA étaient régulés positivement de manière transcriptionnelle dans les biofilms hypoxiques tardifs. Les réponses métaboliques à une hypoxie soutenue ont entraîné la dégradation des intermédiaires du cycle TCA et des lipides dans les cellules planctoniques41. Cependant, nous avons observé une augmentation des lipides et des métabolites du TCA à des moments tardifs, suggérant un effet spécifique au biofilm.

Les biofilms de type sauvage ont subi une restructuration approfondie du métabolisme des acides aminés, et un mutant de délétion STP2 déficient en absorption d'acides aminés a été sélectionné pour une analyse plus approfondie. Dans une étude récente, nous avons montré que Stp2 est impliqué dans l'adhérence et la formation précoce du biofilm et que l'inactivation des gènes a un effet positif sur la longévité du biofilm17, mais les processus sous-jacents n'ont pas été étudiés. Dans la présente étude, les analyses du transcriptome ont révélé que le long du contrôle d'expression attendu des gènes de la perméase des acides aminés, Stp2 avait un impact global sur le métabolisme de l'azote cellulaire à tous les moments de la formation du biofilm.

Une mauvaise absorption des acides aminés conduit à des réponses de famine intracellulaire. L'état de famine d'une cellule peut être testé en ajoutant de la quinine, ce qui crée artificiellement un stress nutritif supplémentaire conduisant à une sensibilité accrue dans les cellules pré-affamées. Dans la levure, la quinine perturbe à la fois un transporteur tryptophane/tyrosine de haute affinité et inhibe l'absorption du glucose24,42. Pour C. albicans et d'autres champignons, la combinaison de quinine et de bicarbonate de sodium a été décrite pour induire une inhibition de croissance synergique25. Lors de l'ajout de quinine, un mutant de S. cerevisiae stp1Δ était plus résistant que le type sauvage, alors que la suppression de ScSTP2 avait l'effet inverse24. De même, le traitement combiné tel que décrit ci-dessus a entraîné un résultat quasi mortel pour le mutant stp2Δ de C. albicans, alors qu'un mutant stp1Δ a montré une croissance de type sauvage. Le double mutant stp1Δstp2Δ avait une croissance améliorée par rapport à la souche stp2Δ. Ce résultat suggère des fonctions opposées pour les deux paralogues Stp de C. albicans sous un stress nutritif sévère, Stp2 étant un facteur de famine clé pour contrer le déséquilibre des acides aminés.

Afin de spécifier l'absorption d'acides aminés médiée par Stp2, les métabolomes extracellulaires ont été comparés à un milieu vierge et ont révélé la rétention de 11 acides aminés protéinogènes dans le milieu usé stp2Δ. Une exception était la proline avec une absorption accrue dans le fond stp2Δ, ce qui peut indiquer une compensation de l'absorption généralement restreinte d'acides aminés ou une fonction légèrement répressive de Stp2 dans l'absorption de proline. La détection d'acides aminés extracellulaires via la voie de signalisation SPS conduit à l'activation de Stp2, et seul un sous-ensemble de huit acides aminés peut déclencher la cascade19,26. Étonnamment, seul un chevauchement partiel a été trouvé entre les acides aminés qui induisent le traitement Stp2 et ceux dont l'absorption est régulée par Stp2. En conclusion, bien que la reconnaissance et l'absorption des acides aminés extracellulaires soient associées au système SPS, elles ne sont pas congruentes.

L'abondance intracellulaire en acides aminés du mutant stp2Δ était également réduite et affectait principalement les acides aminés à chaîne ramifiée et les intermédiaires de lysine dont l'importation était dépendante de Stp2. Souvent, les précurseurs métaboliques directs ou les produits de dégradation de ces acides aminés protéinogènes étaient épuisés, probablement pour maintenir le pool cellulaire pour la biosynthèse des protéines. Par exemple, la conversion de l'arginine en polyamines a été nettement réduite dans les biofilms stp2Δ par la régulation à la baisse des gènes de l'arginine et de l'ornithine transaminase, entraînant une accumulation intracellulaire d'arginine et d'ornithine et une réduction de la putrescine, de la spermine et de la spermidine. Une corrélation entre l'abondance des polyamines et le développement du biofilm a déjà été décrite, de sorte que la prototrophie de la putrescine et la supplémentation en putrescine extracellulaire contribuent au passage de la levure aux hyphes et favorisent ainsi la formation du biofilm11,43. La protéine kinase Ptk2 est nécessaire pour une absorption efficace de la polyamine et nous avons observé que l'expression de PTK2 était augmentée au cours de la maturation des biofilms de type sauvage. De même, il a été démontré que PTK2 était régulé de manière transcriptionnelle dans les biofilms par rapport à la croissance planctonique15. En conséquence, l'absorption de polyamines et les niveaux intracellulaires favorisent la formation de biofilm et un déséquilibre pourrait contribuer au retard du développement du biofilm stp2Δ.

Une autre façon dont le métabolisme régule la production de biofilm est la sécrétion de molécules de détection de quorum, qui peuvent avoir des effets stimulants ou répressifs44. Un représentant est le tyrosol, qui est formé par la dégradation de la tyrosine et est lui-même une molécule de détection de quorum sécrétée qui agit comme un antagoniste du farnesol, favorisant la germination et la formation précoce de biofilm27,44,45. Le tyrosol est produit à partir de la tyrosine via la voie de l'huile d'Ehrlich-Fusel par les étapes de réaction de la transaminase, de la décarboxylase et de l'alcool déshydrogénase46. La production d'alcools aromatiques à partir d'acides aminés aromatiques est conservée chez S. cerevisiae et C. albicans47. Le tyrosol s'est accumulé de manière intracellulaire et extracellulaire pendant la maturation du biofilm de type sauvage, mais a été supprimé en raison de l'absence de STP2. Cette dernière peut s'expliquer par l'absorption altérée de la tyrosine extracellulaire dans les cellules stp2Δ et en outre par une expression fortement réduite du gène de la décarboxylase ARO10 (35). La formation du tyrosol, une molécule de détection de quorum dérivée d'acides aminés, relie le métabolisme au développement du biofilm et aux limitations de la voie corrélées à la formation retardée de filaments17.

Bien que nous ayons signalé de graves limitations métaboliques à différents niveaux après la perte de STP2, le mutant pourrait former des biofilms structurellement intacts à des moments ultérieurs17. Plusieurs mécanismes compensatoires ont été identifiés, y compris la biosynthèse améliorée des acides aminés. Fait intéressant, la suppression de STP2 a modifié la transcription des transporteurs non acides aminés, y compris les importateurs de nucléotides et de glucose, le transport des glucides étant un terme GO significativement régulé à la hausse dans les cellules stp2Δ par rapport au type sauvage. Récemment, la croissance du biofilm dans des conditions de CO2 élevées a été liée à une meilleure absorption du glucose via le même ensemble d'importateurs de glucose16.

Une deuxième stratégie d'adaptation métabolique est l'expression accrue des gènes d'absorption du zinc dans les biofilms stp2Δ tardifs. L'acquisition de zinc et la formation de biofilms sont liées par le facteur de transcription Csr1, qui contrôle les deux processus48,49. L'expression génique pour l'absorption de zinc, de fer et d'acides aminés s'est avérée être simultanément régulée positivement dans les cellules de dispersion, jouant ainsi un rôle important dans l'étape finale du développement du biofilm50. Compte tenu de sa capacité à piéger le zinc plus efficacement, le mutant stp2Δ pourrait améliorer le métabolisme des métaux traces, contribuant éventuellement à une longévité prolongée.

Le troisième mécanisme de réponse à la famine est la sécrétion d'enzymes hydrolytiques pour accéder aux nutriments macromoléculaires dans l'environnement. L'inhibition de ces hydrolases extracellulaires a été utilisée pour lutter contre les biofilms cliniques, indiquant leur importance dans la virulence51,52. Ici, nous avons étudié comment le sécrétome du biofilm était affecté par la suppression de STP2. Premièrement, l'augmentation significative de la quantité de protéines sécrétées dans le milieu de type sauvage était particulièrement frappante, résultant probablement d'une lyse cellulaire précoce par rapport à la longévité accrue des biofilms mutants stp2Δ17. Une grande fraction était constituée de protéines cytosoliques dépourvues de SP prédit. Deux études publiées sur le sécrétome de C. albicans ont trouvé respectivement 225 et 446 protéines, dont environ un tiers et un quart n'ont pas de signal de sécrétion53,54. Dans le sécrétome de type sauvage, les protéines avec un SP étaient fréquemment impliquées dans la biogenèse de la paroi cellulaire avec une activité de glucosidase ou de chitinase ou étaient des protéines hydrolytiques pour l'acquisition de nutriments. Les deux groupes appartiennent à des protéines non-GPI qui sont généralement prédominantes dans le sécrétome de C. albicans55. Deuxièmement, les protéines spécifiques à la souche ont été examinées avec le sécrétome de type sauvage contenant une α-1,2-mannosyltransférase (Mnn22) et une α-glucosidase (Rot2), indiquant des différences possibles dans la composition de la paroi cellulaire56,57. L'enrichissement supplémentaire de la Gca2-glucoamylase peut indiquer une hydrolyse des glucides induite par Stp2 avec un effet possible sur la formation de la matrice du biofilm58. Pour compenser l'épuisement des nutriments, le sécrétome spécifique de stp2Δ a été enrichi d'une phospholipase B (Plb1) et d'une aspartyl protéinase sécrétée (Sap2), qui, en plus de leurs fonctions enzymatiques lipolytiques et protéolytiques respectives, sont des facteurs de virulence importants impliqués dans la cellule hôte. pénétration et lésions tissulaires59,60.

Dans l'ensemble, grâce à notre conception multi-omique de pointe, nous avons pu donner un profilage approfondi unique de la maturation du biofilm de C. albicans. Nous avons constaté que la limitation progressive des nutriments préférés et la privation d'oxygène entraînaient la libération de protéines cellulaires à partir de biofilms vieillissants. En étudiant un mutant de délétion STP2, nous avons pu empêcher l'absorption nécessaire d'un ensemble défini d'acides aminés. La nature adaptative du métabolisme de C. albicans a facilité l'homéostasie des acides aminés et compense l'importation altérée par l'activation de la biosynthèse intracellulaire des acides aminés, l'importation des glucides et la sécrétion d'enzymes hydrolytiques. Ces réarrangements métaboliques ont conduit à une bonne maturation du biofilm malgré le stress de la famine et même à une cytolyse réduite au cours du vieillissement. Comme le métabolisme est un régulateur principal de la maturation du biofilm, interférer avec les composants clés de l'absorption des acides aminés ou du sucre pourrait être utilisé dans la thérapie fongicide combinée pour contrôler les infections fongiques du biofilm.

Les souches de C. albicans ont été systématiquement passées sur de la gélose YPD (2 % de peptone, 1 % d'extrait de levure, 2 % de glucose, 1,5 % de gélose) à 30 °C et stockées sous forme de stocks congelés dans du milieu YPD à l'aide de cryotubes de levure Roti®-Store (Carl Roth GmbH+Co.KG). Le RPMI avec de la glutamine stable et un tampon NaHCO3 (référence produit FG1215, Merck – Biochrom) a été utilisé comme milieu d'induction pour les tests in vitro de biofilm et de cultures planctoniques. Les souches de C. albicans utilisées dans ce travail sont répertoriées dans le tableau 1.

Les cellules de C. albicans ont été cultivées pendant une nuit dans du YPD à 30 ° C et lavées deux fois avec du PBS. La densité cellulaire a été fixée à 4 et 5 µl d'une dilution en série de 10 fois ont été déposés sur des milieux sélectionnés et les plaques ont été incubées pendant 2 jours à 30 °C. L'effet de la quinine (chlorhydrate de quinine dihydraté, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Allemagne) et du bicarbonate (bicarbonate de sodium, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Allemagne) a été choisi comme facteurs de stress cellulaires comme établi précédemment25.

Les précultures ont été incubées dans 10 ml de YPD (pendant la nuit, 30 ° C, 180 tr / min, normoxie). Les cellules ont été récoltées et divisées en deux pour une manipulation ultérieure dans des conditions normoxiques ou hypoxiques. À partir de ce moment, toute la procédure expérimentale, y compris la manipulation du milieu, a été réalisée dans des conditions normoxiques (recouvertes d'une feuille d'étanchéité) ou hypoxiques avec 1 % d'O2 et 0,1 % de CO2 dans une chambre hypoxique (SCI-tive, Baker Ruskinn, The Société Baker). Des biofilms ont été induits dans 4 ml de milieu RPMI dans chaque puits d'une plaque à six puits (Costar®, Corning®) à une densité de DO600 nm de 0,5. Pour chaque souche et condition de croissance, six répétitions techniques ont été cultivées sur une plaque à puits. Après 90 min de culture à 37 °C sous agitation (180 tr/min), les cellules non adhérentes ont été rincées avec du PBS. Ensuite, du milieu RPMI frais et préchauffé de 4 ml a été ajouté aux cellules adhérentes adaptées au RPMI. Après la formation de biofilm (37 ° C, 180 tr/min) pendant 8 h, 24 ou 48 h, les six puits de chaque plaque ont été regroupés, centrifugés et traités comme un échantillon répété. De plus, un milieu de biofilm usé a été collecté pour des analyses métabolomiques extracellulaires. Des triplicats biologiques ont été collectés pour le séquençage de l'ARN et cinq réplicats d'échantillons extracellulaires et cellulaires ont été prélevés pour l'analyse du métabolome. Tous les échantillons ont été stockés à –80 °C jusqu'à ce qu'ils soient traités ultérieurement.

L'ARN a été extrait à l'aide du kit RNeasy Plus Universal (Qiagen, Hilden, Allemagne) selon le protocole du fabricant. La dégradation et la contamination de l'ARN ont été surveillées sur des gels d'agarose à 1 %. La pureté de l'ARN a été vérifiée à l'aide du spectrophotomètre NanoPhotometer® (IMPLEN, CA, USA). L'intégrité et la quantification de l'ARN ont été évaluées à l'aide du kit de dosage RNA Nano 6000 du système Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies, CA, USA).

Une quantité totale de 1 µg d'ARN par échantillon a été utilisée comme matériau d'entrée pour les préparations d'échantillons d'ARN. Des bibliothèques de séquençage ont été générées à l'aide d'ARN NEBNext® UltraTM. Le kit de préparation de bibliothèque pour Illumina® (NEB, USA) suivant les recommandations du fabricant et des codes d'index ont été ajoutés pour attribuer des séquences à chaque échantillon. En bref, l'ARNm a été purifié à partir de l'ARN total en utilisant des billes magnétiques poly-T oligo-attachées. La fragmentation a été réalisée à l'aide de cations divalents à température élevée dans le tampon de réaction de synthèse NEBNext First Strand (5X). L'ADNc du premier brin a été synthétisé à l'aide d'une amorce hexamère aléatoire et de la transcriptase inverse M-MuLV (RNase H-). La synthèse d'ADNc du deuxième brin a ensuite été réalisée en utilisant l'ADN polymérase I et la RNase H. Les surplombs restants ont été convertis en extrémités franches via des activités d'exonucléase/polymérase. Après adénylation des extrémités 3' des fragments d'ADN, l'adaptateur NEBNext avec une structure en épingle à cheveux a été ligaturé pour préparer l'hybridation. Afin de sélectionner des fragments d'ADNc d'une longueur préférentielle de 150 à 200 pb, les fragments de la bibliothèque ont été purifiés avec le système AMPure XP (Beckman Coulter, Beverly, USA). Ensuite, 3 µl d'enzyme USER (NEB, USA) ont été utilisés avec de l'ADNc ligaturé à l'adaptateur de taille sélectionnée à 37 ° C pendant 15 min, suivi de 5 min à 95 ° C avant la PCR. Ensuite, la PCR a été réalisée avec l'ADN polymérase haute fidélité Phusion, les amorces PCR universelles et l'amorce Index (X). Enfin, les produits de PCR ont été purifiés (système AMPure XP) et la qualité de la bibliothèque a été évaluée sur le système Agilent Bioanalyzer 2100.

Le regroupement des échantillons codés par index a été effectué sur un système de génération de cluster cBot à l'aide du kit de cluster PE cBot-HS (Illumina) conformément aux instructions du fabricant. Après la génération de clusters, les préparations de bibliothèques ont été séquencées sur une plate-forme Illumina Novaseq 6000 et des lectures appariées de 150 bp ont été générées.

FastQC (version 0.11.9) a été utilisé pour confirmer la qualité des données brutes. Le génome de référence (C_albicans_SC5314_version_A22-s07-m01-r44_chromosomes.fasta) et l'annotation du génome (C_albicans_SC5314_version_A22-s07-m01-r44_features.gtf) ont été téléchargés à partir de la base de données du génome de Candida. Les lectures appariées ont été cartographiées sur le génome de référence à l'aide de Bowtie 2 (version 2.3.5.1). Les lectures mappées ont été attribuées aux caractéristiques génomiques à l'aide de la fonction featureCounts du package R Rsubread (version 2.2.6). Les contrastes entre les groupes d'échantillons ont été calculés à l'aide du package R DESeq2 (version 1.28.1) et les valeurs de p ont été ajustées selon Benjamini-Hochberg. Les changements de pli indépendants du temps entre les groupes d'échantillons ont été analysés à l'aide de modèles avec le point dans le temps comme variable de confusion.

Les listes de gènes de contrastes d'intérêt ont été filtrées pour les différences significatives (seuil p < 0,05 et log2FC ± 1) et analysées pour les termes GO enrichis concernant le processus biologique ou la fonction moléculaire à l'aide de l'outil en ligne CGD gene ontology term finder avec les paramètres par défaut (Candida Genome Base de données http://www.candidagenome.org/61 consultée en septembre 2021). Les données GO ont été résumées en supprimant les termes redondants à l'aide de REVIGO62 avec le seuil de dispensabilité indiqué.

La vue de chemin du package R (version 1.28.1) a été utilisée pour visualiser les changements de pli métaboliques et transcriptionnels dans les voies sélectionnées63.

La préparation et l'analyse des échantillons ont été effectuées comme décrit précédemment64 chez Metabolon, Inc. En bref, la préparation des échantillons impliquait la précipitation et l'élimination des protéines avec du méthanol, l'agitation et la centrifugation. Les extraits résultants ont été profilés sur une plate-forme métabolomique globale de masse précise composée de plusieurs bras différant par des méthodes de chromatographie et des modes d'ionisation par spectrométrie de masse pour obtenir une large couverture de composés différant par des propriétés physiochimiques telles que la masse, la charge, la séparation chromatographique et le comportement d'ionisation. Les détails de cette plate-forme ont été décrits précédemment65,66. Les métabolites ont été identifiés par comparaison automatisée des caractéristiques ioniques dans les échantillons expérimentaux à une bibliothèque de référence d'entrées standard chimiques qui comprenaient le temps de rétention, le poids moléculaire (m/z), les adduits préférés et les fragments de source ainsi que les spectres MS associés, et ont été sélectionnés par inspection visuelle pour le contrôle de la qualité à l'aide d'un logiciel développé par Metabolon64,67.

Toutes les données brutes sur les métabolites ont été normalisées en termes de nombre de surfaces brutes entre les échantillons. Par la suite, chaque biochimique a été remis à l'échelle pour fixer la médiane égale à 1. Ensuite, les valeurs manquantes ont été fixées à la valeur de la plus petite valeur non manquante pour chaque métabolite. Les changements de pli entre les groupes d'échantillons et les valeurs de p ont été calculés à l'aide d'un test t bilatéral. Les changements de pli indépendants du temps entre les groupes d'échantillons ont été analysés à l'aide d'une régression linéaire avec le point dans le temps comme variable de confusion. Les valeurs de p ont été ajustées selon Benjamini-Hochberg. Répliquer deux de l'échantillon de métabolome intracellulaire "type sauvage, normoxie, 48 h" a été considéré comme une valeur aberrante technique en raison d'une abondance moyenne de métabolites 25 fois inférieure et d'une détection limitée des métabolites.

Des biofilms normoxiques ont été cultivés pendant 24 ou 48 h dans trois plaques à six puits pour chaque échantillon afin de collecter 50 ml de milieu de biofilm usé. Les expériences ont été réalisées en triplicats biologiques. Le surnageant du milieu de culture liquide usé a été traité comme suit : 1 comprimé de cocktail d'inhibiteurs de protéase Complete Ultra (Roche) a été ajouté à 50 ml de surnageant filtré. Le pH a été fixé à 2 par addition d'acide trifluoroacétique (TFA). Les protéines ont été enrichies en utilisant une extraction en phase solide avec des cartouches Chromabond C4 SPE (Macherey-Nagel). La matrice C4 liée à la silice a d'abord été reconstituée avec 4 ml d'acétonitrile (ACN) et conditionnée avec 4 ml de TFA à 0,1 % dans de l'eau. Ensuite, l'échantillon a été chargé. Les cartouches ont été lavées en utilisant 4 ml de méthanol à 5 ​​% (MeOH)/TFA à 0,1 % dans de l'eau. Les protéines ont été éluées avec 4 ml de TFA à 0,1 % dans 80/20 ACN/eau (v/v). L'éluat a été évaporé jusqu'à ce qu'il soit sec en utilisant un concentrateur sous vide. Les protéines ont été resolubilisées dans 100 ul de bicarbonate de triéthylammonium 50 mM (TEAB) dans 50/50 2,2,2-trifluoroéthanol (TFE)/eau (v/v). Les thiols protéiques ont été réduits et alkylés pendant 30 min à 70 ° C après l'ajout de chaque 4 µl de TCEP 500 mM (tris (2-carboxyéthyl) phosphine) et de 2-chloroacétamide (CAA) 625 mM. Les échantillons ont ensuite été nettoyés par précipitation méthanol-chloroforme-eau en utilisant le protocole de Wessel et Flügge68. Le précipité a été resolubilisé dans 100 µl de TFE à 5 %/TEAB 95 mM dans de l'eau et digéré pendant une nuit (18 h) avec un mélange Trypsine + LysC (Promega) à un rapport protéine/protéase de 25:1. Les échantillons ont de nouveau été évaporés dans un concentrateur sous vide, resolubilisés dans 25 µl de TFA à 0,05 % dans H2O/ACN 98/2 (v/v) filtrés à travers des filtres à membrane PTFE Ultrafree-MC 0,2 µm (Merck-Millipore). Le filtrat a été transféré dans des flacons HPLC et injecté dans l'instrument LC-MS/MS. Chaque échantillon a été mesuré en triple (3 répétitions analytiques de trois répétitions biologiques).

L'analyse LC-MS/MS a été réalisée sur un système Ultimate 3000 nano RSLC connecté à un spectromètre de masse QExactive HF (tous deux Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Le piégeage des peptides pendant 5 min sur une colonne Acclaim Pep Map 100 (2 cm × 75 µm, 3 µm) à 5 µl/min a été suivi d'une séparation sur une nano colonne analytique Acclaim Pep Map RSLC (50 cm × 75 µm, 2 µm) . L'élution en gradient de phase mobile de l'éluant A (0,1 % (v/v) d'acide formique dans l'eau) mélangé à l'éluant B (0,1 % (v/v) d'acide formique dans 90/10 d'acétonitrile/eau) a été réalisée comme suit : 0–5 min à 4 % B, 30 min à 7 % B, 60 min à 10 % B, 100 min à 15 % B, 140 min à 25 % B, 180 min à 45 % B, 200 min à 65 % B, 210– 215 min à 96 % B, 215,1–240 min à 4 % B.

Des ions chargés positivement ont été générés à une tension de pulvérisation de 2,2 kV à l'aide d'un émetteur en acier inoxydable fixé à la source d'ions Nanospray Flex (Thermo Fisher Scientific). L'instrument quadripolaire/orbitrap fonctionnait en mode Full MS/MS2 dépendant des données (Top15). Les ions précurseurs ont été surveillés à m / z 300–1500 à une résolution de 120 000 pleine largeur à mi-hauteur (FWHM) en utilisant un temps d'injection maximal (ITmax) de 120 ms et une cible de contrôle automatique de gain (AGC) de 3 × 106. Précurseur les ions avec un état de charge de z = 2–5 ont été filtrés à une largeur d'isolement de m / z 1, 6 amu pour une fragmentation supplémentaire du HCD à 30% d'énergie de collision normalisée (NCE). Les ions MS2 ont été scannés à 15 000 FWHM (ITmax = 120 ms, AGC = 2 × 105) en utilisant une première masse fixe de m/z 120 amu. L'exclusion dynamique des ions précurseurs a été fixée à 30 s et le taux de sous-remplissage a été fixé à 1,0 %. L'instrument LC-MS/MS était contrôlé par les logiciels Chromeleon 7.2, QExactive HF Tune 2.8 et Xcalibur 4.0.

Les spectres de masse en tandem ont été recherchés dans la base de données UniProt de Candida albicans (https://www.uniprot.org/proteomes/UP000000559; 2019/06/16) à l'aide de Proteome Discoverer (PD) 2.2 (Thermo) et des algorithmes de Mascot 2.4. 1 (Matrix Science, Royaume-Uni), Sequest HT (version de PD2.2) et MS Amanda 2.0. Deux clivages manqués ont été autorisés pour la digestion trypsique. La tolérance de masse du précurseur a été fixée à 10 ppm et la tolérance de masse du fragment a été fixée à 0,02 Da. Les modifications ont été définies comme une oxydation Met dynamique et une acétylation N-terme des protéines ainsi qu'une carbamidométhylation Cys statique. Un taux de fausses découvertes (FDR) strict < 1 % (niveaux de peptides et de protéines) était requis pour les résultats positifs aux protéines. Si seulement 1 peptide par protéine a été identifié, le hit a été accepté si le score Mascot était > 30 ou le score MS Amanda était > 300 ou le score Sequest était > 4. Le nœud Percolator de PD2.2 et une base de données de leurre inversé ont été utilisés pour la validation de la valeur q des correspondances spectrales. Seuls les protéines de rang 1 et les peptides des protéines les mieux notées ont été comptés. La quantification des protéines sans étiquette était basée sur l'algorithme Minora de PD2.2 en utilisant un rapport signal sur bruit> 5. L'imputation des valeurs quan manquantes a été appliquée en fixant l'abondance à 75 % de l'abondance la plus faible identifiée pour chaque échantillon.

Les changements de pli entre les groupes d'échantillons et les valeurs de p ont été calculés à l'aide d'un test t bilatéral. La valeur de p ajustée au rapport a été dérivée de la valeur de p divisée par le rapport log4. Des versions de serveur Web de SignalP69 et Phobius70 ont été utilisées pour prédire les peptides signal potentiels dans les séquences de toutes les protéines identifiées.

Les ensembles de données transcriptomiques générés au cours de l'étude actuelle et analysés dans les Fig. 1, 4, 5, 7, S1–3 et le tableau supplémentaire 1 sont disponibles dans le NCBI Gene Expression Omnibus avec l'identifiant d'ensemble de données GSE194223. Les ensembles de données protéomiques de spectrométrie de masse générés et analysés dans les Fig. 3, S4 et le tableau supplémentaire 3 au cours de la présente étude ont été déposés auprès du Consortium ProteomeXchange via le référentiel partenaire PRIDE71 avec l'identifiant d'ensemble de données PXD026449. Les données sources sous-jacentes aux Figs. 1 à 8, Fig. supplémentaires. 1 à 4 et le tableau supplémentaire 2 sont fournis sous forme de fichiers de données source. Les données de la Fig. S5 sont incluses dans cet article publié.

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Nous remercions le groupe de recherche Host Septomics d'avoir fourni son installation d'hypoxie et son soutien technique. Nous sommes également reconnaissants à Mahmoud Elbahnasy et Mohamed Balboul pour leur assistance technique et à tous les membres du laboratoire Vylkova pour leurs discussions judicieuses. Ce travail a été soutenu par le ministère allemand de l'éducation et des sciences dans le cadre du programme Unternehmen Region (BMBF 03Z22JN11) et par la Deutsche Forschungsgemeinschaft (CRC/TR 124 FungiNet ; numéro de projet 210879364), projets C2 et Z2.

Financement Open Access activé et organisé par Projekt DEAL.

Centre de recherche sur la septomique, Université Friedrich Schiller et Institut Leibniz pour la recherche sur les produits naturels et la biologie des infections - Institut Hans Knöll, Iéna, Allemagne

Bettina Böttcher, Enrico Garbe, Franziska Gerwien & Slavena Vylkova

BioControl Iéna, Iéna, Allemagne

Dominik Driesch

Microbiologie moléculaire et appliquée, Institut Leibniz pour la recherche sur les produits naturels et la biologie des infections - Institut Hans Knöll, Iéna, Allemagne

Thomas Kruger, Olaf Kniemeyer & Axel A. Brakhage

Département de microbiologie et de biologie moléculaire, Institut de microbiologie, Université Friedrich Schiller, Jena, Allemagne

Axel A. Brakhage

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Concevoir et concevoir les expériences : BB, TK, EG et FG Réaliser les expériences : BB, TK, EG et FG Analyser les données : BB, DD, TK et OK Réactifs/matériels/outils d'analyse : DD, TK, OK, AAB et SV Rédaction de l'article : BB et SV (en consultation avec tous les auteurs).

Correspondance à Slaven Vylkov.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

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Réimpressions et autorisations

Böttcher, B., Driesch, D., Krüger, T. et al. Une mauvaise absorption des acides aminés entraîne un déséquilibre métabolique global des biofilms de Candida albicans. npj Biofilms Microbiomes 8, 78 (2022). https://doi.org/10.1038/s41522-022-00341-9

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Reçu : 24 janvier 2022

Accepté : 23 septembre 2022

Publié: 13 octobre 2022

DOI : https://doi.org/10.1038/s41522-022-00341-9

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