Tryptophane

Rapports scientifiques volume 13, Numéro d'article : 9403 (2023) Citer cet article

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Le virus respiratoire syncytial (VRS) est l'une des principales causes d'infections aiguës graves et même mortelles des voies respiratoires inférieures chez les nourrissons et les personnes âgées. Une neutralisation puissante du VRS a été obtenue par des anticorps qui se lient sélectivement à la forme de préfusion de la protéine virale de fusion (F). Nous avons émis l'hypothèse qu'une neutralisation puissante similaire pourrait être obtenue en utilisant des aptamères ciblant la protéine F. Les aptamères n'ont pas encore atteint leur potentiel de traduction pour la thérapeutique ou le diagnostic en raison de leur courte demi-vie et de la gamme limitée d'interactions cible-aptamère ; ces défauts peuvent cependant être améliorés par l'application de nucléotides porteurs de chaînes latérales de type acide aminé. Dans cette étude, une version stabilisée de la protéine RSV F de préfusion a été ciblée par sélection d'aptamères à l'aide d'une bibliothèque d'oligonucléotides contenant une chaîne latérale de type tryptophane. Ce processus a abouti à des aptamères qui se sont liés à la protéine F avec une haute affinité et ont différencié sa conformation pré- et post-fusion. Les aptamères identifiés ont inhibé l'infection virale des cellules épithéliales pulmonaires. De plus, l'introduction de nucléotides modifiés a prolongé la demi-vie des aptamères. Nos résultats suggèrent que le ciblage des aptamères à la surface des virus pourrait produire des candidats-médicaments efficaces, qui pourraient suivre le rythme des agents pathogènes en constante évolution.

Les maladies respiratoires sont une cause majeure de morbidité et de mortalité chez les jeunes enfants. Le virus respiratoire syncytial (VRS) est le virus respiratoire saisonnier le plus courant, entraînant généralement des symptômes bénins de type rhume chez les nourrissons1 ; cependant, il peut également provoquer des maladies graves des voies respiratoires, en particulier la bronchiolite, l'inflammation des petites voies respiratoires dans les poumons et la pneumonie2. Outre les jeunes enfants, l'infection par le VRS peut entraîner une maladie grave chez les hôtes immunodéprimés et les personnes âgées et a été associée au développement de l'asthme3. Les infections à VRS sont la principale cause d'hospitalisation chez les jeunes nourrissons dans le monde et la deuxième cause de mortalité infantile dans les pays à revenu faible ou intermédiaire4.

Le VRS est un agent pathogène hautement contagieux qui se propage parmi les groupes de jeunes enfants, au sein des familles et entre les patients hospitalisés par contact physique direct, gouttelettes et transmission par aérosol5,6. Les récentes mesures restrictives dues à la pandémie de COVID-19 ont contribué à la perturbation du schéma d'infection saisonnière des virus respiratoires. Cela peut avoir entraîné une augmentation de la population immunologiquement naïve, provoquant des épidémies de VRS plus graves dans le monde7. Actuellement, aucun vaccin homologué n'est disponible pour prévenir les infections par le VRS, alors que de nombreux vaccins candidats sont en cours de développement. Les seules prophylaxies approuvées sont les anticorps monoclonaux dirigés contre la protéine F.

Le RSV est un virus à ARN enveloppé pléomorphe. Sur les 11 protéines codées par le génome du RSV, trois (F, G et SH) sont ancrées dans la membrane et impliquées dans l'entrée du virus. Les deux principales glycoprotéines exposées à la surface G et F sont cruciales pour la fixation et la fusion du virus, respectivement. Il est suggéré que la petite protéine hydrophobe (SH) soit impliquée dans la formation de canaux ioniques (viroporine) pour moduler la cellule infectée ; cependant, la fonction exacte n'est pas entièrement comprise8. La protéine F est indispensable à l'infection de la cellule hôte et sa diversité génétique est faible par rapport à la protéine G9. Ces caractéristiques font de la protéine F une cible rationnelle pour une intervention thérapeutique. La conformation de la protéine F subit des changements significatifs lors de la fusion des membranes, c'est-à-dire que la forme préfusion de la protéine est convertie en F post-fusion. Ce processus peut également se produire spontanément indiquant la métastabilité de la conformation préfusion10. Une multitude d'anticorps humains ont été produits contre la protéine F et il a été prouvé que les variants de liaison au site antigénique Ø spécifiques de la préfusion F possédaient une forte capacité de neutralisation du virus11. Pour faciliter le développement de vaccins, une version stabilisée de la protéine F de préfusion a été créée par conception basée sur la structure12. Cette version mutante de RSV F a maintenu la disponibilité du site antigénique Ø même lorsqu'elle était exposée à des extrêmes de pH, d'osmolalité et de température.

Plus de 200 virus sont capables d'infecter l'homme et nombre d'entre eux sont des agents étiologiques connus de diverses maladies13. En raison du taux de mutation élevé de certains virus, il existe une forte demande pour le développement de nouveaux médicaments capables de bloquer efficacement l'invasion cellulaire ou la réplication des nouvelles souches virales en constante émergence. Bien que la cible principale du développement du vaccin contre le VRS, la protéine F se caractérise par une stabilité génétique relativement élevée, une substitution d'acides aminés qui entraîne l'émergence de souches virales résistantes à la prophylaxie a également été décrite14. Les médicaments antiviraux actuellement disponibles sont dominés par de petites molécules qui se lient spécifiquement aux protéines de surface ou à la machinerie de réplication des virus15. Concernant les thérapeutiques macromoléculaires, il n'existe qu'un seul médicament antiviral à base d'oligonucléotides, qui est utilisé pour traiter les infections à cytomégalovirus et représente la première thérapie antisens approuvée16.

Les aptamères sont des oligonucléotides simple brin qui peuvent se lier à leurs molécules cibles avec une affinité et une spécificité similaires à celles des anticorps. Cependant, la sélection et la synthèse des aptamères ne reposent pas sur des organismes vivants, offrant ainsi des avantages par rapport aux anticorps en termes de temps et de coût de production17. Les virologues ont également réalisé les avantages du processus de sélection relativement rapide et simple des aptamères, le soi-disant SELEX, à l'aube de la science des aptamères. En effet, les tout premiers aptamères publiés ont été générés en utilisant l'ADN polymérase du bactériophage T4 comme molécule cible de sélection18. Depuis lors, un large éventail d'agents pathogènes humains ciblant les aptamères a été décrit19,20. Bien que la majorité des aptamères spécifiques de virus publiés aient été conçus pour des applications de diagnostic et appliqués au développement de biocapteurs, il existe également de nombreux exemples d'aptamères à potentiel antiviral21. Le premier aptamère antiviral a été élevé contre la transcriptase inverse du virus de l'immunodéficience humaine de type 1 (VIH-1) pour inhiber sa réplication22. L'oligonucléotide d'ARN spécifique de la transcriptase inverse a été suivi d'une sélection d'aptamères pour un panel de virus pathogènes humains. Les molécules cibles de ces processus SELEX variaient des protéines de surface et de réplication virales recombinantes aux virus inactivés et aux nanoparticules de type virus et même aux cellules de mammifères exprimant des glycoprotéines virales23,24,25,26.

Les interactions possibles entre les protéines et les oligonucléotides naturels sont limitées en raison de la diversité chimique limitée des nucléobases27. Par conséquent, une série de modifications non naturelles ont été incorporées dans les aptamères pour améliorer l'efficacité du SELEX et augmenter la durabilité des aptamères dans les conditions environnementales et physiologiques dominantes. Pour la sélection d'aptamères modifiés, des bibliothèques d'oligonucléotides de nucléotides non standard ont été créées soit en introduisant directement les nucléotides modifiés lors de la synthèse, soit par l'ajout de nucléotides "cliquables" et la fonctionnalisation post-synthétique par clic-chimie27,28. Selon les composants des nucléotides affectés par la modification, trois grandes catégories, à savoir le sucre, le squelette phosphodiester et les aptamères modifiés par la nucléobase, peuvent être distinguées29. Parmi les nombreux oligonucléotides non naturels appliqués, les soi-disant SOMAmers (aptamères modifiés à vitesse lente, oligonucléotides modifiés par une base en position 5 de la désoxyuridine30), se sont révélés être les candidats les plus prometteurs. Les nucléotides modifiés des SOMAmères contiennent des groupes fonctionnels hydrophobes ou aromatiques à des positions éloignées des sites de liaison hydrogène des nucléobases. L'introduction de ces nucléotides modifiés a considérablement augmenté le taux de réussite de SELEX ; de plus, la plupart des SOMAmers présentent des valeurs de KD sous-nanomolaires améliorées30.

Auparavant, nous avons sélectionné des aptamères en utilisant des particules virales inactivées et avons démontré que les aptamères obtenus se lient spécifiquement à la protéine G du RSV et peuvent être appliqués pour la détection du virus dans des échantillons cliniquement pertinents31. Dans cette étude, nous nous sommes attachés à produire des aptamères à potentiel thérapeutique en appliquant une logique de sélection différente. La molécule cible servant le virus entier a été remplacée par une version stabilisée de la protéine F de préfusion au cours des étapes de sélection et la chaîne latérale de type tryptophane contenant TAdUTP a été introduite dans la bibliothèque d'oligonucléotides de SELEX. Le processus de sélection a abouti à des aptamères capables de se lier à leur protéine cible avec des taux de dissociation nanomolaires ; de plus, ces aptamères pouvaient faire la différence entre la variante pré- et post-fusion de la protéine F. De plus, les meilleurs aptamères se sont avérés inhiber l'infection par le VRS avec une efficacité similaire à celle du palivizumab.

Considérant que l'infection par le VRS peut être prévenue par des anticorps se liant au site antigénique Ø spécifiques de la préfusion F, nous avons émis l'hypothèse qu'un effet similaire pourrait être obtenu par des aptamères sélectifs de la protéine F de la préfusion. Pour produire des aptamères ayant un potentiel thérapeutique pour le VRS, nous avons utilisé une version stabilisée de la protéine F de préfusion et de postfusion comme cibles et contre-cibles de SELEX, respectivement. Pour augmenter l'efficacité de la sélection, nous avons créé un 5-indolyl-AA-dUTP (TAdUTP) possédant une bibliothèque d'oligonucléotides de départ comme détaillé précédemment32. Les pools d'oligonucléotides enrichis de sept cycles SELEX ont été amplifiés par PCR en émulsion et en remplaçant dTTP par TAdUTP. La pression de sélection a été assurée par l'ajout de molécules concurrentes, par exemple, le L-tryptophane, la mucine, la BSA, l'ADN de sperme de saumon au tampon et la diminution de la concentration de la molécule cible et du temps d'incubation dans les cycles SELEX consécutifs. De plus, des étapes de contre-sélection ont été introduites en défiant le pool d'oligonucléotides avec la protéine F post-fusion immobilisée sur des billes pour favoriser les aptamères de sélectivité de conformation préfusion (Fig. 1). Après l'achèvement de l'étape de sélection finale, les séquences nucléotidiques de 96 candidats aptamères ont été déterminées. L'analyse informatique des séquences obtenues a révélé que 10 aptamères étaient présents en plusieurs copies, suggérant un enrichissement d'aptamères modifiés sélectifs potentiels pour le VRS. Bien que la recherche du motif MEME n'ait identifié aucune séquence consensus, le nucléotide modifié et la guanosine étaient surreprésentés par rapport à la cytidine et à l'adénine chez tous les candidats aptamères sélectionnés (Figure S1). Cette découverte suggère la nécessité du nucléotide modifié dans la formation du complexe aptamère-protéine F.

Schémas de génération et de caractérisation d'aptamères sélectifs pour la protéine RSV F. Créé avec BioRender.com.

Théoriquement, les oligonucléotides de liaison à la molécule cible sont enrichis dans des cycles successifs de SELEX. En pratique, le biais de la PCR présente également une pression de sélection sur les oligonucléotides amplifiés ; ainsi, les candidats aptamères isolés ne possèdent pas nécessairement une forte affinité pour la molécule cible17. L'analyse MEME n'a identifié aucun motif commun de l'oligonucléotide sélectionné qui aurait pu suggérer les candidats aptamères les plus propices. Par conséquent, nous avons entrepris de cribler tous les oligonucléotides séquencés par dosage homogène de proximité luminescent amplifié (ALPHA).

À cette fin, nous avons synthétisé des candidats aptamères marqués à la biotine par PCR asymétrique bloquée par amorce (PBA-PCR33) et les avons mélangés avec la forme préfusion de la protéine F et du palivizumab, et un anticorps qui lie à la fois la forme préfusion et postfusion de la protéine F. Les aptamères biotinylés et l'anticorps ont été immobilisés sur des billes AlphaScreen de donneur recouvertes de streptavidine et d'accepteur recouvertes de protéine A, respectivement. Sur les 70 aptamères, presque tous ont montré une liaison à la molécule cible et 14 aptamères ont produit un signal de fluorescence 10 à 50 fois plus élevé lors de la liaison de la forme de préfusion de la protéine F par rapport à la fois à la protéine F et à l'anticorps moins les témoins (Figure S2). Les intensités de fluorescence élevées mesurées ont indiqué le succès de la sélection des aptamères. À noter, bien que plusieurs candidats aptamères possédaient des compositions nucléotidiques presque identiques (voir le fichier de données supplémentaires), ils ont démontré des affinités différentes pour la protéine F. Ces données et l'absence de motif commun d'oligonucléotides suggèrent que des séquences d'acide nucléique uniques sont inévitables pour l'interaction protéine F-aptamère.

Ensuite, la capacité de discrimination de la conformation de la protéine F des 14 aptamères exceptionnels a été étudiée. Nous avons mélangé les aptamères avec la protéine F préfusion ou postfusion à différentes concentrations en appliquant le cadre expérimental décrit ci-dessus. Tous les aptamères analysés ont produit env. Signal de fluorescence relative 2 fois plus élevé lorsqu'il est mélangé avec la forme de préfusion (Fig. 2) que lors de l'incubation avec la forme de postfusion de la protéine F.

Détermination de la capacité des aptamères modifiés à faire la distinction entre la protéine F préfusion et postfusion du RSV par AlphaScreen. Des aptamères marqués à la biotine ont été mélangés avec la forme préfusion ou postfusion de la protéine F et du palivizumab. Le signal AlphaScreen relatif a été calculé en formant un rapport de la fluorescence de l'échantillon et de la fluorescence de fond sans aptamère. Les valeurs accrues indiquent une liaison sélective des aptamères aux différentes formes de protéine F. Les barres d'erreur représentent l'écart type de trois répétitions techniques.

Pour analyser la cinétique de liaison de la formation du complexe aptamère-protéine, nous avons appliqué la thermophorèse à micro-échelle (MST), une méthode généralement utilisée pour l'analyse des interactions entre les biomolécules en solution. Dans les expériences MST, la concentration de la plus petite molécule marquée par fluorescence a été maintenue constante, tandis qu'une dilution en série du plus grand partenaire d'interaction non marqué a été ajoutée au mélange.

Les données obtenues ont montré une variabilité dans les valeurs de KD de différents complexes aptamère-protéine F. Certains des aptamères se sont liés à leur cible avec une faible constante de dissociation μM (B1, C2, F5, G6 et H8), tandis que la majorité d'entre eux présentaient des valeurs inférieures au μM, et les candidats les plus éminents formaient des complexes aptamère-protéine F de préfusion qui possédaient quelques constantes de dissociation à 100 nM (A2, D4, H9). Il convient de noter que tous les aptamères étudiés ont démontré une affinité beaucoup plus forte pour la forme de préfusion que pour la forme de postfusion de la protéine cible, ce qui implique l'efficacité des étapes de contre-sélection de SELEX (tableau S1).

Il peut sembler contradictoire que les résultats des mesures AlphaScreen et MST ne soient pas en parfaite harmonie, c'est-à-dire que les aptamères produisant le signal AlphaScreen le plus élevé ne possédaient pas systématiquement les valeurs KD les plus basses. Cependant, ce phénomène n'était pas tout à fait inattendu et pourrait s'expliquer par les différences inhérentes aux deux méthodes caractérisant l'interaction. AlphaScreen nécessite l'immobilisation des partenaires d'interaction, tandis que MST détermine l'interaction entre deux partenaires en solution libre.

Afin de démontrer la spécificité des candidats aptamères les plus prometteurs (A2, B1, D4, G6, H8, H9), nous avons entrepris de mesurer leur interaction putative avec diverses protéines de virus pathogènes humains, à savoir la protéine de fusion du métapneumovirus humain (MPV, variante v3B)34, protéine de fusion du virus parainfluenza humain de type 3 (PIV3, Q162C-L168C, I213C-G230C, A463V, variante I474Y)35, protéine de pointe du SARS-CoV-2 (variante S-2P)36, protéine hémagglutinine H1 de la grippe (S106 DS26r)37 à l'aide de MST. Les données collectées (Figure S3, Tableau S2) ont démontré la sélectivité de nos aptamères. Il convient de noter que bien que la protéine de pointe SARS-CoV-2 et notre protéine cible possèdent une faible homologie de séquence d'acides aminés, l'aptamère A2 se lie également à la protéine de pointe avec une constante de dissociation nanomolaire. Il serait intéressant de tester si cet aptamère pourrait atténuer l'infectiosité du SARS-CoV-2.

L'application d'aptamères est fréquemment entravée par des nucléases omniprésentes. Par conséquent, nous avons évalué la durabilité de notre aptamère contenant des nucléotides modifiés en le défiant avec une lignée de cellules épithéliales pulmonaires. Les cellules A549 ont été incubées soit avec l'aptamère D4, soit avec son variant dans lequel TAdUTP a été remplacé par dUTP, et la concentration des oligonucléotides a été déterminée par PCR en temps réel (Fig. 3). Le calcul des quantités relatives des oligonucléotides a clairement démontré une stabilité élevée de l'aptamère D4 modifié. Environ un tiers de l'aptamère modifié était présent même après 24 h d'incubation, alors que seulement quelques pour cent de la concentration d'origine étaient détectables dans le cas de TAdUTP dépourvu d'oligonucléotide. La demi-vie calculée des deux oligonucléotides a également confirmé les différences de stabilité observées, c'est-à-dire qu'atteindre la moitié de la concentration d'aptamère modifiée d'origine a pris 12,7 h, soit environ huit fois plus longtemps que celles observées avec le nucléotide non modifié possédant des oligonucléotides. Ces données suggèrent que les aptamères avec TAdUTP pourraient résister aux conditions dominantes de la culture de cellules épithéliales pulmonaires pendant de nombreuses heures.

La stabilité d'un aptamère modifié et non modifié a été démontrée en incubant des cellules A549 avec un milieu de croissance infusé d'aptamère. La concentration d'oligonucléotides a été déterminée par PCR en temps réel aux moments indiqués. La dégradation des aptamères était remarquablement différente, l'aptamère modifié semble posséder env. Demi-vie 8 fois plus longue par rapport à sa variante non modifiée. Les barres d'erreur représentent l'écart type de trois expériences individuelles (N = 3).

Suite à la caractérisation in vitro des aptamères sélectionnés, nous nous sommes lancés dans l'étude de leur potentiel d'inhibition de l'infection virale. Le RSV exprimant la protéine fluorescente verte recombinante (GFP) (rgRSV) porte le gène GFP avant le génome complet du RSV, de sorte que l'infection est facilement traçable en mesurant la fluorescence des cellules exposées au virus38. Tout d'abord, pour déterminer les conditions expérimentales optimales, une monocouche de cellules A549 a été infectée par le RSV recombinant exprimant la protéine fluorescente verte (rgRSV) et l'intensité de fluorescence a été mesurée pendant 72 h. Les données obtenues ont montré que le signal culminait à 48 h ; ainsi, ce temps d'incubation a été appliqué dans les expériences qui ont suivi (Figure S4). Dans ces conditions de traitement, les aptamères modifiés sont restés relativement intacts par opposition aux aptamères non modifiés (Fig. 3).

Ensuite, nous avons choisi 6 aptamères pour les études d'inhibition virale, deux d'entre eux, D4 et H9, étaient parmi les plus performants à la fois dans les mesures AlphaScreen et MST ; A2 et G6 étaient exceptionnels selon les études AlphaScreen et MST, respectivement ; B1 et H8 ont été sélectionnés au hasard parmi les 14 aptamères précédemment analysés (Figure S6). Le RgRSV a été préincubé avec du palivizumab ou des aptamères et ajouté aux cellules A549. Après l'élimination du rgRSV et le lavage des cellules, le signal de fluorescence généré par les cellules infectées par le virus a été déterminé pendant 48 h. Les échantillons préincubés de palivizumab et d'aptamère modifié ont montré une forte diminution du signal de fluorescence par rapport aux échantillons témoins sans palivizumab ni aptamère. Il est important de noter que les mélanges de rgRSV préincubés contenant des nucléotides non pertinents ou non modifiés (tableau S3) ont produit une intensité de fluorescence similaire à celle des témoins sans anticorps ni aptamère (figure 4A). Pour mieux évaluer l'effet antiviral des aptamères, l'aire sous la courbe (ASC) a été calculée à partir des courbes de croissance obtenues, et elle a suggéré une diminution d'au moins 50 % de l'infection lors du traitement des cellules avec du palivizumab ou du rgRSV préincubé avec l'aptamère (Fig. 4B). Pour fournir des preuves supplémentaires de la réduction de l'infection virale, nous avons appliqué une approche méthodologique très différente, c'est-à-dire la mesure de la quantité d'ARN viral par rt-qPCR. Bien que la diminution de la concentration d'ARN viral ait été moins significative que celle du niveau de GFP en présence d'aptamères, les données fournies par la rt-qPCR étaient de concert avec les calculs de l'AUC corroborant ainsi l'effet inhibiteur des aptamères sur l'infection par le VRS (Fig. 4C).

Les aptamères modifiés présentent un effet antiviral sur l'infection par le VRS. La fluorescence totale (TF) a été mesurée sur la culture cellulaire A549 infectée par le rgRSV (MOI de 1). Le palivizumab ou les aptamères (A2, B1, D4, G6, H8, H9, aptamères non modifiés et non pertinents) ont été pré-incubés avec le rgRSV avant l'infection. (A) Le TF inférieur est mesuré lorsque le rgRSV est prétraité avec des aptamères modifiés ou du palivizumab par rapport à l'infection par le RSV traité par simulation. L'aptamère non modifié ou un aptamère non pertinent a eu un effet marginal sur la neutralisation du virus. (B) L'aire sous la courbe (AUC) a été calculée, la moyenne et les écarts-types de trois répétitions sont indiqués. (C) La Rt-qPCR de l'ARN viral (réalisée 48 h après l'infection) dans les cellules A549 infectées vérifie l'effet antiviral des aptamères modifiés (D, G). Les candidats aptamères les plus prometteurs, D4 et H9, présentent la capacité de neutralisation virale la plus élevée. (E, H) Pourcentage d'inhibition (calculé à partir de l'ASC) par rapport au contrôle rgRSV traité par simulation. L'infection à RgRSV est réduite par le palivizumab et D4 ou H9 d'une manière très similaire et dépendante de la concentration. Les barres d'erreur indiquent l'écart type de trois expériences individuelles (N = 3), les lignes pointillées indiquent une inhibition de 50 %. (F, I) La réduction de la quantité de génome viral détectée dans les cellules A549 infectées signifie également l'effet antiviral des aptamères modifiés. Les valeurs P ont été calculées à l'aide d'un test t non apparié en comparant le groupe « VRS uniquement » aux autres groupes (*P < 0,05, **P < 0,005, ***P < 0,001, ****P < 0,0001, ns = non significatif).

Après avoir démontré que notre protocole SELEX entraînait des aptamères modifiés capables de restreindre efficacement l'infection par le VRS à des concentrations nM, nous avons entrepris d'autres études sur les aptamères exceptionnels. Un test dose-réponse a été réalisé avec une série de concentrations d'aptamères qui ont également bien fonctionné à la fois en ALPHA et en MST (D4 et H9). La diminution dose-dépendante des courbes de croissance du rgRSV dans les échantillons qui ont été préincubés avec les aptamères modifiés a montré que D4 et H9 protègent efficacement contre l'infection par le rgRSV. Les valeurs de la concentration inhibitrice semi-maximale (CI50) des deux aptamères étaient comparables à celles du palivizumab ; ils sont tombés dans la gamme nanomolaire basse (Fig. 4 D, E, F et G, H, I). La dose-réponse des quatre autres aptamères et des versions non modifiées de D4 et H9 a également été étudiée (Figure S7). Fait intéressant, l'aptamère G6, qui produisait le signal le plus élevé dans AlphaScreen mais possédait une faible affinité selon la mesure MST, présentait également une propriété de neutralisation virale similaire à celle du palivizumab.

Enfin, compte tenu de l'effet cytopathologique le plus frappant de l'infection par le VRS, nous avons examiné la formation de syncytia des cellules A549. Les observations de microscopie optique et à fluorescence ont également confirmé les résultats ci-dessus puisque la formation de syncytia a été également réduite dans les puits où le rgRSV a été préincubé soit avec du palivizumab, soit avec des aptamères D4 et H9 (Figure S8). Au total, l'effet inhibiteur du VRS d'aptamères sélectionnés a été démontré avec des approches nettement différentes.

Compte tenu du potentiel thérapeutique des aptamères, nous avons entrepris de tester la cytotoxicité putative des aptamères modifiés. Les cellules A549 ont été incubées avec divers aptamères modifiés, non modifiés et du palivizumab à une concentration de 10 nM pendant 48 h et leur viabilité a été évaluée par une approche à base de résazurine. Les mesures de fluorescence ont montré que ni le palivizumab ni aucun des aptamères n'avaient d'influence détectable sur la viabilité cellulaire (Fig. 5A). Pour déterminer la concentration de cytotoxicité à 50 % (CC50), les cellules A549 ont été traitées avec une gamme de dilution de l'un des candidats aptamère les plus prometteurs (D4) et un aptamère non pertinent. Selon les données obtenues, aucun changement significatif de viabilité n'a été détecté même à la concentration la plus élevée appliquée de 50 nM (Fig. 5B). Ces résultats indiquent que la cytotoxicité ne devrait pas entraver l'application thérapeutique des aptamères modifiés.

(A) Viabilité des cellules A549 traitées avec des aptamères et du palivizumab. Les cellules ont été incubées avec 10 nM d'aptamères ou de palivizumab pendant 48 h, puis leur viabilité a été évaluée. Ni le palivizumab, ni aucun des aptamères n'ont eu d'effet néfaste significatif sur la viabilité cellulaire après 48 h. (B) Effet dose-dépendant de l'un des candidats aptamères modifiés les plus prometteurs et d'un aptamère non pertinent sur la viabilité des cellules A549. Les cellules ont été incubées avec 50, 25 et 10 nM d'aptamère modifié ou d'aptamère non pertinent pendant 48 h, puis leur viabilité a été évaluée. Ni l'aptamère modifié, ni l'aptamère non pertinent n'ont eu d'effet néfaste sur la viabilité cellulaire après 48 h. Les barres d'erreur indiquent l'écart type de trois expériences individuelles (N = 3).

Bien qu'une batterie d'aptamères sélectifs de virus ait été générée, seule une minorité d'entre eux contiennent des nucléotides modifiés et seuls deux d'entre eux ont été testés en tant que candidats médicaments potentiels. Les deux sont des aptamères d'ARN et des modifications 2'-hydroxyle, -fluoro et -méthyle ont été appliquées pour augmenter leur résistance aux nucléases. Une autre caractéristique commune de ces aptamères est que les deux ciblent des enzymes internes spécifiques (non exposées) du virus de l'hépatite C et du virus de l'encéphalite japonaise, c'est-à-dire la réplicase NS5B et la méthyltransférase, respectivement19,39. La conséquence du ciblage de protéines qui ne sont pas exposées en surface et uniquement exprimées de manière intracellulaire est l'exigence d'internalisation des aptamères dans les cellules pour bloquer la réplication du virus. En effet, ces aptamères ont été entraînés dans les cellules soit par transfection à base de lipofectamine soit par conjugaison au cholestérol.

Nous considérons que l'application thérapeutique des aptamères de liaison aux protéines de surface du virus est plus simple et potentiellement plus efficace ; par conséquent, une variante stabilisée de la protéine F de préfusion a été utilisée comme cible de SELEX. Pour augmenter le taux de réussite de la sélection et de la durabilité des aptamères dans des conditions physiologiques, une bibliothèque d'oligonucléotides d'ADN à base modifiée avec des chaînes latérales de type tryptophane a été utilisée à chaque étape de la procédure SELEX. De plus, étant donné que les anticorps neutralisants du VRS les plus efficaces sont connus pour se lier aux sites antigéniques spécifiques de la préfusion F, la forme post-fusion de la protéine F a été utilisée soit comme compétiteur dans la phase de liaison de la sélection, soit comme cible immobilisée des étapes de contre-sélection. L'application du nucléotide modifié et la contre-sélection stringente ont donné des aptamères qui favorisent la préfusion par rapport à la forme post-fusion de la protéine F. On s'attend donc à ce qu'ils aient une capacité accrue d'inhibition de l'infection virale. Fait intéressant, le nucléotide modifié a été enrichi dans tous les aptamères étudiés, ce qui laisse entendre l'importance du groupe indolyle rendu hydrophobe dans la formation du complexe aptamère-protéine. Vraisemblablement, les nucléotides modifiés ont permis l'interaction entre l'aptamère et l'étirement d'acides aminés hydrophobes du site antigénique spécifique de préfusion F Ø.

Le séquençage de Sanger et l'analyse in silico des oligonucléotides obtenus par SELEX ont abouti à l'identification d'un panel de singletons et de séquences d'acides nucléiques qui étaient présents en trois copies mais aucun motif commun des oligonucléotides n'a pu être identifié. Étant donné que l'analyse informatique n'a pas fourni de données évidentes pour guider l'identification des candidats aptamères les plus prometteurs, tous les oligonucléotides identifiés ont été examinés par des méthodes in vitro. Deux tests homogènes généralement à effet de levier, ALPHA et MST, ont été appliqués pour le criblage et la détermination de l'affinité des oligonucléotides, respectivement. Les deux approches ont fourni des résultats partiellement contradictoires, c'est-à-dire que les meilleurs performeurs des mesures ALPHA n'étaient pas identiques aux plus faibles KD possédant des aptamères. Ce phénomène n'est cependant pas sans précédent ; il a été décrit que les diverses méthodes pourraient fournir des résultats différents pour les mêmes interactions moléculaires40. Ces résultats soulignent l'importance d'appliquer différentes méthodes pour l'identification des principaux candidats aptamères.

Le criblage et la caractérisation in vitro des oligonucléotides sélectionnés est une étape cruciale de la génération d'aptamères, mais les données fournies par ces approches doivent être manipulées avec prudence. L'analyse du potentiel inhibiteur du virus des six aptamères a démontré que la capacité de blocage de l'infection virale des aptamères n'est pas nécessairement proportionnelle aux données AlphaScreen ou MST. Selon la fluorescence générée par l'infection virale, tous les aptamères étudiés préviennent l'infection virale avec une efficacité comparable. Ces données ont également été étayées par des mesures de quantification du génome viral par RT-qPCR ; cependant, la différence entre les échantillons n'était pas si évidente.

Cette différence étonnamment modeste des niveaux d'ARN viral dans les échantillons traités par aptamère par rapport aux échantillons non traités pourrait s'expliquer par la longue durée d'incubation des expériences présentées. La libération du virus de la descendance commence 10 à 12 h après l'infection, culmine à 24 h et persiste jusqu'à ce que les cellules se détériorent en 30 à 48 h41 Dans les expériences présentées, les virus ont été lavés après 1,5 h d'incubation ; ainsi, les descendances des premiers virus infectants pourraient envahir les cellules en l'absence d'aptamères. Par conséquent, les données RT-qPCR qui ont été générées à partir d'échantillons de 48 h indiquent le nombre viral résultant de jusqu'à quatre cycles de réplication. D'autre part, il a été démontré que les cellules transfectées par GFP diminuent leur intensité de fluorescence lors de l'apoptose et de la nécrose, résultats attendus des temps d'incubation à long terme42. Il serait instructif de voir si l'infection secondaire peut être limitée si la culture cellulaire est complétée par des aptamères.

Les tests dose-réponse mis en œuvre ont démontré que les faibles valeurs nanomolaires de concentration inhibitrice demi-maximale de nos aptamères sont comparables à celles du palivizumab. Ces données nous ont encouragés à étudier les attributs des aptamères qui pourraient entraver leur application thérapeutique. Il a été décrit que des oligonucléotides composés de phosphorothioate et de nucléotide modifié en 2' fluoro pourraient entraîner la mort cellulaire en déclenchant la voie p5343,44. Notre analyse n'a montré aucune cytotoxicité des aptamères même après 48 h d'incubation à dix fois la concentration d'oligonucléotide IC50. Bien que nous n'ayons pas étudié l'activation des voies apoptotiques, ces résultats indiquent que les oligonucléotides modifiés par TAdUTP n'ont pas d'effets néfastes sur les cellules.

Un autre goulot d'étranglement de l'application clinique des aptamères est leur sensibilité aux nucléases. Il a déjà été rapporté que l'incorporation de modifications hydrophobes en position 5 des nucléotides pyrimidiques confère une augmentation substantielle de la résistance à la dégradation dans le plasma humain45. Nos résultats sont conformes à ces constatations; l'introduction du groupe indolyle en position 5 du dUTP a entraîné une demi-vie environ huit fois plus longue de l'oligonucléotide dans la culture de cellules épithéliales pulmonaires. Il convient de noter que nos oligonucléotides étudiés n'étaient pas protégés contre les exonucléases ; par conséquent, un simple coiffage en 3' tel que l'ajout d'un nucléotide inversé devrait améliorer davantage la stabilité des aptamères modifiés par TAdUTP.

Nous pensons que les résultats présentés témoignent que la protéine de surface du virus ciblant les aptamères modifiés pourrait produire des candidats-médicaments efficaces et rentables, qui pourraient suivre le rythme des virus pathogènes en constante évolution.

Le nucléotide modifié, 5-[(3-indolyl)propionamide-N-allyl]-2'-désoxyuridine-5'-triphosphate (TAdUTP) et CleanAmp dATP, dCTP et dGTP ont été achetés auprès de TriLink. Pour générer la bibliothèque modifiée par tryptamino, une réaction PCR en émulsion eau dans l'huile a été mise en place en utilisant 1 × tampon de réaction KOD XL, mélange de dNTP 0,2 mM (contenant dATP, dCTP, dCTP, TAdUTP à une concentration de 2,5 mM chacun), 2,5 U de KOD XL, concentrations finales d'amorce et de matrice de 40 μM et 200 nM, respectivement. Le mélange PCR a été émulsifié selon le protocole du fabricant (Micellula DNA Emulsion & Purification Kit (Roboklon)). Les produits de PCR de l'émulsion ont été récupérés à l'aide du kit OligoClean & Concentrator (ZymoResearch) selon le protocole du fabricant. Les amorces et les oligonucléotides appliqués ont été synthétisés par IBA, les séquences détaillées peuvent être trouvées dans le tableau S1. Les conditions d'amplification étaient : 3 min de dénaturation à 95 °C, 7 cycles de 95 °C pendant 30 s, 60 °C pendant 5 s, 72 °C pendant 30 s et une extension finale à 72 °C pendant 3 min. Les produits de PCR ont été analysés par électrophorèse sur gel de polyacrylamide à 10% et 1 μL de GeneRuler Low Range DNA Ladder a été utilisé comme marqueur de poids moléculaire.

Les formes de préfusion (DS-Cav1) et de postfusion du RSV F trimérique ont été produites par transfection transitoire et purifiées par chromatographie conventionnelle comme décrit précédemment10. Dans les deux cas, l'étape finale de chromatographie d'exclusion de taille a été utilisée pour assurer l'homogénéité trimérique de la protéine F.

Les conditions SELEX appliquées pour la génération d'aptamères sélectifs de la protéine RSV F sont décrites dans le fichier de données supplémentaires selon les directives MAPS46. En bref, la forme stabilisée de la protéine F préfusion ("DS-Cav1") et postfusion a été utilisée comme cibles et cibles négatives de SELEX, respectivement. 5,7 mg de billes du kit de démarrage MACSflex™ MicroBead (Miltenyi Biotec) ont été reconstitués dans 257 μl de tampon de reconstitution. Cette perle a été modifiée en utilisant 15 μg de protéine F préfusion ou postfusion dans 25 μl de tampon MES par incubation O/N à 4 ° C. Le succès de l'immobilisation a été déterminé par SDS-PAGE et coloration au bleu de Coommassie.

Une sélection d'aptamères a été effectuée pour générer des aptamères sélectifs de la protéine RSV F en utilisant la chaîne latérale de type tryptophane générée contenant la bibliothèque d'aptamères. Les SELEX des aptamères modifiés spécifiques du RSV F ont été obtenus par 7 cycles itératifs avec une pression de sélection croissante. La bibliothèque d'oligonucléotides modifiés a été chauffée à 95 ° C pendant 5 min et immédiatement refroidie sur de la glace. Tout d'abord, env. 1 nmole de la bibliothèque d'oligonucléotides a été incubée avec des billes de Miltenyi non modifiées dans un tampon de sélection (10 mg/L de BSA, 0,02 % de Tween 20, 1 mg/L d'ADN de sperme de saumon, 10 mg/L de mucine dans du PBS) pendant 60 min à l'aide d'un tampon doux. agitation pour exclure les oligonucléotides de liaison aux billes et à la mucine. Les billes modifiées par la protéine F ont été incubées avec le surnageant de l'étape précédente pendant 30 min, puis lavées avec 2 × 1000 μl de PBS, puis isolées du pool d'ADN par élution alcaline et neutralisation des oligonucléotides liés à la protéine F. Une PCR en émulsion eau-dans-huile a été réalisée pour amplifier les séquences liées à l'aide du kit Micellula DNA Emulsion & Purification Kit (Roboklon). Le mélange PCR contenait KOD XL 1 × tampon de réaction, 0,025 U/µl de polymérase KOD XL (Toyobo) 0,4 à 0,4 μM d'amorces directes et inverses biotinylées non étiquetées de la bibliothèque L8, et 0,1 mM chaque CleanAmp dATP, dGTP, dCTP mélangé avec TAdUTP dans 50 µl. Les produits de PCR de l'émulsion ont été récupérés à l'aide du kit OligoClean & Concentrator (ZymoResearch) selon le protocole du fabricant. Les conditions d'amplification étaient : 3 min à 94 °C, 25 cycles de 94 °C pendant 30 s, 60 °C pendant 5 s, 74 °C pendant 30 s et 74 °C pendant 5 min après le dernier cycle. Le succès de l'amplification a été contrôlé par électrophorèse sur gel de polyacrylamide à 10 % et coloration avec un colorant ADN GelGreen (Biotium).

Pour la régénération de l'ADNsb par dénaturation alcaline, le produit de PCR a été couplé à 25 µl de billes paramagnétiques revêtues de streptavidine (Dynabeads Streptavidin, M-280, Thermo Scientific) pendant 15 min et lavé avec 3 × 1000 µl de PBS. Les brins non biotinylés ont été séparés du brin complémentaire immobilisé par une incubation de 10 min avec 50 μl de NaOH 20 mM frais. L'ADNsb élué a été immédiatement neutralisé par addition de 7,5 µl de NaH2PO4 200 mM. Dans les cycles de sélection suivants, la forme postfusion de la protéine F a été utilisée soit couplée à des billes paramagnétiques comme molécule contre-cible (dans les cycles n° 4, 6 et 7), soit le tampon de sélection a été complété par un excès de F postfusion. (5 à 10 fois plus que la forme de préfusion aux cycles 2, 3, 5 et 7). Pour augmenter encore la pression de sélection, les conditions d'incubation et les étapes de lavage ont été modifiées. Aux cycles 4, 5, 6, 7, le temps d'incubation a été réduit à 25, 20 et 15 min, respectivement. Au troisième tour, une étape de lavage supplémentaire avec 1 ml de sulfate de dextrane 0,15 mM dans du PBS (pH 7,4) a également été introduite, au quatrième tour, les séquences liées ont été provoquées en lavant les billes avec 1 ml de L-tryptophane 18 μM solution aussi. Dans le tour de sélection final, le temps d'incubation était de 15 min et les billes ont été lavées deux fois avec 1 ml de solution de sulfate de dextrane 0, 3 mM, deux fois avec 1 ml de solution de L-tryptophane 18 μM et deux fois avec une solution de PBS. Le produit de PCR de la dernière étape de sélection a été inséré dans un vecteur de clonage (Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kit, Thermo Fischer Scientific) et transformé dans des cellules E. coli One Shot™ TOP10 Chemically Competent (Invitrogen). 130 des colonies ont été analysées par PCR de colonie (à l'aide d'un ensemble d'amorces M13, tableau S1) et électrophorèse capillaire (LabChip GX, PerkinElmer) à l'aide du kit de réactifs ADN 1 K avec une puce unique ADN HT 5 K LabChip. Pour ce dernier, les produits PCR de la colonie ont été dilués 40x dans du tampon TE. Les séquences des produits de PCR de colonie de taille correcte ont été déterminées par séquençage Sanger.

AlphaScreen nécessite des aptamères biotinylés qui ont été générés par PBA-PCR (Primer Blocked Asymmetric PCR). Le mélange PCR de 25 μl contenait du tampon de réaction KOD XL 1 ×, 0,025 U/µl de polymérase KOD XL, 0,5 μM d'amorce directe biotinylée, 25 nM d'amorce inverse non étiquetée, 475 nM d'amorce inverse 3'-P, 0,2 mM chacun de CleanAmp dATP, dGTP, dCTP mélangé avec TAdUTP, 0,5 μl de matrice PCR de colonie diluée 40 ×. Les conditions d'amplification étaient : 3 min à 94 °C, 45 cycles de 94 °C pendant 30 s, 60 °C pendant 5 s, 74 °C pendant 30 s et 74 °C pendant 5 min après le dernier cycle. Après PCR, le complément de l'amorce inverse a été ajouté à une concentration de 5 μM, le mélange a été chauffé à 95 ° C pendant 10 min.

Des aptamères modifiés et non modifiés marqués au Cy5 ont été générés pour les tests de neutralisation de MST et de virus. Pour les aptamères modifiés, le mélange PCR de 50 μl contenait du tampon de réaction KOD XL 1 ×, 2 U de polymérase KOD XL, 1 μM d'amorce directe marquée au Cy5 et d'amorce inverse marquée à la biotine, 0,2 mM chacun CleanAmp dATP, dGTP, dCTP mélangés avec TAdUTP, 0,5 μl de matrice PCR de colonie diluée 40 ×. Pour les aptamères non modifiés, un mélange de dUTP (Bioline), contenant du dATP, du dGTP, du dCTP et du dUTP, a été utilisé comme substrat pour la réaction. Les conditions d'amplification étaient : 3 min à 94 °C, 30 cycles de 94 °C pendant 30 s, 60 °C pendant 5 s, 74 °C pendant 30 s et 74 °C pendant 5 min après le dernier cycle. L'ADN simple brin a été régénéré en utilisant une dénaturation akali comme décrit dans "Sélection d'aptamères modifiés sélectifs pour la protéine RSV F".

Le succès de l'amplification a été contrôlé par électrophorèse sur gel de polyacrylamide à 10 % et coloration avec le colorant ADN GelGreen.

Les tests d'interaction ont été effectués à l'aide d'Optiplates blanches à 384 puits (PerkinElmer) dans un volume total de 18 μl à l'aide de perles accepteur de protéine A et de donneur de streptavidine (PerkinElmer). Des quantités variables de la forme préfusion et postfusion de la protéine RSV F dans du PBS additionné de mucine (10 mg/L), de BSA (1 mg/ml) et d'ADN de sperme de saumon (1 mg/L) ont été incubées avec une concentration finale de 10 nM de aptamère biotinylé modifié et anticorps sélectif de la protéine F (Palivizumab, AstraZeneca). Après 20 min d'incubation à température ambiante, les billes accepteur et donneur ont été ajoutées à des concentrations finales de 20 mg/L en deux étapes. Tout d'abord, les billes acceptrices de protéine A ont été ajoutées et incubées pendant 30 min à température ambiante, puis elles ont été suivies de l'ajout de billes donneuses de streptavidine et d'une incubation supplémentaire de 30 min. Le signal fluorescent a été détecté à l'aide d'un lecteur de plaques multimarqueurs EnSpire (PerkinElmer).

10, 15 ou 20 nM d'aptamères marqués au Cy5 ont été mélangés avec une dilution en série de 16 fois, 1:1 de protéine (protéine de fusion du métapneumovirus humain (MPV, variante v3B), protéine de fusion du virus parainfluenza humain de type 3 (PIV3, Q162C- L168C, I213C-G230C, A463V, variante I474Y), protéine de pointe du SRAS-CoV-2 (variante S-2P), protéine hémagglutinine de la grippe H1 (S106 DS26r).Tous les mélanges ont été préparés dans du Tween 20 à 0,05 % dans du PBS et la mesure a été réalisée dans des capillaires standard Monolith NT™ (NanoTemper Technologies) La puissance d'excitation et la puissance MST de l'instrument de thermophorèse Microscale (Monolith NT.115, NanoTemper Technologies) ont été réglées à 50 % et 20 %, respectivement, la température a été réglée à 25 °C Toutes les données obtenues ont été analysées à l'aide du logiciel MO.Affinity Analysis v2.3 (NanoTemper Technologies), où les constantes de dissociation ont été calculées à partir de la courbe ajustée en utilisant la cinétique de Michaelis – Menten.

Les cellules A549 ont été cultivées dans un milieu complet constitué de MEM de Dulbecco (Gibco) modifié avec 10 % de FBS (Gibco) et 1 % de PenStrep (Gibco). Les cellules confluentes ont été séparées tous les 3 ou 4 jours. RgRSV(224) a été cultivé comme décrit ailleurs28.

Les cellules A549 ont été ensemencées dans une plaque à fond transparent noir à 96 puits à 2, 5 × 104 cellules / puits dans du DMEM (10% FCS, 1% PenStrep (Gibco)) et cultivées à 37 ° C, 5% CO2. 24 h après l'ensemencement, les cellules ont été lavées deux fois avec du PBS stérile et infectées avec du rgRSV(224) à une multiplicité d'infection (MOI) de 1. Des dilutions ont été préalablement faites à partir de rgRSV dans du DMEM (1 % PenStrep, sans FCS), palivizumab et les aptamères sont ajoutés à une concentration finale de 1, 2,5, 5 ou 10 nM. La pré-incubation des agents antiviraux et du RSV a été effectuée pendant 1,5 h à 37 °C, 5 % de CO2. Avant l'infection, les cellules A549 ont été lavées 2 fois avec 100 ul de PBS, les échantillons pré-incubés ont été ajoutés et le mélange a été incubé pendant 1,5 h à 37 °C, 5 % de CO2. Les cellules infectées ont été lavées 2 fois avec du PBS, puis 100 pl de DMEM (10 % FCS, 1 % PenStrep) ont été ajoutés à chaque puits. Chaque traitement a été réalisé en triple. La plaque a été transférée dans la chambre humide d'un lecteur de plaque fluorescente (Tecan Spark) et la mesure de la fluorescence générée a été effectuée pendant 48 h à 37 ° C, 5 % de CO2. Les cellules infectées ont également été imagées par microscopie à fluorescence (microscope à fluorescence inversé Leica DMIL LED, objectif 20 ×). Les cellules ont ensuite été lysées avec le réactif de préparation d'échantillons iScriptTM RT-qPCR conformément au protocole du fabricant.

La transcription inverse du génome viral dans les lysats cellulaires a été réalisée à l'aide d'iScript™ Reverse Transcription Supermix pour RT-qPCR. Ensuite, la qPCR de l'ADNc a été réalisée à l'aide d'un ensemble d'amorces pour le gène N de RSV47 et ACTB (Applied Biosystems, TaqMan Assay ID : Hs99999903_m1) en tant que gène de ménage, mélangé avec et SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix ou SsoAdvanced Universal Probe Supermix et mesuré par le système de PCR en temps réel CFX. Les conditions de cycle QPCR étaient les suivantes : 95 °C pendant 3 min, 50 cycles de 95 °C pendant 10 s, 60 °C pendant 20 s ; suivie d'une analyse de la courbe de fusion. Les données ont été analysées à l'aide de CFX Maestro (BioRad).

Les cellules A549 ont été ensemencées dans une plaque à fond transparent noir à 96 puits à 2, 5 × 104 cellules / puits dans du DMEM (10% FCS, 1% PenStrep (Gibco)) et cultivées à 37 ° C, 5% CO2. 24 h après l'ensemencement, les cellules ont été traitées avec une série de dilutions d'aptamères modifiés. Les cellules traitées avec du PBS ont été utilisées comme contrôle négatif. Après 48 h, la viabilité cellulaire a été évaluée à l'aide du kit CellTiter Blue (Promega) selon les instructions du fabricant. La fluorescence a été détectée sur le Spark Plate Reader (Tecan).

Les cellules A549 ont été ensemencées dans une plaque à fond transparent noir à 96 puits à 2, 5 × 104 cellules / puits dans du DMEM (10% FCS, 1% PenStrep (Gibco)) et cultivées à 37 ° C, 5% CO2. 24 h après l'ensemencement, les cellules ont été lavées deux fois avec du PBS stérile. Du DMEM (10% FCS, 1% PenStrep) a été mélangé avec les aptamères à la concentration finale de 10 nM et ajouté aux cellules A549. Des échantillons ont été prélevés du surnageant des cellules après 0 h, 0,5 h, 1 h, 2 h, 4 h, 8 h et 24 h d'incubation, puis immédiatement congelés dans de l'azote liquide. Ensuite, la qPCR a été réalisée à l'aide du système QuantStudio 12 K Flex PCR. Le mélange PCR de 10 μl consistait en 0,4 μl de 10 μM d'amorces inverse et directe non marquées chacune, 5 μl de qPCRBIO SyGreen Mix Lo-ROX (PCR Biosystems), 2 μl d'échantillon, 2,2 μl d'eau sans nucléase. Les conditions de réaction de la qPCR en temps réel étaient les suivantes : dénaturation initiale pendant 2 min à 95 °C, suivie de 40 cycles de dénaturation pendant 5 s à 95 °C, annelage pendant 20 s à 60 °C. L'analyse de la courbe de fusion a été effectuée de 60 °C à 95 °C.

Tous les graphiques ont été tracés et des analyses statistiques ont été effectuées à l'aide de GraphPad Prism (version 9.1.2.). Les graphiques représentent la moyenne de trois répétitions ± écart type. Les valeurs P ont été calculées à l'aide d'un test t non apparié (*P < 0,05, **P < 0,005, ***P < 0,001, ****P < 0,0001, ns = non significatif). L'aire sous la courbe (AUC) a été calculée à l'aide de l'intensité de fluorescence obtenue 0 à 30 h après l'infection. Le pourcentage d'inhibition a été calculé à l'aide de la formule suivante : (1—(ASC de l'échantillon / ASC des cellules infectées par le rgRSV traité par simulation)) × 100. La concentration inhibitrice d'aptamères qui a réduit les niveaux viraux de 50 % (IC50) a été estimée par ajustement d'une courbe non linéaire de pente variable au pourcentage d'inhibition des échantillons.

Les données sous-jacentes aux Figs. 2, 3, 4 et 5, ainsi que tous les chiffres supplémentaires sont inclus dans le fichier de données supplémentaires. Toutes les données supplémentaires de cette étude sont disponibles auprès de l'auteur correspondant ([email protected]) sur demande raisonnable. Des informations supplémentaires sont fournies avec ce document.

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Financé en partie par le programme de recherche intra-muros du Centre de recherche sur les vaccins, NIAID, NIH (ZIA AI005024-22) et par le Bureau national hongrois de la recherche, du développement et de l'innovation (numéro de subvention NKFIH : ANN-139564). Projet n° TKP2021-EGA-24 a été mis en œuvre avec le soutien du ministère hongrois de l'Innovation et de la Technologie du Fonds national de recherche, de développement et d'innovation, financé dans le cadre du programme de financement TKP2021-EGA. Le KP a été soutenu par une bourse de courte durée de la Fédération des sociétés européennes de biochimie (FEBS).

Financement en libre accès fourni par l'Université Semmelweis.

Département de biologie moléculaire, Institut de biochimie et de biologie moléculaire, Université Semmelweis, Budapest, Hongrie

Krisztina Percze, Zoltán János Tolnai & Tamás Mészáros

Laboratoire d'immunologie médicale, Radboud Center for Infectious Diseases, Radboud Institute for Molecular Life Sciences, Radboud University Medical Center, Nimègue, Pays-Bas

Marc Eleveld & Marien I. de Jonge

Centre de recherche sur les vaccins, Institut national des allergies et des maladies infectieuses, Instituts nationaux de la santé, Bethesda, MD, États-Unis

Li Ou, Haijuan Du, Adam S. Olia et Peter D. Kwong

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TM et M.dJ. conceptualisé ce travail; LO a préparé Ds-Cav1 et la protéine F post-fusion ainsi que des trimères de pré-fusion du métapneumovirus humain et du virus parainfluenza humain de type 3 ; Trimère d'hémagglutinine fourni par HD ; ASO a fourni le pic SARS-CoV-2 ; KP et TM ont conçu et réalisé la sélection d'aptamères RSV F ; KP, ZJT a conçu et réalisé des essais de caractérisation d'aptamère ; KP, ME, M.dJ. conçu et exécuté des expériences de neutralisation de virus ; KP a analysé et interprété les résultats ; TM, KP, M.dJ, PDK ont écrit et édité le manuscrit. Tous les auteurs ont examiné les résultats et approuvé la version finale du manuscrit. Le manuscrit n'a pas été accepté ou publié ailleurs.

Correspondance à Tamás Mészáros.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

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Réimpressions et autorisations

Percze, K., Tolnai, ZJ, Eleveld, M. et al. La chaîne latérale de type tryptophane contenant des aptamères inhibe l'infection par le virus respiratoire syncytial des cellules épithéliales pulmonaires. Sci Rep 13, 9403 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-36428-2

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Reçu : 27 février 2023

Accepté : 03 juin 2023

Publié: 09 juin 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s41598-023-36428-2

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