La carence en poly

Rapports scientifiques volume 13, Numéro d'article : 2800 (2023) Citer cet article

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Acinetobacter baumannii est un agent pathogène nosocomial qui peut être résistant aux antibiotiques en modulant rapidement ses mécanismes anti-médicaments. L'A. baumannii multirésistant aux médicaments a été considéré comme l'un des agents pathogènes les plus menaçants pour notre société. La formation de biofilm et les cellules persistantes dans la matrice du biofilm sont reconnues comme des problèmes insolubles, en particulier dans les infections nosocomiales. La poly-β-1,6-N-acétyl-glucosamine (PNAG) est l'un des éléments constitutifs importants du biofilm d'A. baumannii. Ici, nous découvrons une protéine phosphoryl-régulation sur la PNAG désacétylase, AbPgaB1, dans laquelle le résidu Ser411 a été phosphorylé. La régulation du phosphoryle sur AbPgaB1 module le taux de rotation du produit dans lequel le PNAG désacétylé est produit et reflété dans la production de biofilm. Nous avons en outre découvert que la souche d'A. baumannii déficiente en PgaB présente le niveau de production de biofilm le plus bas, mais a une concentration d'inhibition minimale élevée vis-à-vis de la colistine et de la tétracycline antibiotiques. Sur la base des effets bactéricides post-antibiotiques et des tests de destruction en fonction du temps avec des médicaments antibactériens, nous affirmons que l'A. baumannii déficient en PgaB se convertit en cellules tolérantes à la colistine. Cette étude utilise un modèle de A. baumannii tolérant à la colistine indépendant du biofilm pour étudier plus avant ses caractéristiques et ses mécanismes afin de mieux comprendre les résultats cliniques.

Au cours des dernières décennies, l'augmentation de la résistance aux antibiotiques a entraîné un risque accru d'infections pathogènes nosocomiales. Acinetobacter baumannii résistant aux carbapénèmes est une cause fréquente d'infections opportunistes souvent mortelles chez les patients gravement malades. L'expression de la carbapénémase est le mécanisme le plus important pour conférer une résistance aux carbapénèmes chez les agents pathogènes résistants aux médicaments1,2. Des preuves telles que la perte de la porine de la membrane externe3,4, l'expression différentielle de la protéine de liaison à la pénicilline5 et la surproduction de systèmes d'efflux6 ont également été décrites comme étant impliquées dans la résistance aux carbapénèmes chez A. baumannii. La formation de biofilm permet à A. baumannii de coloniser différents environnements et est généralement associée à la virulence7,8. La première étape pour initier la formation de biofilm est que les cellules planctoniques doivent se fixer aux surfaces biotiques ou abiotiques. Grâce à des procédures d'adhésion cellule-cellule et de prolifération cellulaire, les structures du biofilm mûrissent et reprennent un mode de vie planctonique lorsqu'elles se dispersent dans de nouveaux environnements. Plusieurs facteurs associés à la formation de biofilms chez A. baumannii ont été identifiés, notamment le système d'assemblage chaperon de pili CsuA/BABCDE9,10, le système à deux composants BfmS/BfmR11, la protéine de membrane externe OmpA12,13, la protéine associée au biofilm14,15 , l'autoinducteur synthase AbaI16 et le complexe protéique PgaABCD nécessaire à la synthèse de la poly-bêta-1–6-N-acétylglucosamine (PNAG)17.

Le PNAG partiellement désacétylé (dPNAG) est considéré comme un exopolysaccharide nécessaire pour structurer les biofilms de plusieurs agents pathogènes humains, tels que A. baumannii17, Aggregatibacter spp.18, Bordetella pertussis19,20, Klebsiella pneumonia21, Staphylococcus aureus22 et S. epidermidis23. L'exopolysaccharide dPNAG est polymérisé et transloqué via le système PgaABCD chez A. baumannii17. Le système homologue chez E. coli montre que PgaC et PgaD sont nécessaires à la polymérisation du PNAG24. Le PNAG polymérisé est partiellement désacétylé par PgaB et ensuite transloqué par PgaA24. Les résultats de la détection du biofilm des souches knock-out d'E. coli ont révélé que PgaA et PgaB sont nécessaires à la translocation du PNAG, tandis que la souche de suppression de PgaC possédait du PNAG polymérisé indétectable17,24. Le transporteur PNAG PgaA possédait plusieurs résidus chargés négativement à l'intérieur de son pore de sécrétion en barillet β pour la liaison initiale à dPNAG25. La mutation dirigée vers le site et la détection du biofilm ont révélé que les résidus chargés négativement dans le pore de sécrétion PgaA entraînent la préférence d'interagir avec dPNAG25 chargé positivement. Par conséquent, le PNAG entièrement acétylé n'a pas été considéré comme étant exporté pour servir d'exopolysaccharide supportant le biofilm25.

La PNAG N-désacétylase PgaB joue un rôle essentiel dans la régulation des niveaux d'acétyle de PNAG et sert de pont pour la translocation de dPNAG par PgaA26. Les domaines N- et C-terminaux de PgaB sont tous deux nécessaires pour traiter la dé-N-acétylation du PNAG26. La région catalytique de dé-N-acétylation est située au niveau du domaine N-terminal de PgaB tandis que le domaine C-terminal possède une activité d'hydrolyse du glycosyle et est essentiel pour l'exportation de PNAG20,26. Sur la base de l'analyse de la structure cristalline de l'EcPgaB, une boucle en épingle à cheveux β spécifique (résidus 610 à 623) interagit avec le PNAG/dPNAG pour l'exportation26. La PgaB a montré une activité dépendante du cobalt et du nickel pour désacétyler partiellement la β-1,6-glucosamine mais pas l'oligomère de β-1,4-glucosamine27. La position de dé-N-acétylation spécifique sur le pentasaccharide de glucosamine s'est produite au 2e ou 3e monosaccharide à partir de l'extrémité non réductrice27. Bien que les positions de dé-N-acétylation aient été déterminées à l'aide d'un pentasaccharide β-1,6-glucosamine entièrement acétylé couplé au traitement de l'exoglycosidase SpHex27, l'exopolysaccharide naturel PNAG isolé à partir de bactéries présentait toujours une grande diversité de longueurs et ses positions désacétylées.

L'activité glycosyl hydrolase de Bordetella bronchiseptica PgaB (BbPgaB) découvre un nouveau mécanisme de modulation dans la production de PNAG, démontrant la digestion glycoside du PNAG20 désacétylé. Le domaine C-terminal de BbPgaB a été classé dans la famille des glycosides hydrolases 153 (GH153) et orthologue à E. coli PgaB20. L'activité de désacétylation de PgaB nécessite à la fois des domaines N- et C-terminaux, tandis que les domaines C-terminaux tronqués de BbPgaB et EcPgaB peuvent hydrolyser dPNAG20. Le motif requis du polymère dPNAG pour le clivage a été identifié comme GlcN-GlcNAc-GlcNAc, ce qui a démontré que le PNAG entièrement acétylé n'était pas reconnu comme substrat pour le domaine C-terminal de BbPgaB20.

Les matrices de biofilm sont considérées comme des protecteurs physiques pour les bactéries, conduisant à une plus grande tolérance aux antibiotiques. Des études protéomiques et de mutagenèse ont démontré que OmpA, Omp33, CarO, la protéine de type OprD, la protéine putative de type DcaP et le métabolisme de l'histidine sont essentiels à la formation de biofilm21. Cependant, il y a moins d'informations sur l'étude de la résistance aux médicaments chez A. baumannii pour établir un lien avec sa formation de biofilm médiée par le PNAG. Des comparaisons antérieures dans le transcriptome de souches cliniques d'A. baumannii ont révélé que le niveau transcriptionnel de PgaB (A1S_0938) dans une souche résistante à la colistine était significativement plus élevé que dans une souche sensible à la colistine28. Les modifications post-traductionnelles des protéines sont des régulations réversibles qui modulent les fonctions des protéines en réponse à plusieurs réactions physiologiques. Notre étude précédente a révélé que la PgaB de la souche clinique SK17 d'A. baumannii était phosphorylée29. Cette étude a confirmé la phospho-régulation de la production de biofilm médiée par PgaB chez A. baumannii ATCC15151. Selon le test de mutation dirigée et d'activité de N-désacétylation, la phospho-modification sur le résidu Ser411 de PgaB a montré un taux de renouvellement significativement plus élevé qui a entraîné une production plus élevée de dPNAG servant de bloc de construction pour le biofilm. Nous avons remarqué que la quantité de production de biofilm induite par le PNAG était négativement corrélée à la résistance à la colistine chez A. baumannii. La souche de suppression PgaB a produit la plus faible quantité de biofilm mais possédait une résistance à la colistine significativement plus élevée. Nous émettons l'hypothèse que la souche d'A. baumannii déficiente en PgaB accumule du PNAG au niveau du périplasme, ce qui peut entraver la capacité de la colistine à cibler la membrane cytoplasmique d'A. baumannii.

Dans les opérons Pga, la N-acétylglucosamine désacétylase PgaB possède la capacité de réguler le degré d'acétylation sur le PNAG qui module directement l'affinité de liaison du PNAG à la structure de la lumière du barillet PgaA25. Le PNAG partiellement désacétylé (dPNAG) a ensuite été transporté sous forme de polysaccharide extracellulaire via PgaA (Fig. 1a). Le domaine TPR de PgaA dans E. coli a participé à l'interaction protéine-protéine avec PgaB, ce qui est essentiel pour l'exportation de PNAG partiellement désacétylé30. Sur la base de ces informations, nous avons émis l'hypothèse que la formation de biofilm chez A. baumannii pourrait être régulée par la N-désacétylase PgaB. Il existe deux opérons Pga, A1S0938 à A1S0940 et A1S2162 à A1S2159, parmi toutes les souches séquencées d'A. baumannii (Fig. 1a). Les deux copies de la N-acétylglucosamine désacétylase (A1S0938 et A1S2161) ont été annotées PgaB et ont été classées dans la famille des glucides estérases (famille CE4) dans la base de données Carbohydrate-Active Enzyme (CAZy) actuellement définie. Les protéines codantes des gènes A1S0938 et A1S2161 ont été définies respectivement comme AbPgaB1 et AbPgaB2 dans cette étude. PgaB est une protéine ancrée dans la membrane externe dans laquelle les résidus S12 à N194 de AbPgaB1 et H35 à W70 de AbPgaB2 sont des régions transmembranaires prédites par TMRPres2D31 (Fig. S1). AbPgaB1 partage 35,68 % et 41,64 % d'identités de séquence avec EcPgaB et BbPgaB, respectivement. Selon l'analyse phylogénétique, AbPgaB1 (A1S0938) est proche de B. bronchiseptica qui peut avoir une activité d'hydrolyse des glycosides au niveau du domaine C-terminal (Fig. 1b). Bien que AbPgaB1 et AbPgaB2 partagent une faible identité de séquence (32%), ils sont toujours regroupés au sein de PgaB d' Escherichia coli , Klebsiella pneumonia , B. bronchiseptica , B. pertussis et IcaB de Staphylococcus mais pas de polysaccharide désacétylase de Pseudomonas . (Fig. 1b).

Illustration schématique de deux opérons de synthèse de PNAG chez A. baumannii. ( a ) Les gènes codants A1S-0938 à A1S-0940 et A1S-2162 à A1S-2159 ont été annotés comme opérons de synthèse PNAG chez A. baumannii. Les complexes protéiques PgaC (marron) et PgaD (orange) étaient situés sur la membrane cytoplasmique pour polymériser la N-acétylglucosamine. La PgaB est une PNAG désacétylase qui s'ancre sur la membrane externe et se situe au niveau du périplasme. La protéine de transport de la membrane externe PgaA a contribué au transport du PNAG partiellement désacétylé en tant qu'exopolysaccharide. ( b ) Analyse phylogénétique des polysaccharides désacétylases dans la famille CE4 de la base de données CAZy à partir de bactéries basée sur la méthode de regroupement Neighbor Joining.

On considère que le PgaB module le rapport du groupe acétyle sur le PNAG. Cependant, la régulation de PgaB pour produire du PNAG acétylé différentiel en tant que matrice de biofilm n'est toujours pas claire. Des souches de délétion d'un seul gène (ΔAbpgaB1) et de délétion de deux gènes (ΔAbpgaB1ΔAbpgaB2) d'A. baumannii ont été construites pour l'analyse des exopolysaccharides. L'exopolysaccharide au niveau de l'acétyle (y compris le PNAG) extrait de A. baumannii ATCC 15151 (Ab15151) et ses souches mutantes dérivées ont été déterminés sur la base d'une analyse RMN du proton (Fig. S2). Le signal du PNAG acétylé a été relativement quantifié sur la base de la surface intégrale du pic à 2, 0 ppm sur les profils RMN du proton (Fig. S2). Le niveau d'acétylation des polysaccharides extraits a été légèrement augmenté à partir de ΔAbpgaB1 et il a encore augmenté dans la double délétion. L'exopolysaccharide extrait de la souche à double délétion pgaB représentait des signaux de niveau d'acétyle plus élevés que Ab15151, ce qui a démontré que l'activité N-désacétylase de AbPgaB1 et AbPgaB2 pouvait moduler le niveau d'acétylation de PNAG dans Ab15151.

Nous avons effectué des analyses protéomiques et phosphoprotéomiques pour étudier les protéines différentielles exprimées entre les modes de vie planctonique et biofilm d'A. baumannii. Avec une combinaison de données protéomiques, 1334 protéines exprimées constitutives ont pu être identifiées à partir des modes de vie planctoniques et biofilms d'Ab15151 (Fig. S3). Il y avait 174 et 226 protéines uniques qui n'ont été identifiées qu'à partir du planctonique et du biofilm d'A. baumannii, respectivement (Fig. S3). Parmi ces protéines identifiées, AbPgaB1 (A1S0938) a été définie comme une phosphoprotéine fiable via une analyse phosphoprotéomique en utilisant les procédures standard décrites dans Méthodes. Le gène codant d'AbPgaB1 a été construit et transformé en Ab15151 pour la surexpression et ses sites phosphorylés (sites p) ont été confirmés sur la base d'AbPgaB1 purifié par analyse LC-MS/MS. Sept sites p non ambigus de quatre peptides phosphorylés (peptides p) sur AbPgaB1 ont été identifiés (tableau S1). Selon la prédiction de la structure secondaire de la protéine AbPgaB1 par Jpred432, le site p H229 est situé à l'hélice α 7 (α7) dans le domaine N-terminal tandis que les sites p T407, D408, S411 et D413 sont situés à la boucle 11 dans le domaine C-terminal (Fig. 2a). Il y avait deux autres sites p, Y482 et Y507, situés respectivement en α13 et α14 dans le domaine C-terminal (Fig. 2a). La structure de AbPgaB1 a été prédite par SWISS-MODEL sur la base de la structure cristalline PgaB d'E. coli comme matrice (PDB : 4P7R)26. Selon les données MS / MS, sept sites p sur AbPgaB1 ont été marqués sur les domaines N et C qui ont été respectivement annotés pour avoir une activité PNAG désacétylase et une activité d'hydrolyse du glycosyle (Fig. 2b). Pour comprendre la régulation de la modification du phosphoryle sur AbPgaB1, le tétrasaccharide de la N-acétylglucosamine (4-NAG) a été ancré dans la structure modélisée AbPgaB1 (Fig. 2b). Les sites p S411 et D413 étaient proches de 4-NAG dans AbPgaB1, ce qui a révélé qu'ils pourraient être des candidats pour l'étude de la régulation du phosphoryle sur AbPgaB1. Les spectres MS/MS du peptide p "407TDPVSKDLVVTEQAK421" dans la boucle 11 qui contenait les sites p T407, D408, S411 et D413 sont présentés sur la figure 2c. Ces résultats démontrent que la phosphoryl-régulation du domaine C-terminal de AbPgaB1, spécifiquement les résidus S411 et D413, peut moduler son activité.

Les sites phosphorylés identifiés sur AbPgaB1 marqués dans la structure secondaire et la structure tertiaire. ( a ) La structure secondaire de AbPgaB1 a été prédite par Jpred4. Les structures en hélice alpha et en feuillet bêta ont été marquées respectivement en violet et en jaune. Les sites p identifiés ont été marqués "p" (rouge) sur les séquences AbPgaB1. ( b ) Le tétrasaccharide de PNAG, 4-NAG, dont la chaîne principale montrait des bâtons (vert) a été ancré dans la structure modélisée AbPgaB1 (dessin animé, prédit sur la base du modèle PDB: 4P7R26 par SWISS-MODEL) pour afficher l'emplacement des résidus phosphorylés (jaune) dans la structure 3D. La structure modélisée a été modifiée à l'aide de PyMOL. ( c ) Spectres MS / MS du p-peptide "407TDPVSKDLVVTEQAK421" sur AbPgaB1. Chaque pic révèle le m/z des fragments après séparation par spectrométrie de masse en tandem et est traité par MaxQuant. Les fragments d'ion b N-terminal et d'ion y C-terminal ont été mis en évidence en bleu et en rouge, respectivement.

Selon l'analyse de la structure de modélisation, nous avons émis l'hypothèse que le site p Ser411 était essentiel pour la liaison et la libération du produit dPNAG. Le résidu Ser411 de AbPgaB1 a ensuite été remplacé par Ala ou Asp pour mimer des conditions non phosphorylées ou phosphorylées. L'AbPgaB1 et ses dérivés mutés directement sur le site ont été respectivement construits dans le vecteur d'expression pABCLIIa pour générer des protéines de fusion His-tag C-terminales pour une purification par affinité supplémentaire. AbPgaB1 surexprimé et ses dérivés ont été purifiés pour le dosage de l'activité de désacétylation en utilisant du PNAG partiellement désacétylé comme substrat. Les paramètres cinétiques de l'activité désacétylase AbPgaB1 ont révélé que la valeur Km était augmentée de 4, 9 fois lorsque Ser411 était remplacé par Asp (tableau 1). D'autre part, la vitesse maximale d'AbPgaB1 a été augmentée de 8,4 fois lorsque Ser411 a été phosphorylé (tableau 1). En comparaison avec l'AbPgaB1 muté par S411A non phosphorylé, l'AbPgaB1 phospho-mimétique (S411D) possédait un chiffre d'affaires considérablement plus élevé, ce qui implique une production de PNAG plus désacétylée.

Pour comprendre la régulation médiée par le phosphoryle d'AbPgaB1, la structure de modélisation du domaine C-terminal d'AbPgaB1 (résidus 308–659, AbPgaB1308–659) a été construite sur la base du tétrasaccharide GlcNAc incorporé EcPgaB (PDB: 4P7R) 26 structure cristalline comme modèle . La structure de modélisation AbPgaB1308–659 était alignée sur EcPgaB (PDB: 4P7R) et B. bronchiseptica PgaB (BbPgaB, PDB: 6AU1) 20 qui présentaient des résidus d'interaction avec le tétrasaccharide GlcNAc hautement conservés (Fig. S4a, b). Selon l'analyse de la structure cristalline d'EcPgaB, le résidu W552 forme une interaction étroitement empilée avec le cycle pyranoïde et les liaisons hydrogène D472 avec OH-3 et OH-4 de GlcNAc. Les réarrangements spatiaux des résidus W549 et D470 de AbPgaB1 et des résidus W561 et D480 de BbPgaB étaient hautement conservés en résidus W552 et D472 dans EcPgaB, ce qui implique la participation de ces résidus à la liaison du tétrasaccharide GlcNAc (Fig. S4a). De plus, le résidu D473 de AbPgaB1308–659 était identique au résidu D475 dans EcPgaB (PDB : 4F9J) qui était considéré comme formant des liaisons hydrogène bidentées avec le tétrasaccharide GlcNAc27. Par conséquent, les résidus à proximité, tels que W549, D470 et D473 dans AbPgaB1308–659 ont été définis comme les sites actifs permettant l'amarrage flexible du ligand tétrasaccharide GlcNAc. Parmi les rotamères distincts résultant de cette interaction, celui avec la plus faible énergie a été sélectionné comme le tétrasaccharide GlcNAc incorporé dans la structure modélisée de AbPgaB1308–659 (Fig. S4c).

L'extrémité réductrice du tétrasaccharide GlcNAc dans la structure de modélisation AbPgaB1308–659 a été définie comme la sous-unité + 1 (Fig. S4c). Dans AbPgaB1308–659, le résidu W549 participe à l'interaction d'empilement avec le cycle pyranoïde et sa liaison hydrogène de la chaîne principale au fragment N-acétyle de + 2 GlcNAc. L'oxygène de la chaîne principale sur le résidu Y430 a formé un fragment N-acétyle de liaison hydrogène de la sous-unité + 1 de GlcNAc (Fig. S4c). AbPgaB1308–659 était fortement coordonné à + 1 GlcNAc par un réseau de liaisons hydrogène, y compris la chaîne latérale des résidus D413, R432, E472, S469, T467 et la chaîne principale de Y430. L'interaction unique CH – π entre le résidu E472 et + 1 GlcNAc a également contribué à la liaison du ligand (Fig. S4c). Le pont salin R432-E472 conservé (Fig. S4b) peut contribuer à l'accommodation + 1 GlcNAc et stabiliser ces boucles dans la liaison au PNAG (Fig. S4b, c). Par conséquent, le mimique phosphorylé Ser411 (S411D) situé près de R432 briserait le pont salin R432-E472 préexistant pour déclencher un dépliement partiel des boucles27 (modèle de compétition du pont salin)33 (Fig. S4d,e). Cet événement affecterait probablement le réseau de liaisons hydrogène permettant l'hébergement de + 1 GlcNAc. De plus, par rapport au complexe de type sauvage modélisé, le groupe phosphoryle en vrac de S411D dans AbPgaB308–659 entraînerait la répulsion spatiale de PNAG pour entraver sa liaison (Fig. S4d, e).

Pour étudier les effets de la régulation à médiation phospho sur AbPgaB1 dans la formation de biofilm, Ab15151 et ses souches mutantes dérivées ont été observés au microscope électronique à balayage (SEM). Les biofilms d'Ab15151 de type sauvage ont montré une structure agrégée et un exopolysaccharide attaché aux cellules (Fig. 3a). La souche de suppression AbPgaB1 (ΔAbpgaB1) présentait des cellules agrégées dans une matrice de biofilm sans exopolysaccharide observable (Fig. 3a). Cet exopolysaccharide attaché aux cellules a été produit lorsque AbpgaB1 a été complété. De plus, nous avons remarqué que le phospho-mimétique complémenté AbPgaB1 (Δ + S411D) présentait à la fois une agrégation cellulaire et un exopolysaccharide attaché aux cellules dans la structure du biofilm. Inversement, aucun exopolysaccharide attaché aux cellules n'a été observé à partir de la souche complémentée avec AbPgaB1 non phospho-mimétique (Δ + S411A) (Fig. 3a). La quantité de production de biofilm à partir d'Ab15151 et de ses souches mutantes dérivées a été quantifiée par coloration au cristal violet. Toutes les valeurs quantifiées ont été normalisées sur la base des quantités de biofilm d'Ab15151. A. baumannii produit moins de biofilm (58%) lorsque son AbpgaB1 a été éliminé (Fig. 3b). La production de biofilm a été récupérée à 83% d'Ab15151 lorsque l'AbpgaB1 de type sauvage a été complété par la souche de délétion AbpgaB1 (Fig. 3b). Il convient de noter que les quantités relatives de biofilm provenant de la souche complétée par AbPgaB1 non phosphorylé (Δ + S411A) et AbPgaB1 phosphorylé (Δ + S411D) étaient respectivement de 61% et 101% (Fig. 3b). Il a démontré que le niveau de désacétylation de PNAG était régulé par une modification médiée par le phosphoryle au niveau du résidu Ser411 sur AbPgaB1, reflétant la production de biofilm chez A. baumannii.

Observation et quantification de la production de biofilm chez A. baumannii ATCC15151 et les souches mutantes médiées par AbpgaB1. ( a ) Observation de la formation de biofilm dans Ab15151 et ses dérivés via SEM. Le panneau supérieur montrait la vue avec un grossissement de 7 500 × et le panneau inférieur montrait avec un grossissement de 10 000 ×. La barre indiquait une échelle de 1 µm. ( b ) Le biofilm a été quantifié par coloration au cristal violet et déterminé l'absorbance à 595 nm. Les valeurs OD595 de Ab15151 ont été définies comme 100 % pour calculer les quantités relatives de biofilm à partir de ses souches mutantes dérivées. Chaque point de données a été moyenné à partir d'au moins 6 répétitions. *Indique une différence significative par rapport à Ab15151 dont la valeur p du test t était inférieure à 0,001.

La capacité de production de biofilm chez A. baumannii a eu une tendance positive par rapport à sa toxicité et à sa résistance aux médicaments. Les preuves ci-dessus révèlent que la production de biofilm chez A. baumannii est régulée par une modification phosphoryle de résidu sur AbPgaB1. Nous avons en outre émis l'hypothèse que la résistance aux antibiotiques chez A. baumannii devrait diminuer lorsque AbPgaB1 est déphosphorylé au résidu Ser411. Étant donné que A. baumannii a deux copies de pgaB dans le génome, nous avons construit des souches de délétion pgaB simples et doubles pour d'autres tests sensibles aux antibiotiques. Selon la détermination de la concentration inhibitrice minimale (CMI) basée sur la méthode de dilution en bouillon, il n'y a pas de différence significative dans les valeurs de CMI contre l'imipénem, ​​la ciprofloxacine, l'apramycine et la vancomycine parmi les souches A. baumannii testées (tableau 2). Elle a révélé l'indépendance de la formation du biofilm et la tolérance à ces quatre antibiotiques. Nous avons remarqué que les valeurs de CMI des souches A. baumannii pour la colistine et la tétracycline étaient significativement augmentées (colistine 2,0 à 16,0 mg/L et tétracycline 0,5 à 16,0 mg/L) lorsque AbpgaB1 et AbpgaB2 étaient supprimés (tableau 2, ΔAbpgaB1ΔAbpgaB2, ΔΔ). Ces données réfutent notre hypothèse selon laquelle la souche à double délétion PgaB produisait les plus faibles quantités de biofilm parmi les souches d'A. baumannii dans cette étude, mais possédait la tolérance la plus élevée à la colistine et à la tétracycline antibiotiques (tableau 2, figure S5). La colistine, également connue sous le nom de polymyxine E, pourrait cibler le lipopolysaccharide (LPS) dans les bactéries pour perturber l'intégrité de leur membrane cellulaire afin de tuer les bactéries. Il est considéré comme un traitement de dernier recours contre l'infection par des agents pathogènes multirésistants. À notre connaissance, il n'y a aucune preuve à l'appui de la corrélation entre la PNAG désacétylase PgaB et la structure du LPS. Fait intéressant, la tolérance d'A. baumannii à la colistine est liée à son PNAG N-désacétylase PgaB. Et il existe des preuves que la colistine affecte le LPS dans la membrane cytoplasmique34. Par conséquent, nous avons en outre émis l'hypothèse que la souche à double délétion PgaB présentait une souche déficiente en PNAG dans laquelle le PNAG acétylé s'accumule au périplasme pour empêcher la perturbation par le traitement à la colistine. Cependant, nous avons encore besoin de plus de preuves pour comprendre le mécanisme détaillé impliqué dans la tolérance à la colistine lorsque les deux PgaB ont été supprimés.

La tétracycline est une sorte d'antibiotique qui se lie aux ribosomes 30S et entraîne l'inhibition de la synthèse des protéines. Les souches à double délétion PgaB avaient des valeurs de CMI de tétracycline plus élevées (tableau 2). L'apramycine est un autre antibiotique utilisé dans cette étude. L'apramycine cible la synthèse des protéines pour inhiber les bactéries. La CMI à l'apramycine n'a montré aucune différence entre toutes les souches d'A. baumannii testées dans cette étude (tableau 2). Par conséquent, nous avons considéré que la tolérance à la tétracycline des souches à double délétion PgaB est causée par sa capacité déficiente à pénétrer les cellules bactériennes. Cependant, d'autres études sont nécessaires pour valider cette hypothèse. Selon la CMI des souches Ab complétées par AbpgaB1, AbPgaB1 muté par WT, S411A ou S411D, dans le fond ΔAbpgaB1 ou ΔAbpgaB1ΔAbpgaB2, a montré une sensibilité similaire à la colistine et à la tétracycline (Tableau 2, Fig. S6). Cela a indiqué que la tolérance à la colistine ou à la tétracycline s'est produite dans les deux souches de délétion PgaB et qu'elle pouvait être récupérée par complémentation AbpgaB1 (tableau 2).

Pour déterminer la tolérance aux antibiotiques dans des conditions de biofilm lorsque AbpgaB1 et/ou AbpgaB2 sont supprimés, les concentrations minimales d'éradication du biofilm (MBEC) ont été examinées (tableau 3). Le MBEC de toutes les souches testées est supérieur au MIC indiquant que les cellules bactériennes intégrées dans le biofilm peuvent surmonter des stress antibiotiques plus élevés. Il n'y a pas de MBEC significativement différente de la souche ΔAbpgaB1ΔAbpgaB2 et des autres souches testées. Les données MBEC révèlent que la tolérance à la colistine et à la tétracycline dans la souche ΔAbpgaB1ΔAbpgaB2 n'a pas été contribuée par la production de biofilm. Pour confirmer que la tolérance aux médicaments qui s'est produite dans la souche à double délétion PgaB était reproductible, la CMI des médicaments antibactériens a été déterminée en 4 passages. Nous avons remarqué que la CMI de la souche ΔAbpgaB1ΔAbpgaB2 vis-à-vis de la colistine et de la tétracycline était augmentée lorsqu'elle était sous-transférée du 1er passage au 4ème passage (Fig. S6). Ce phénomène était reproductible dans au moins trois tests indépendants. Cela nous a incités à proposer l'hypothèse selon laquelle A. baumannii déficient en PgaB peut se convertir en cellules tolérantes aux antibiotiques pour surmonter l'effet bactéricide de la colistine. Les cellules persistantes montrent une population de bactéries qui survivent à l'exposition à un antibiotique bactéricide35. Les bactéries persistantes aux antibiotiques n'entraînent pas d'augmentation de la CMI mais sont tuées à un taux inférieur à celui des cellules non persistantes35. L'augmentation de la CMI de la souche ΔAbpgaB1ΔAbpgaB2 vis-à-vis de la colistine et de la tétracycline au cours de 4 passages indique qu'elle n'est pas due aux quantités de cellules persistantes. Le stress de famine est la principale pression sélective pendant l'incubation en 4 passages. Il a démontré que la déficience en PgaB chez A. baumannii peut conduire à l'évolution pour surmonter les stress antibiotiques.

Les effets post-antibiotiques (PAE) de la colistine sur A. baumannii ont été réalisés pour étudier la tolérance aux antibiotiques parmi les souches WT et mutantes dans cette étude. Les souches d'Ab cultivées pendant la nuit ont été diluées à OD600 0,1 pour l'administration de colistine. Après une heure de traitement à la colistine avec la concentration testée, chaque souche d'Ab testée a été diluée en série et déposée sur des plaques de gélose LB (Fig. 4a). Nous avons remarqué que Ab15151, ΔAbpgaB1 et ΔAbpgaB2 étaient tous sensibles à la colistine à une concentration de 16, 0 à 64, 0 µg / ml (Fig. 4a). Cependant, la souche à double délétion PgaB (ΔAbpgaB1ΔAbpgaB2) a montré la tolérance la plus élevée lorsqu'elle était traitée avec 16, 0, 32, 0 ou 64, 0 µg / ml de colistine pendant 1 h (Fig. 4a). Pour distinguer la persistance aux antibiotiques de la tolérance, la souche ΔAbpgaB1ΔAbpgaB2 a été tuée à un rythme plus lent que les autres souches en présence de 16, 0 µg / ml de colistine pendant un traitement de 0 à 4 h (Fig. 4b). La sensibilité de la souche à double délétion PgaB a été récupérée lorsqu'elle a été complétée par AbpgaB1 (tableau 2, fig. 4a, b). La PAE dose-dépendante et dépendante du temps a démontré que la souche à double délétion pgaB possède une tolérance élevée à la colistine. Cela soutient notre hypothèse selon laquelle après le traitement à la colistine, les cellules persistantes d'A. baumannii déficientes en PgaB pourraient avoir la capacité de se convertir en cellules tolérantes à la colistine. Cela démontre que l'incidence de l'évolution survenant dans la souche ΔpgaB1ΔpgaB2 peut être plus rapide que les autres souches d'A. baumannii testées dans cette étude. La tétracycline PAE a montré des profils similaires parmi les souches Ab à toutes les doses et périodes testées. (Fig. 4c,d). Il a révélé que les cellules bactériennes initialement chargées (~ 106 UFC/mL) n'étaient pas tuées par le médicament bactériostatique, la tétracycline, à la concentration de 4,0, 8,0 ou 16,0 µg/mL de traitement pendant 1 h (Fig. 4c) ou après 8,0 Administration de tétracycline µg/mL pendant 4 h (Fig. 4d). Nous avons remarqué que la persistance de l'antibiotique dans la souche à double délétion PgaB n'était pas observée lors de l'administration avec le médicament bactéricide ciprofloxacine ou le médicament bactériostatique apramycine (Fig. S7). Cela signifie que l'A. baumannii déficient en PgaB est spécifiquement résistant à l'antibiotique colistine et à la tétracycline.

Effets post-antibiotiques dépendant du temps de la colistine et de la tétracycline sur les souches d'A. baumannii dans cette étude. Les cultures d'une nuit ont été diluées à OD600 0,1 pour la colistine ou 0,01 pour l'administration de tétracycline. Après un traitement d'une heure avec de la colistine (a) ou de la tétracycline (c), les cultures ont été diluées en série au 10ème pour les déposer sur la plaque de gélose LB. Avec l'administration de 32 µg/mL de colistine (b) ou de 8 µg/mL de tétracycline (d) en 4 h, toutes les souches testées ont été diluées au 1/10 et incubées pendant une nuit pour évaluer leur taux de survie.

Les caractéristiques spécifiques des cellules persistantes aux antibiotiques sont que le taux de réplication en présence d'antibiotiques était inférieur à celui des cellules non persistantes35. Pour distinguer les cellules tolérantes aux antibiotiques des cellules hétérorésistantes, les tests de destruction en fonction du temps des souches d'A. baumannii sous administration d'antibiotiques ont été effectués. Toutes les souches d'A. baumannii testées ont montré une courbe de croissance similaire sans administration d'antibiotiques, ce qui a révélé que la délétion de pgaB et les souches complémentaires dans cette étude n'affectaient pas la réplication (Fig. 5). Les cultures de souches Ab avec 16,0 µg/mL de tétracycline ont montré une croissance stagnante parmi toutes les souches testées (Fig. 5). Les courbes de croissance de toutes les souches d'Ac testées auxquelles ont été administrées 16,0 µg/mL de colistine étaient également stagnantes, à l'exception de la souche déficiente en PgaB (ΔAbpgaB1ΔAbpgaB2) (Fig. 5). La réplication de la souche ΔAbpgaB1ΔAbpgaB2 a également été inhibée lorsqu'elle est traitée avec de la colistine, cependant, la croissance a été récupérée après une période de latence (Fig. 5). Nous émettons l'hypothèse que les cellules survivantes dans un fond déficient en PgaB peuvent se convertir en cellules tolérantes à la colistine et se développer pendant l'incubation d'une nuit.

Les tests de destruction en fonction du temps des souches mutantes A. baumannii médiées par WT et PgaB ont démontré sa tolérance à la colistine. Dans cette étude, les cultures d'une nuit de souches d'A. baumannii ont été diluées à OD600 0,05 pour la détermination de la courbe de croissance. L'antibiotique colistine (rouge) et la tétracycline (bleu) ont été administrés avec la concentration finale de 16,0 µg/mL après 2 h d'incubation. Pendant 27 h d'incubation, la densité optique de chaque culture a été déterminée à 600 nm par un lecteur de microplaques. La courbe de croissance dessinée en noir était la condition sans administration d'antibiotiques comme contrôle.

La construction de cette étude de souches mutantes pgaB était basée sur sa région de recombinaison homologue pour désactiver AbpgaB1 ou AbpgaB2 sur le génome Ab15151. Pour exclure les effets de la mutation polaire sur l'expression en aval de pgaC et pgaD, le pgaBCD (A1S0938 ~ A1S0940) a été construit dans le vecteur d'expression pABCLIIb, puis transformé en Ab15151 supprimé de pgaB (ΔAbpgaB1 ou ΔAbpgaB1ΔAbpgaB2) en tant que souches complémentaires AbpgaB1 (+ WT, + S411A , ou + S411D). Les tests de formation de biofilm ont montré que la souche complémentaire AbpgaB1 (Δ + WT) peut récupérer la production de biofilm (Fig. 3b). La détermination de la CMI a également indiqué que les souches du complément AbpgaB1 (y compris AbpgaB1 muté S411A ou S411D) pouvaient recouvrer la sensibilité à la colistine et à la tétracycline dans le fond ΔAbpgaB1ΔAbpgaB2 (Fig. S4). Selon nos expériences précédentes, la protéine complémentée induite par l'IPTG dans la détermination de la CMI de dilution en bouillon peut ne pas être exprimée de manière constitutive36. Nous avons également confirmé l'expression de PgaB1 dans les tests MIC de dilution en bouillon en utilisant Western pour détecter les signaux de fusion His-tag sur AbPgaB1 complémenté (Fig. S8). L'AbPgaB1 complémenté pourrait récupérer la production de biofilm dans le fond ΔAbpgaB1 et récupérer la sensibilité à la fois à la colistine et à la tétracycline dans le fond ΔAbpgaB1ΔAbpgaB2. Nos données confirment qu'il n'y avait pas d'effets de mutation polaire dans nos souches Ab construites.

Dans cette étude, nous utilisons la ninhydrine pour quantifier l'amine libre exposée lorsque le PNAG a été désacétylé par AbPgaB1. Le substrat d'AbPgaB1 est le PNAG isolé de la souche clinique SK17 d'A. baumannii. Étant donné que les deux opérons PGA existent dans toutes les souches séquencées d'A. baumannii, le PNAG devrait être l'un des composants de leurs exopolysaccharides. La position spécifique de dé-N-acétylation a été découverte en utilisant le pentasaccharide PNAG entièrement acétylé comme substrat27,37. Le PNAG natif isolé à partir de bactéries présentait toujours une grande diversité de niveaux d'acétylation, de positions désacétylées et de poids moléculaires. Pour comprendre la régulation du phosphoryle sur le résidu Ser411 dans AbPgaB1, les paramètres cinétiques entre AbPgaB1 et ses dérivés mutants directs ont été déterminés à l'aide d'essais à la ninhydrine avec du PNAG extrait natif comme substrat. Nous avons récolté un lot de PNAG extrait natif pour tous les dosages d'activité de la ninhydrine dans cette étude afin de limiter la variation entre les différents lots de PNAG extrait natif. En raison du fait que le PNAG extrait est déjà partiellement désacétylé, l'activité spécifique d'AbPgaB1 dans cette étude peut ne pas être comparable à d'autres données publiées à la même ligne de base. Cependant, il convient de comparer les paramètres cinétiques entre AbPgaB1 et son mutant dans cette étude en utilisant le PNAG isolé du même lot. Sur la base des tests d'activité d'AbPgaB1 et du mutant dirigé vers le site S411A ou S411D, nous concluons que l'AbPgaB1 phosphorylé (S411D) a un chiffre d'affaires de produit dPNAG plus élevé que le WT et l'AbPgaB1 non phosphorylé (S411A) (tableau 1). Il révèle que AbPgaB1_S411D a une plus grande efficacité pour désacétyler le PNAG pour le pompage de PgaA en tant que bloc de construction du biofilm. Ce résultat est également cohérent avec la quantification du biofilm et l'observation SEM parmi Ab15151 et ses souches dérivées (Fig. 3).

A notre connaissance, il existe deux opérons PGA hautement conservés dans toutes les souches séquencées d'A. baumannii. La phosphorylation post-traductionnelle des protéines a été trouvée dans la PNAG N-désacétylase AbPgaB1 (A1S_0938) plutôt que dans AbPgaB2 (A1S_2161). Des souches individuelles de délétion AbPgaB1 ou AbPgaB2 (ΔAbpgaB1 ou ΔAbpgaB2) et la souche de double délétion PgaB (ΔAbpgaB1ΔAbpgaB2) ont été construites pour élucider la contribution à la production de biofilm et aux tolérances aux médicaments antibactériens. La souche AbPgaB1 délétion Ab15151 (ΔAbpgaB1) produit moins de biofilm, dont le phénotype a été inversé dans ΔAbpgaB1 complété par AbpgaB1_WT (Δ + WT) ou AbpgaB1 contenait un mutant phospho-mimétique sur le résidu Ser411 (Δ + S411D) (Fig. 3). Un niveau élevé d'acétyle de PNAG semble se lier à PgaA avec une moindre mesure contre l'exportation d'exopolysaccharides30, reflétant la moindre production de biofilm dans ΔAbpgaB1ΔAbpgaB2 (Fig.S5). La souche déficiente en PgaB (ΔAbpgaB1ΔAbpgaB2) possédait une tolérance élevée à la colistine et à la tétracycline parmi toutes les souches testées (Tableau 2 et Fig. 4). Ce résultat a démontré une stratégie indépendante du biofilm d'A. baumannii pour surmonter les stress antibiotiques. L'étude précédente mentionnait qu'E. coli déficient en PgaB n'est pas capable de former un biofilm en raison du PNAG accumulé au niveau du périplasme24. L'étude de la BbPgaB chez B. bronchiseptica a montré que la BbPgaB et son activité de désacétylation ne sont pas nécessaires à la translocation du PNAG38. Il existe deux possibilités pour aboutir à la translocation PNAG indépendante de BbPgaB chez B. bronchiseptica38. L'un est le domaine TPR plus petit dans BbPgaA que EcPgaA, qui possède la capacité d'interagir avec PgaB pour affecter son activité de translocation PNAG. Cela a été confirmé par une étude plus approfondie de l'interaction protéine-protéine entre le domaine TPR de PgaA et PgaB30. L'autre possibilité est que les résidus déficients dans le domaine BbPgaA TPR peuvent conduire à la structure de la porine constitutive ouverte pour la translocation PNAG38. L'alignement de séquence de AbPgaA (A1S-2162, 812 aa) et EcPgaA (807 aa) montre 55 % d'identité de séquence, ce qui indique le domaine TPR hautement conservé et la structure porine entre AbPgaA et EcPgaA. La structure de modélisation AbPgaA qui est construite par SWISS-MODEL avec PDB 4y25 comme modèle montre que la structure porine d'AbPgaA possède plusieurs résidus chargés négativement (Fig. S9). Cette caractéristique structurelle est cohérente avec l'hypothèse décrite dans l'étude EcPgaA selon laquelle AbPgaA peut préférer transloquer le PNAG désacétylé que le PNAG acétylé. Nous avons considéré que la souche déficiente en PgaB (ΔAbpgaB1ΔAbpgaB2) dans cette étude peut accumuler du PNAG dans le périplasme empêchant la colistine de neutraliser le LPS sur la membrane cytoplasmique et d'entraîner une tolérance plus élevée à la colistine (Tableau 2 et Fig. 4).

En raison de la néphrotoxicité et de la neurotoxicité de la colistine, l'utilisation de ce médicament antibactérien se fait rare. Cependant, la colistine est toujours considérée comme un antibiotique de dernier recours contre les bactéries gram-négatives, en particulier dans les infections par des pathogènes MDR résistants aux carbapénèmes. Des rapports récents ont réévalué le risque d'effets secondaires de la colistine et démontré son innocuité et sa grande efficacité contre les infections pathogènes à Gram négatif MDR39,40,41,42. L'augmentation des pathogènes cliniques isolés résistants aux carbapénèmes MDR fait de la colistine un antibiotique de dernier recours à considérer. Actuellement, il y a de plus en plus d'hétérorésistances et d'échecs thérapeutiques dans le traitement de la colistine c'est-à-dire les mécanismes de résistance à la colistine qu'il faut identifier43,44,45. Les études actuelles sur la résistance à la colistine sont impliquées dans la recherche à médiation chromosomique et à médiation plasmidique. La perte de régions génomiques contenant mrkC, mrkD, modA, modB, modC, modD et ppk, qui participent à la production de biofilm, a été observée dans les souches d'A. baumannii résistantes à la colistine46. Les gènes mcr-1 et mcr-2 qui interviennent dans la résistance à la colistine d'origine plasmidique ont été signalés47,48. Les systèmes à deux composants PmrA/PmrB et PhoP/PhoQ sont associés à la régulation de la modification du LPS40,42. Ces rapports ont démontré que la plupart des mécanismes résistants à la colistine se concentrent sur la modification du LPS et la production de biofilm médiée par l'assemblage de pili. Dans cette étude, nous avons découvert une nouvelle possibilité pour A. baumannii de surmonter la colistine en entravant le transport du PNAG en tant que bloc de construction du biofilm. Et d'une manière ou d'une autre, ce phénotype d'A. baumannii pourrait se convertir en cellules tolérantes à la colistine qui survivent lorsqu'elles sont stimulées par l'antibiotique bactéricide colistine.

En conclusion, la production de biofilm associée au PNAG était régulée par la PNAG désacétylase, PgaB, qui existait généralement chez A. baumannii. Il existe deux copies de PgaB impliquées dans la production de biofilm d'A. baumannii. AbPgaB1 est régulé par le phosphoryle sur le résidu Ser411 pour moduler le nombre de renouvellement de dPNAG et est directement associé à la production de biofilm. La détermination de la CMI et les tests de destruction de médicaments antibactériens ont révélé que la souche d'A. baumannii déficiente en PgaB (ΔAbpgaB1ΔAbpgaB2) a une tolérance plus élevée aux antibiotiques colistine et tétracycline que les souches de type sauvage et autres dérivées dans cette étude. En fonction de la détermination de la CMI au cours de 4 passages, nous avons considéré que la souche A. baumannii déficiente en PgaB (ΔAbpgaB1ΔAbpgaB2) était déclenchée pour se convertir en cellules tolérantes à la colistine plus facilement que les autres lors de la sous-culture pendant quatre passages sans aucune administration de médicament antibactérien. Cette étude découvre un nouveau modèle phénotypique pour comprendre la transition d'A. baumannii tolérant à la colistine. Parce que la production de PNAG peut différer entre les différentes souches d'A. baumannii et parfois, elle peut ne pas contribuer à augmenter le niveau de production de biofilm parmi toutes les souches cliniques. Cette étude pourrait fournir un mécanisme possible pour déterminer la résistance à la colistine d'A. baumannii en clinique.

Les séquences de A1S-0938 et A1S-2161 ont été téléchargées à partir du National Center for Biotechnology Information (NCBI, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/) et leurs numéros d'accès étaient ABO11370 et ABO12588, respectivement. L'identité de séquence a été analysée par alignement Needleman-Wunsch sur NCBI. La polysaccharide désacétylase des bactéries a été alignée par ClustalW et l'arbre phylogénétique a été dessiné sur la base de la méthode de regroupement Neighbor-Joining en utilisant la version 6.0 de Molecular Evolutionary Genetics Analysis (MEGA6)49. Les autres numéros d'accession des séquences protéiques utilisées dans cette étude sont les suivants : pgaB de E. coli (AWY89024), K. pneumonia (AUH99166), B. bronchiseptica (AUV49813), IcaB de S. aureus (AAD52057), S. epidermidis (AAZ78359), polysaccharide désacétylase de P. aeruginosa (AAG04906), L. monocytogenes (NP_463944), B. subtilis (API95827) et C. difficile (AYD08208). La région transmembranaire de A1S-0938 (AbpgaB1) et A1S-2161 (AbpgaB2) a été prédite par l'outil TransMembrane protein Re-Presentation in 2Dimensions (TMRPres2D)31.

La souche 15151 d'A. baumannii a été régulièrement cultivée à 37 ° C dans du milieu LB sous agitation. Pour construire les souches Ab de délétion pgaB, le fragment contenait 600 pb en amont de A1S_0938 (y compris A1S_0937 pleine longueur et le promoteur A1S_0938) et 1300 pb en aval de A1S_0938 (contenant A1S_0939 pleine longueur) et a été défini comme dpgaB1. Le fragment de dpgaB1 a été cloné dans le vecteur pK18mobsacB (ATCC87097™). Le plasmide construit a ensuite été transformé dans E. coli S17-1 pour conjugaison à la souche 15151 d'A. baumannii. Le dpgaB1 construit a été intégré dans le chromosome sur la base d'une recombinaison homologue avec un gène résistant à la kanamycine comme marqueur de sélection. Des mutants knock-out ont été sélectionnés en cultivant les cellules sur un milieu contenant 10 % de saccharose sans traitement antibiotique. Les souches d'Ab à double délétion AbpgaB1 et AbpgaB2 ont suivi une stratégie similaire à la construction du fragment AbpgaB2 (A1S_2161) et la cible de conjugaison était la souche d'Ab à délétion AbPgaB1 (ΔAbpgaB1). Pour la complémentation en trans, le fragment portant les gènes A1S_0938, A1S_0939 et A1S_0940 a été cloné dans le vecteur navette pABCLIIc, dérivé de pABYM250, pour générer la souche AbpgaB1 complément Ab (Δ + WT). Des mutants imitant AbPgaB1 phosphorylé et non phosphorylé ont été générés par mutagenèse dirigée en utilisant la souche complémentaire AbpgaB1 comme matrice. Pour une purification plus poussée sur colonne d'affinité, AbpgaB1 WT et ses mutants dérivés ont été sous-clonés dans le vecteur navette pABCLIIa consistant en LacI, LacO et 6 × His-tag fusion à l'extrémité C-terminale de la cible.

Les souches A. baumannii (WT, ΔAbpgaB1 et ΔAbpgaB1ΔAbpgaB2) ont été cultivées dans un milieu LB à 37 ° C sous agitation. Au total, 1 L de cultures de chaque souche a été récolté et remis en suspension dans 50 mL d'eau DI. Des extraits bruts de polysaccharide extracellulaire (EPS) ont été résolus dans de l'eau DI, puis les cultures en suspension ont été incubées à 100 ° C d'eau bouillie pendant 30 min. Après refroidissement à température ambiante, la matrice insoluble a été éliminée par centrifugation à 12 000 tr/min pendant 1 h à 4 °C. Les extraits totaux d'EPS ont été précipités avec une concentration finale de 75 % d'éthanol à 4 °C pendant une nuit. Les précipitants ont été récoltés par centrifugation à 12 000 tr/min pendant 1 h à 4 °C et ont été résolus dans un tampon (Tris 25 mM, pH 8,0, MgCl2 5 mM, CaCl2 5 mM). Les échantillons ont été traités avec de la DNase (Roche) et de la RNase (Sigma) à 37 ° C pendant 8 h, puis traités avec de la protéinase K (Bioscience) à 37 ° C pendant une nuit pour éliminer les acides nucléiques et les protéines contaminés. Les extraits totaux ont été incubés dans de l'eau bouillie à 100 ° C pendant 30 min pour dénaturer toutes les protéines restantes possibles, puis centrifugés à 12 000 tr / min pendant 1 h à 4 ° C. Les surnageants ont été dialyses dans le volume 100 fois d'eau DI par une membrane de 1 KDa à 4 °C. Les échantillons ont été lyophilisés pour une analyse ultérieure. Pour quantifier relativement le niveau d'acétylation de l'EPS, l'EPS lyophilisé a été résolu dans D2O pour l'analyse RMN du proton (Bruker UltraShield, 600 MHz/54 mm, aimant supraconducteur 14,1 Tesla).

La souche 15151 d'A. baumannii a été régulièrement cultivée à 30 ° C à une DO600 initiale de 0, 1 dans un milieu LB pour la préparation d'échantillons de protéome et de phosphoprotéome. La culture a été récoltée après 6 h lorsque la DO600 a atteint 0,4, définie comme la phase mi-exponentielle des cellules planctoniques dans cette étude. Les cellules de biofilm ont été récoltées après 24 h de sous-culture, en jetant le composant liquide et en lavant trois fois les biofilms fixés à la paroi avec du PBS. Les cellules du biofilm ont été secouées en ajoutant du PBS dans les puits et en secouant la microplaque pendant 15 min. Des extraits totaux de cellules planctoniques et de biofilms ont été obtenus par sonication. Les concentrations de protéines ont été quantifiées sur la base du test de Bradford (Bio-Rad).

Cinq milligrammes des protéines extraites ont été digérés à l'aide de trypsine (1:40 w/w) dans des procédures à base de gel et sans gel51,52. Les peptides tryptiques ont été dessalés par SDB-XC StageTip pour une analyse protéomique plus poussée. Des phosphopeptides provenant de cellules planctoniques et de biofilms ont été enrichis à l'aide de pointes HAMMOCK sur mesure, préparées à l'aide de billes de TiO2 de 0,5 mg (GL Sciences) emballées dans 10 μL C8-StageTips46. Les phosphopeptides résultants ont été lyophilisés pour une analyse ultérieure par spectrométrie de masse par ionisation par chromatographie liquide-électrospray (LC – ESI – MS, Fusion) (Thermo Scientific). Les données brutes MS et MS/MS ont été analysées à l'aide du logiciel MaxQuant (version 1.5.1.2)50 basé sur la base de données de la souche 1515153 d'A. baumannii. Le taux de fausse découverte des peptides, protéines et sites de modification a été fixé à 0,1 % et le score MaxQuant minimum pour les sites de phosphorylation était de 40, avec une probabilité de localisation d'au moins 75 %. L'ontologie des gènes de chaque protéine identifiée a été annotée sur la base de la base de données Uniprot (www.uniprot.org). Les données de protéomique et de phosphoprotéomique MS ont été déposées dans le consortium ProteomeXchange via le référentiel partenaire PRIDE54, sous les identifiants de jeu de données PXD010140 et PXD010172, respectivement.

La structure protéique d'AbPgaB1 dans cette étude a été modélisée par le logiciel SWISS-MODEL avec le modèle PDB : 4f9j. La structure de modélisation a été affichée par PyMOL. Il a été considéré que la structure de modélisation pouvait fournir des informations fiables entre les ligands et les protéines. Les molécules d'esquisse et les modules de préparation de ligand mis en œuvre dans Discovery Studio 3.5 (Accelrys Software, Inc., San Diego, Californie, États-Unis) ont été utilisés pour construire les structures moléculaires de tous les composés. Les composés utilisés dans l'analyse d'amarrage ont été préparés en trois étapes : (1) les structures bidimensionnelles ont été converties en structures tridimensionnelles, (2) les charges ont été calculées et (3) des atomes H ont été ajoutés. La modélisation moléculaire a été utilisée pour reproduire la structure complexe du complexe AbPgaB1-PNAG. Les résidus AbPgaB1 V410, S411, K412, D413, L414, A422, G423, E424, H425, L426, W427, M428, G429, L431, R432, D444, T467, L468, S469, E472, W549 et Y550 ont été définis comme constituant ting le site de liaison dans l'amarrage flexible protéine-ligand, qui a été réalisé à l'aide du programme d'amarrage GOLD (Cambridge Crystallographic Data Center (CCDC), version 5.1) avec la fonction de notation GoldScore. Les chaînes latérales des résidus du site de liaison ont été définies pour être flexibles lors de l'analyse d'amarrage. Le tétrasaccharide N-acétylglucosamine construit, à énergie minimisée, a été ancré dans le site de liaison défini en fonction des paramètres d'amarrage modifiés (nombre d'opérations = 1 600 000 et taille de la population = 1 000 ; les paramètres par défaut ont été utilisés pour les autres paramètres). L'orientation la plus probable et la position d'énergie libre la plus favorable ont été analysées.

Une seule colonie d'A. baumannii 15151 portant le plasmide permettant la surexpression de AbPgaB1 fusionné avec l'étiquette His C-terminale a été inoculée dans le milieu LB. Les cultures d'une nuit ont été diluées dans 1 L de milieu LB frais à un rapport de 1:100 (v/v). L'expression d'AbPgaB1 a été induite par l'ajout d'IPTG 0,5 mM lorsque l'A600 des cultures a atteint 0,7. Après 12 h d'incubation, les cellules ont été récoltées et rompues à l'aide d'un homogénéisateur haute pression (Nanolyzer) pour obtenir des protéines totales pour une purification supplémentaire sur une résine d'affinité chargée de nickel (GE Healthcare) selon les procédures standard. Les protéines purifiées ont été concentrées à l'aide d'un filtre centrifuge Amicon Ultra et leur concentration a été quantifiée sur la base d'un test de Bradford. Les protéines purifiées ont été séparées par SDS-PAGE sur un gel d'acrylamide 12% (Tools, HR gradient gel, TFU-GG420).

Dans une étude précédente, nous avons montré que le composant principal de l'exopolysaccharide de la souche SK17 d'A. baumannii était le PNAG partiellement désacétylé (dPNAG), qui était extrait comme substrat de l'AbPgaB1. L'activité de dé-N-acétylation d'AbPgaB1 a été réalisée par des dosages à la ninhydrine55. En bref, le mélange réactionnel de dé-N-acétylation contenait 50 mM de NaCl, 10 μM de CoCl2 et 0 ~ 4,0 mg de PNAG extrait/mL, préparé dans un tampon HEPES 50 mM (pH 7,5). La réaction (volume réactionnel final de 100 μL) a été initiée par l'ajout d'AbPgaB1 ou de ses dérivés. Après une incubation de 1 h à 37°C, la réaction est terminée par une incubation de 10 min à 100°C. La coloration a été obtenue en incubant 50 µL de surnageant avec 25 µL de ninhydrine (Sigma) à 100 °C pendant 10 min. Le mélange a été dilué par addition de 125 μL d'éthanol à 95% et la quantité d'amine libre (glucosamine dé-N-acétylée) a été détectée par mesure de l'absorbance à 570 nm suivie d'une comparaison avec une courbe standard de glucosamine.

Les cultures d'une nuit ont été diluées dans un milieu LB contenant 1 % de glucose pour obtenir une DO6oo initiale de 0,05. Après 12 h d'incubation à 30 °C avec une agitation de 180 tr/min, le biofilm résultant a été lavé trois fois dans de l'eau. Pour quantifier la formation de biofilms, des biofilms attachés aux puits d'une plaque à 96 puits en polypropylène ont été colorés avec du cristal violet (CV) pendant 20 min, lavés trois fois dans de l'eau et solubilisés avec de l'éthanol à 95 % pendant 10 min, et leur absorbance à 595 nm a été déterminé. Pour l'observation au microscope électronique à balayage (SEM), les biofilms formés sur des lamelles couvre-objets dans les mêmes conditions ont été fixés dans une solution de formaldéhyde à 2,5 %/glutaraldéhyde à 4 %, puis déshydratés.

Les cultures d'une nuit de souches d' A. baumannii ont été diluées avec du bouillon Mueller – Hinton frais avec une densité optique initiale de 0, 005 à 600 nm. Les antibiotiques ont été dilués en série pour être administrés aux souches Ab. Les cellules inoculées avec des antibiotiques dilués en série ont été incubées à 37 ° C pendant 16 h. Après incubation, la densité optique à 600 nm des cultures testées a été déterminée par le lecteur de microplaques. Au cours de plusieurs passages de déterminations de CMI, les souches d'Ab cultivées pendant la nuit (16 à 20 h) ont été sous-transférées avec un rapport de 1: 1000 dans du milieu LB. La détection MIC de P. aeruginosa ATCC 27 853 a été réalisée comme contrôle standard dans ce test.

Les concentrations minimales d'éradication du biofilm d'A. baumannii ATCC15151 et de ses souches mutantes médiées par AbpgaB1/AbpgaB2 ont été déterminées par le protocole56. En bref, les cultures d'une nuit ont été diluées avec du bouillon Mueller-Hinton à OD600 0,005. Chaque souche a été cultivée dans des plaques à 96 puits avec un couvercle à cheville placé dans chaque puits. Après 24 h d'incubation, les peg-couvercles du biofilm de chaque souche ont ensuite été transférés dans les plaques à 96 puits avec du bouillon Mueller-Hinton contenant une solution antimicrobienne diluée deux fois. Les plaques ont ensuite été incubées pendant 24 h pour stimuler avec des antibiotiques. Les peg-lids ont ensuite été placés dans de nouvelles plaques à 96 puits avec du bouillon Mueller-Hinton frais. Les cellules bactériennes intégrées au biofilm de chaque souche testée seront libérées dans un milieu frais après 1 min de sonication. Les plaques à 96 puits ont été incubées pendant 24 heures supplémentaires, puis la concentration la plus faible d'antibiotiques empêchant la croissance visible a été définie comme la MBEC.

Pour étudier les cellules de survie lorsque A. baumannii est traité avec le médicament bactéricide colistine ou le médicament bactériostatique tétracycline, les cultures de 3e génération de souches d'A. baumannii ont été diluées à OD600 0,1 (107 UFC/mL) et OD600 0,01 (106 UFC/mL) respectivement pour l'administration de colistine et de tétracycline. Les cultures de souches Ab ont été traitées avec 16, 0, 32, 0 ou 64, 0 μg / ml de colistine pendant 1 h pour les tests dose-dépendants de destruction de la colistine. Dans le cas de la tétracycline, les tests de destruction dose-dépendants ont été effectués avec 4,0, 8,0 ou 16,0 μg/mL de tétracycline. Après 1 h de traitement, les cultures ont été diluées en série au 10, puis déposées 2 μL sur la plaque de gélose LB pour une autre incubation d'une nuit à 37 ° C. Les tests de destruction en fonction du temps ont été effectués avec 32,0 μg/mL de colistine ou 8,0 μg/mL d'administration de tétracycline pendant 4 h. Au cours de la stimulation antibiotique, les cultures ont été diluées en série à 0, 2 et 4 h et déposées sur une plaque de gélose LB pour une incubation pendant la nuit.

Pour distinguer les cellules tolérantes à la colistine des cellules hétérorésistantes, la 3ème génération de souches d'Ab a été diluée à OD600 0,05 par MHB pour la détermination de la courbe de croissance. Les cellules A. baumannii inoculées ont été incubées à 37 ° C sous agitation pendant 2 h, puis administrées avec 16, 0 μg / mL de colistine ou de tétracycline pendant encore 25 h d'incubation. La condition de croissance sans antibiotiques a été déterminée comme témoin. La densité optique à 600 nm de chaque culture d'Ab a été détectée à plusieurs moments au cours de l'incubation de 27 h.

La liste détaillée des phosphoprotéines et phosphopeptides identifiés dans cette étude a été fournie dans le tableau S2. Les données brutes MS protéomique et phosphoprotéomique ont été déposées dans le consortium ProteomeXchange via le référentiel partenaire PRIDE, sous les identifiants de jeu de données PXD010140 et PXD010172, respectivement. Toutes les données générées ou analysées au cours de cette étude sont incluses dans ce manuscrit et ses fichiers d'informations supplémentaires.

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Nous remercions Yun-Ting Tseng et Chia-Yu Chen pour leur travail initial sur ce projet. Nous sommes reconnaissants pour le soutien de la technologie SEM de l'Institut des sciences biomédicales, Academia Sinica.

Nous sommes reconnaissants du soutien financier du ministère des Sciences et de la Technologie (MOST 110-2320-B-039-058) et du financement de l'Université médicale de Chine (CMU110-MF-98 ; CMU110-N-31).

Institut universitaire des sciences biomédicales, Université médicale de Chine, Taichung, 404333, Taïwan

Shu-Jung Lai

Centre de recherche sur la biologie du cancer, Université médicale de Chine, Taichung, 404333, Taïwan

Shu-Jung Lai

Institut de chimie biologique, Academia Sinica, Taipei, 11529, Taïwan

I-Fan Tu & Shih-Hsiung Wu

Institut de biologie moléculaire, Université nationale Chung Hsing, Taichung, Taïwan

Tien Sheng Tseng

Institut de physiologie moléculaire, Laboratoire de la baie de Shenzhen, Shenzhen, 518132, Chine

Yu-Hsuan Tsai

Département de chimie, Université nationale de Taiwan, Taipei, 106, Taiwan

Shih-Hsiung Wu

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SJL et SHW ont conçu et dirigé la recherche. SJL a conçu l'étude sur le protéome et le phosphoprotéome d'A. baumannii. SJL et IFT ont construit les souches mutantes d'A. baumannii. IFT et TST ont conçu et calculé les analyses de structure de modélisation. YHT calculé et analyse des données RMN. SJL a conçu et réalisé toutes les autres expériences (par exemple, analyse de séquence, expression et purification de protéines, tests d'activité, quantification de biofilm, détermination de la CMI, tests de destruction d'antibiotiques et tests de croissance). Les figures et les manuscrits ont été préparés par SJL. Tous les auteurs ont examiné et approuvé le manuscrit final.

Correspondance avec Shu-Jung Lai ou Shih-Hsiung Wu.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

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Réimpressions et autorisations

Lai, SJ., Tu, IF., Tseng, TS. et coll. Le déficit en poly-β-1,6-N-acétyl-glucosamine désacétylase déclenche la conversion d'A. baumannii en cellules tolérantes à la colistine indépendantes du biofilm. Sci Rep 13, 2800 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-30065-5

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Reçu : 02 novembre 2022

Accepté : 15 février 2023

Publié: 16 février 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s41598-023-30065-5

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