Activation des GPCR de classe B1 par un agoniste intracellulaire

Nature (2023)Citer cet article

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Les récepteurs couplés aux protéines G (GPCR) accueillent généralement des ligands spécifiques dans les poches de liaison orthostérique. La liaison du ligand déclenche un changement de conformation allostérique du récepteur qui conduit à l'activation des transducteurs intracellulaires, des protéines G et des β-arrestines. Parce que ces signaux induisent souvent des effets indésirables, le mécanisme d'activation sélective pour chaque transducteur doit être élucidé. Ainsi, de nombreux agonistes à polarisation orthostérique ont été développés, et les agonistes à polarisation intracellulaire ont récemment suscité un large intérêt. Ces agonistes se lient dans la cavité intracellulaire du récepteur et règlent préférentiellement la voie de signalisation spécifique par rapport aux autres voies de signalisation, sans réarrangement allostérique du récepteur du côté extracellulaire1,2,3. Cependant, seules les structures liées aux antagonistes sont actuellement disponibles1,4,5,6, et il n'y a aucune preuve pour soutenir que la liaison agoniste biaisée se produit dans la cavité intracellulaire. Cela limite la compréhension de l'agonisme intracellulaire et du développement potentiel de médicaments. Nous rapportons ici la structure de microscopie électronique cryogénique d'un complexe de Gs et du récepteur de l'hormone parathyroïdienne humaine de type 1 (PTH1R) lié à un agoniste de PTH1R, PCO371. PCO371 se lie dans une poche intracellulaire de PTH1R et interagit directement avec Gs. Le mode de liaison PCO371 réorganise la région intracellulaire vers la conformation active sans propagation de signal allostérique induite de manière extracellulaire. PCO371 stabilise la conformation significativement courbée vers l'extérieur de l'hélice transmembranaire 6, ce qui facilite la liaison aux protéines G plutôt qu'aux β-arrestines. De plus, PCO371 se lie dans la poche intracellulaire hautement conservée, activant 7 des 15 GPCR de classe B1. Notre étude identifie une poche de liaison agoniste intracellulaire nouvelle et conservée et fournit la preuve d'un mécanisme de signalisation biaisé qui cible l'interface récepteur-transducteur.

Les GPCR constituent la plus grande famille de protéines humaines et sont impliqués dans presque tous les processus physiologiques. Par conséquent, ils sont ciblés par plus de 30 % des médicaments commercialisés7. Les agonistes se lient à une poche de liaison orthostérique extracellulaire de GPCR, ce qui induit des changements de conformation et stabilise la conformation active du domaine transmembranaire (TMD). Les poches orthostériques ont développé des formes et des séquences très diverses, ce qui permet de répondre à une gamme de stimuli extracellulaires8. En plus des agonistes orthostériques, de nombreux modulateurs allostériques ont été générés et des études structurales antérieures ont identifié diverses poches allostériques9. Comparés aux sites orthostériques, les sites allostériques ont tendance à avoir une plus grande variété de résidus d'acides aminés ; par conséquent, les ligands allostériques fournissent une spécificité de sous-type pour les récepteurs. Bien que des études structurelles antérieures aient révélé des modes de reconnaissance précis et spécifiques des ligands orthostériques et allostériques par des récepteurs individuels, des poches de liaison aux agonistes conservées dans des sous-types de récepteurs distincts n'ont pas encore été découvertes10.

La plupart des agonistes activent plusieurs voies de signalisation, et certains de ces signaux induisent occasionnellement des effets pharmacologiques indésirables. Les agonistes biaisés, qui activent préférentiellement un transducteur intracellulaire spécifique, ont le potentiel de maximiser l'impact thérapeutique tout en réduisant les effets indésirables10. Les agonistes biaisés actuels se lient généralement à la moitié extracellulaire du TMD, tandis que les agonistes qui se lient au côté intracellulaire, en particulier à l'interface récepteur-transducteur, peuvent être préférables pour une modulation précise de l'action de signalisation biaisée2. Jusqu'à présent, six structures de GPCR intracellulaires liés à un ligand ont été rapportées1,4,5,6,11,12. Cependant, la plupart d'entre eux sont des structures liées à des antagonistes, et il n'y a aucune preuve structurelle d'agonistes biaisés se liant à une poche de transducteur intracellulaire1,4,5,6. Ce manque de connaissances limite la capacité à comprendre et à affiner cet agonisme intracellulaire.

PTH1R est un GPCR de classe B1 et est un régulateur majeur de l'homéostasie des ions minéraux et du métabolisme osseux. PTH1R répond aux ligands de l'hormone parathyroïdienne (PTH) et du peptide apparenté à l'hormone parathyroïdienne (PTHrP) et active Gs, Gq et β-arrestines13. Les formes naturelles et modifiées de ces ligands induisent une importante formation osseuse anabolique et sont utilisées pour le traitement clinique de l'ostéoporose14,15. Cependant, ces ligands induisent également une résorption osseuse catabolique, ce qui entraîne des effets indésirables. L'équilibre entre les effets thérapeutiques et indésirables dépend des différences dans la durée de la production d'AMP cyclique médiée par le Gs16. L'activation pulsée de Gs au niveau de la membrane plasmique induit la production transitoire d'AMPc. À l'inverse, le PTH1R activé est internalisé par les β-arrestines et induit une production soutenue d'AMPc au début de l'endosome, ce qui entraîne des effets indésirables. Ainsi, les agonistes biaisés par la protéine G sont utiles dans le traitement de l'ostéoporose ; cependant, les mécanismes d'activation biaisée par la protéine G sont largement inconnus dans PTH1R.

Nous avons précédemment rapporté les structures des complexes PTH et PTHrP – PTH1R – Gs, fournissant des informations structurelles sur les causes des effets indésirables17. Bien que ces informations soient cruciales pour le développement de médicaments à base de peptides qui ciblent le PTH1R, les peptides doivent être administrés par injection sous-cutanée, et des agonistes non peptidiques et administrés par voie orale sont souhaitables pour réduire la charge physique des patients. Récemment, il a été démontré que PCO371, un agoniste chimique non peptidique du PTH1R, présentait une activité mimétique de la PTH in vivo par administration orale18. Cependant, il n'y a aucune information structurelle pour le PTH1R lié à PCO371 ; ainsi, le site de liaison et le mécanisme d'activation de PCO371 restent à élucider.

Pour élucider comment PCO371 se lie à PTH1R et induit son réarrangement conformationnel, nous avons déterminé la structure du complexe de signalisation PCO371-PTH1R-Gs. PTH1R a été exprimé dans des cellules HEK293, solubilisé dans une solution de lauryl maltose néopentyl glycol (LMNG) avec de l'hémisuccinate de cholestérol (CHS) et purifié dans de la glyco-diosgénine (GDN) avec la solution de CHS en présence de PCO371. Nous avons utilisé une solution à pH 9,0 lors de la purification en raison des exigences de solubilité du PCO371 à des concentrations élevées (Méthodes). PCO371 a augmenté de manière significative l'activité de Gs dans des conditions légèrement basiques (pH 9, 0), alors que l'activation de Gs induite par la PTH était équivalente à la fois au pH physiologique (pH 7, 4) et à pH 9, 0 (données étendues Fig. 1). Le PTH1R lié à PCO371 a été mélangé avec l'hétérotrimère mini-Gs et le nanocorps 35 (Nb35) pour former un complexe PCO371 – PTH1R – mini-Gs stabilisé par Nb35. Après purification, ce complexe de signalisation a été imagé à l'aide d'un microscope électronique à transmission cryogénique Titan Krios G4 avec un détecteur K3. Les images de particules ont été classées par classifications 2D et 3D, puis utilisées pour créer une carte de densité de microscopie électronique cryogénique (cryo-EM) à une résolution globale de 2, 9 Å (Fig. 1a, Extended Data Fig. 2 et Extended Data Table 1). Cette carte primaire a permis une attribution sans ambiguïté de la structure secondaire et des orientations des chaînes latérales du complexe PCO371 – PTH1R – Gs, à l'exception du domaine extracellulaire de PTH1R (Fig. 1b et Extended Data Fig. 3). Aucune densité claire correspondant au domaine extracellulaire n'a été observée, contrairement à la structure du complexe PTH – PTH1R – Gs précédemment déterminée et à plusieurs structures du petit récepteur du peptide 1 de type glucagon lié à un agoniste chimique (GLP-1R) – Gs ( Données étendues Fig. 4a,b). Cette différence structurelle indique que le domaine extracellulaire est très flexible et ne nécessite pas d'état conformationnel spécifique pour permettre l'engagement de Gs avec PTH1R.

a, Vues orthogonales du complexe PCO371 – PTH1R – Gs, construites à partir de la carte de potentiel cryo-EM et colorées selon la sous-unité. Violet, PTH1R lié à PCO371 ; magenta, PCO371; domaine de type Ras mini-Gαs jaune; tomate, Gβ1; marine, Gγ2; bleu poudré, No35. b, carte de densité et modèle construit de PCO371 près de la poche de liaison de PCO371. c, Vue rapprochée du site de liaison PCO371. Les exposants numériques indiquent les positions relatives dans le récepteur selon la numérotation GPCR Wootten de classe B1 de la région TMD du récepteur33. La carte est affichée au niveau du compteur 2.085 e A–3. d, Structure chimique de PCO371. PCO371 est composé de quatre groupes chimiques (illustrés de gauche à droite) : trifluorométhoxyphényle, spiro-imidazolone, diméthylphényle et DMH.

Notamment, le complexe PTH1R manquait de densité apparente de ligand dans la poche de liaison orthostérique, dont les caractéristiques n'avaient pas été rapportées auparavant pour la plupart des autres structures GPCR de classe B1 liées à l'agoniste (Extended Data Fig. 4b). Au lieu de cela, nous avons observé une densité claire correspondant à PCO371 dans une poche intracellulaire de liaison au transducteur formée par l'hélice transmembranaire 2 (TM2), TM3, TM6 et TM7, qui était spatialement séparée de la poche orthostérique extracellulaire (Fig. 1a – c et Extended Données Fig. 4b). La plupart des contacts ligand-récepteur ont été médiés par van der Waals et des interactions hydrophobes, conformément à la nature hydrophobe de PCO371 (tableau de données étendu 2). Notamment, Tyr4597.57 (les nombres en exposant reflètent la numérotation GPCR de classe Wootten B1) a formé des liaisons hydrogène avec le groupe carbonyle de la chaîne principale de Val4126.44 et PCO371, qui stabilise le complexe PCO371 – PTH1R – Gs (Fig. 1c). De plus, la chaîne latérale de Tyr4597.57 a séquestré PCO371 des lipides membranaires (Fig. 1a, b). Le groupe carbonyle de la diméthylhydantoïne (DMH) sur PCO371 a formé un pont salin avec Arg2192.46 (Fig. 1a, c, d). Notamment, le groupe DMH de PCO371 (Fig. 1d) a interagi avec le crochet carboxy-terminal de Gαs, qui a emballé étroitement PCO371 dans le noyau du récepteur (Fig. 1a, d). Ces interactions sont cohérentes avec les résultats de notre étude précédente sur la relation structure chimique-activité, qui a révélé que l'absence du groupe PCO371 DMH entraînait une diminution significative de la puissance20,21. Nos observations structurelles, ainsi que les découvertes précédentes sur la relation structure-activité chimique, suggèrent que PCO371 est un agoniste qui se lie à Gs et à la cavité intracellulaire du récepteur.

Pour caractériser la structure globale du complexe PCO371 – PTH1R – Gs, nous avons comparé cette structure avec celles de PTH – PTH1R – Gs et de la PTH1R liée à la PTH (ePTH)17,22. La structure PTH1R liée à la PTH possédait les caractéristiques caractéristiques des structures GPCR actives de classe B1. En bref, la partie extracellulaire de cette structure présentait le mouvement vers l'intérieur de TM1, TM7 et la troisième boucle extracellulaire, ainsi que le mouvement vers l'extérieur de TM6, ce qui a induit le mouvement vers l'extérieur significatif de TM6 dans la partie intracellulaire. Inversement, la structure PTH1R liée à ePTH, la seule structure PTH1R de type inactif, présentait des conformations inactives dans le noyau TMD et la partie intracellulaire, bien que la partie extracellulaire ait été légèrement décalée vers une conformation active en raison de la liaison d'un agoniste modifié (Fig. 2a,b).

a, superposition des complexes PCO371–PTH1R–Gs et PTH–PTH1R–Gs (classe 2, une forme active représentative), alignés sur TM2–TM5. Les symboles d'œil et de flèche indiquent les angles de vue en b et c. b, c, vues extracellulaires (b) et intracellulaires (c) des TMD superposés de PTH1R actif lié à PCO371, PTH1R actif lié à PTH et PTH1R inactif lié à ePTH. b, les flèches bidirectionnelles indiquent les distances des atomes Cα des résidus Thr1921.44 (TM1), Ile4226.54 (TM6) et Met4457.43 (TM7) entre les structures de PTH1R lié à PCO371 et de PTH1R actif lié à PTH, ou entre les structures de PTH1R de type inactif lié à PCO371 et lié à ePTH. c, La flèche à sens unique indique le mouvement vers l'extérieur typique de TM6 dans PTH1R lié à PCO371 et PTH1R lié à PTH. d, Mécanisme de liaison compétitive allostérique de PCO371 et PTH. PTH et PCO371 entrent en conflit au niveau des cercles en pointillés avec l'autre conformation liée au ligand. e, Structures superposées de PTH1R lié à PTH, de PTH1R lié à PCO371, de GPCR de classe B1 inactifs ou de type inactif (PTH1R, GCGR, GLP-1R et CRF1R) et de toutes les autres structures de GPCR de classe B1 lié à un agoniste endogène (PTH2R, SCTR, GHRHR, PAC1R, VIP1R, VIP2R, GCGR, GIPR, GLP-1R, GLP-2R, CALCR, CALRL, CRF1R et CRF2R). L'angle est représenté parmi les atomes Cα des résidus Ile/Met/Val6.54, Gly6.50 et Val/Ala/Leu6.39 dans TM6. Notez que l'angle de PTH1R lié à PCO371 est calculé entre Leu6.39, Pro6.47 et Ile6.54 en raison du coude à Pro6.47.

Les comparaisons entre les structures des structures PCO371 – PTH1R – Gs, PTH – PTH1R – Gs et PTH1R liées à ePTH ont révélé la conformation distincte de l'état actif induit par PCO371. Premièrement, les parties extracellulaires de TM1, TM6 et TM7 dans le PTH1R lié à PCO371 se sont décalées d'environ 6 Å vers l'extérieur, 6 Å vers l'intérieur et 4 Å vers l'extérieur, respectivement, par rapport à la structure PTH1R active liée à la PTH (Fig. 2a, b). Ces parties de TM1 et TM7 se sont déplacées plus loin vers l'extérieur, et la partie de TM6 s'est déplacée plus loin vers l'intérieur par rapport à PTH1R lié à ePTH. Ces mouvements sont cohérents avec le changement conformationnel inactif-actif précédemment caractérisé dans les structures GPCR de classe B119,22,23,24,25 (Fig. 2b et Extended Fig. 5a), indiquant que les parties extracellulaires du TMD adoptent la conformation inactive. dans la structure PTH1R liée à PCO371. Contrairement à la partie extracellulaire, la partie intracellulaire du TMD dans le PTH1R lié à PCO371 présentait le mouvement vers l'extérieur de TM6, qui est similaire au mouvement dans la structure active PTH – PTH1R – Gs (Fig. 2c). Cette conformation extracellulaire distincte a provoqué le déroulement de TM6 et son pli modéré (environ 145 °) dans la structure PTH1R liée à PCO371, qui est distincte du TM6 fortement plié (environ 90 °) dans la structure PTH1R liée à PTH (Extended Data Fig. 5b). La superposition des structures PTH1R liée à PCO371 et PTH1R liée à PTH a révélé que PCO371 se heurtait spatialement à la conformation TM6 fortement pliée dans PTH1R liée à PTH (Fig. 2d). De plus, la conformation TM6 modérément coudée du PTH1R lié à PCO371 s'est heurtée spatialement à l'extrémité amino-terminale de la PTH dans la structure PTH1R liée à la PTH (Fig. 2d), conformément aux expériences précédentes de compétition de ligand18. La superposition des structures actives de GPCR de classe B1 a révélé les angles de pli pratiquement identiques de TM6 (environ 90 ° à 100 °) dans les structures actives de GPCR de classe B1 liées à des agonistes endogènes ou chimiques (Fig. 2e, à gauche, et Données étendues Fig. 5c, en haut et milieu). Ainsi, le pli modéré (environ 145 °) dans TM6 causé par la liaison PCO371 est distinct des autres structures actives, et l'angle est intermédiaire entre les angles dans les structures PTH1R actives (92 °) et inactives (164 °) (Fig. 2e, au centre et à droite, et les données étendues Fig. 5c, en bas). Ces résultats indiquent que PCO371 se lie directement à la poche du transducteur intracellulaire et agit comme un coin moléculaire (Extended Data Fig. 5d). Cette position de liaison stabilise le mouvement vers l'extérieur significatif de la partie intracellulaire de TM6 sans propagation du signal du côté extracellulaire, qui est distinct de l'un des agonistes de classe B1 et des paires GPCR précédemment analysés.

Pour mieux comprendre le mécanisme d'activation de PTH1R induite par PCO371, nous avons comparé trois motifs clés parmi les GPCR de classe B1 : le motif actif PYQ (Pro6.47–Tyr6.53–Gln7.49) ; le commutateur PxxG (Pro6.47–x–x–Gly6.50) ; et le motif inactif HETY (His2.50–Glu3.50–Thr6.42–Tyr7.59)17,26. PTH liée à la poche orthostérique et réarrangement induit de manière allostérique pour reconstruire le réseau de liaisons hydrogène du motif actif PYQ (Données étendues Fig. 6a, b, à gauche). Ces changements de conformation ont facilité le pli prononcé de TM6 au niveau de Gly4186.50 dans le motif PxxG, déplaçant Leu4166.48 et Phe4176.49 (données étendues Figs. 6c, d). Le mouvement de Leu4166.48 et Phe4176.49 a créé un cluster hydrophobe et stabilisé la conformation vers l'extérieur de la moitié intracellulaire de TM6 (Extended Data Fig. 6d). Par conséquent, le Leu4166.48 déplacé a poussé Tyr4597.59, effondrant le motif inactif HETY et ouvrant la cavité intracellulaire pour l'hébergement de la protéine G (Extended Data Fig. 6e).

Le TMD de PTH1R lié à PCO371 a déformé le motif actif PYQ et le commutateur PxxG de TM6 dans la structure hélicoïdale, de la même manière que la structure PTH1R liée à ePTH (Figs. 2e et 3a – c et données étendues Fig. 6f, g ). Contrairement aux conformations inactives des motifs actifs PYQ et PxxG, le trifluorométhoxyphényle et les groupes spiro-imidazolone de PCO371 (Fig. 1d) se heurtaient sévèrement à Val4126.44 – Phe4176.49 et au motif inactif HETY dans la structure PTH1R liée à ePTH. , respectivement (Données étendues Fig. 6h,i). Pour éviter ce problème stérique, notre structure a montré que TM6 dans PTH1R lié à PCO371 était déroulé au niveau de Pro4156.47, ce qui indiquait que ce résidu est nécessaire à l'activation spécifique de PCO371 de PTH1R. Conformément à ces observations structurelles, une mutation du motif PYQ (Q4517.49A) et de celles du commutateur PxxG (L4166.48A, F4176.49A et G4186.50L) a sélectivement réduit l'accumulation d'AMPc induite par la PTH mais n'a pas affecté l'activité de PCO371 ( Fig. 3d et données étendues Fig. 7). En revanche, la mutation P4156.47L a aboli sélectivement et complètement l'activité PCO371 mais n'a montré aucun effet significatif sur l'activité PTH (Fig. 3d et Extended Data Fig. 7). Ces résultats indiquent que Pro4156.47 est essentiel pour l'activation médiée par PCO371 de PTH1R sans le réarrangement conformationnel du motif PYQ et du commutateur PxxG.

a, région TMD de PTH1R liée à PCO371. b, c, vue agrandie du motif actif PYQ et du commutateur actif PxxG. d, réponses GloSensor cAMP dans le PTH1R de type sauvage (WT) et le motif PYQ ou les mutants de commutation PxxG après stimulation par PTH ou PCO371. La concentration efficace demi-maximale logarithmique négative (pEC50) et les valeurs de réponse maximale (Emax) ont été calculées à partir des courbes concentration-réponse (données étendues Fig. 7a, c). *P < 0,05 et **P < 0,01, calculés à l'aide d'une analyse de variance à deux facteurs (ANOVA) suivie du test de Dunnett pour une analyse de comparaison multiple (en référence au WT). NS, pas significativement différent entre les groupes. e, Superposition de PCO371 – PTH1R – Gs, isoprotérénol – récepteur de l'adrénaline β1 (β1AR) – Gs et complexes formotérol – β1AR – β-arrestine, alignés sur TM2 – TM5. Les flèches noires indiquent les changements conformationnels caractéristiques de TM5 et TM6 dans les structures liées à Gs et à la β-arrestine (à gauche). PCO371 entre en conflit avec TM6 dans le cercle en pointillés (au centre et à droite). f, Courbes concentration-réponse du recrutement de la β-arrestine 1 et de la β-arrestine 2 à PTH1R après stimulation avec PTH ou PCO371. g, Co-localisation de PTH1R – β-arrestine 2 en réponse à PCO371 et à différentes concentrations de PTH. Quantification de la co-localisation de PTH1R et de la β-arrestine 2 après stimulation avec le véhicule, 100 nM PTH, 10 pM PTH ou 100 µM PCO371. L'indice de co-localisation des cellules individuelles dans chaque condition de stimulation a été calculé à l'aide de Fidji (ImageJ). Les symboles et les barres d'erreur représentent respectivement la moyenne et la sem de 10 à 19 cellules. *P < 0,05 et **P < 0,01, calculés à l'aide d'une ANOVA unidirectionnelle suivie du test de Dunnett pour une analyse de comparaison multiple en référence à la stimulation du véhicule. Les données proviennent de trois expériences indépendantes (d,f).

Données source

Généralement, la conformation TM6 est cruciale pour la liaison préférentielle de transducteurs spécifiques et la signalisation biaisée. Des études antérieures ont montré que la liaison préférentielle des protéines G nécessite le mouvement important vers l'extérieur de TM6 et une grande cavité intracellulaire, alors que pour les β-arrestines, elle nécessite un léger mouvement vers l'extérieur de TM6 et une petite cavité intracellulaire. PCO371 agit comme un coin moléculaire qui stabilise la conformation significativement vers l'extérieur de TM6 intracellulaire (Fig. 3e et Données étendues Figs. 5d et 8a, b), ce qui indique que PCO371 active préférentiellement les protéines G plutôt que les β-arrestines. Conformément à nos découvertes structurelles, les tests basés sur NanoBiT ont révélé que la liaison de PCO371 provoquait des signaux de recrutement négligeables pour la β-arrestine 1 et la β-arrestine 2 (Fig. 3f). Par la suite, pour démontrer de manière approfondie que PCO371 est un agoniste biaisé par la protéine G, nous avons observé la translocation intracellulaire de PTH1R – β-arrestine par microscopie confocale. Nous avons exprimé PTH1R fusionné à un Flag-tag et une β-arrestine 2 fusionnée à mVenus dans des cellules HEK293. Le récepteur a été marqué avec un anticorps Flag-M1 fusionné avec Alexa-647, et leur localisation membranaire et subcellulaire a été visualisée par microscopie confocale. La co-localisation intracellulaire de PTH1R et de β-arrestine 2 s'est produite 30 min après la stimulation avec une concentration élevée (100 nM) et une concentration faible (10 pM) de PTH (Fig. 3g et Extended Data Fig. 8c). En revanche, cette co-localisation intracellulaire n'a pas été observée après une stimulation avec une concentration élevée (100 µM) de PCO371, ce qui équivaut à une stimulation de 10 pM de PTH dans le dosage de l'AMPc (Fig. 3g et Extended Data Fig. 8c). Pris ensemble, nous concluons que PCO371 est un agoniste biaisé par la protéine G. Notre étude fournit des preuves structurelles que l'agoniste intracellulaire PCO371 active sélectivement les protéines G et qu'un mécanisme de signalisation directement biaisé peut être induit sans transduction de signal allostérique.

Notre structure a montré que PCO371 interagit avec la poche intracellulaire formée par les résidus hautement conservés des GPCR de classe B1 (Arg2192.46, His2232.50, Leu2262.53, Ile2993.47, Glu3023.50, Leu3063.54, Val4126.44, Leu4136 .45, Met4146.46, Pro4156.47, Leu4166.48, Phe4176.49, Gly4186.50, Phe4547.52, Tyr4597.57 et Asn4638.47) (Fig. 4a, b). Pour évaluer les applications potentielles impliquant cette poche, nous avons mesuré les niveaux de production d'AMPc induite par PCO371 dans tous les GPCR de classe B1 à l'aide d'un test d'accumulation d'AMPc. Remarquablement, PCO371 a activé 7 des 15 GPCR de classe B1 (Fig. 4c et Extended Data Fig. 8d). Nous avons comparé la similarité des séquences GPCR par une analyse d'arbre phylogénétique30 (calculée à l'aide de GPCRdb (https://gpcrdb.org/) et avons constaté que PCO371 active les récepteurs attribués au même groupe, le clade PTH1R, à l'exception de PTH2R et du récepteur du glucagon ( GCGR) (Fig. 4d).

a, région TMD de PTH1R liée à PCO371 (en haut) et vue agrandie de la région de liaison à PCO371 (au milieu et en bas). b, alignement des séquences d'acides aminés des GPCR humains de classe B1. Les résidus décrits interagissent avec PCO371. c, réponses GloSensor cAMP induites par PCO371 parmi les GPCR de classe B1. Les valeurs du graphique radar indiquent les valeurs logarithmiques de l'activité intrinsèque relative (∆log RIAPCO-peptide), qui est définie comme la valeur Emax/EC50 (RIAPCO) dans chaque récepteur normalisée par la valeur Emax/EC50 après stimulation par ses agonistes peptidiques endogènes (RIApeptide). Les lignes et les régions ombrées représentent les moyennes et les sem, respectivement, de trois expériences indépendantes, chacune réalisée en double. Notez que dans huit GPCR insensibles au PCO371 (PTH2R, GIPR, GLP-2R, GLP-1R, CRF1R, CRF2R, CALCR et CALRL), les valeurs RIAPCO n'ont pas pu être calculées. Par conséquent, les valeurs ∆log RIAPCO-peptide sont notées inférieures à -7. d, Arbre phylogénétique des GPCR de classe B1. Les récepteurs sensibles à PCO371 et insensibles à PCO371 sont indiqués respectivement par des lignes rouges et bleues. PCO371 active les membres du clade PTH1R, à l'exception de PTH2R et GCGR. e, Courbes concentration-réponse des réponses GloSensor cAMP de WT et du mutant L3706.47P (L370P) PTH2R après stimulation avec PTH ou PCO371. Les symboles et les barres d'erreur représentent les moyennes et les sem, respectivement, de trois expériences indépendantes réalisées en double.

Pour déterminer pourquoi PCO371 n'a pas réussi à activer PTH2R, nous avons étudié le résidu de leucine non conservé à la position 6,47. Étant donné que les GPCR de classe B1 adoptent largement le résidu proline en position 6.47, qui joue un rôle crucial dans la reconnaissance par PCO371 de PTH1R (Fig. 3d et Extended Data Fig. 6f), nous avons examiné si l'absence de réponse à PCO371 est causée par les différents acide aminé en position 6.47 dans PTH2R. Conformément à notre hypothèse, le mutant L3706.47P PTH2R a généré une accumulation d'AMPc en réponse à PCO371 (Fig. 4e et Extended Data Fig. 8e). Considérant que la PTH activait à la fois le type sauvage et P4156.47L PTH1R, alors que PCO371 n'activait pas P4156.47L PTH1R (Fig. 3d), nous avons conclu que Pro6.47 est un déterminant essentiel de l'activation du récepteur induite par PCO371.

Nos travaux ont révélé que PCO371 est un agoniste polyvalent pour sept GPCR de classe B1 (Fig. 4c, d), ce qui suggère que ce candidat-médicament de phase 1 disponible par voie orale pourrait être une graine de médicament prometteuse pour cibler ces récepteurs. Cependant, des questions subsistent concernant la sélectivité des récepteurs de PCO371 entre le clade PAC1R et les clades GLP-1R (Fig. 4d). Sur la base de comparaisons structurelles avec le GLP-1R lié au composé 2, nous supposons que le mouvement concomitant des moitiés extracellulaire et intracellulaire de TM6 est une caractéristique clé pour une activation spécifique. Le composé 2 est un agoniste intracellulaire qui se lie à l'extérieur du TM6 intracellulaire (données étendues Fig. 9a, b, à gauche). La structure GLP-1R liée au composé 2 présentait le pli net typique dans TM6, similaire aux structures actives orthostériques liées au peptide11 (Fig. 2e et Données étendues Fig. 9b, c). La conformation extracellulaire du GLP-1R est vraisemblablement réarrangée en conjonction avec le changement conformationnel du côté intracellulaire. Bien que ce changement de conformation à l'envers dans le GLP-1R soit une caractéristique commune observée dans d'autres GPCR, tels que les GPCR de classe A, un changement de conformation extracellulaire n'a pas été observé dans le PTH1R lié à PCO371. Ainsi, nous avons proposé que PCO371 n'active qu'un groupe de GPCR qui ne nécessitent pas le changement de l'intérieur vers l'extérieur de TM6 pour l'activation du récepteur, car PCO371 est incapable de se lier aux récepteurs qui adoptent la conformation extracellulaire généralement activée (Fig. 2d). Pour prouver cette hypothèse, nous avons conçu trois récepteurs chimériques - PTH1R (TM6 remplacé par celui de GLP-1R), PTH1R (TM6 remplacé par celui de PAC1R) et GCGR (TM6 remplacé par celui de GLP-1R) - et mesuré la production d'AMPc induite par PCO371. Notamment, ces récepteurs n'ont montré que des différences mineures dans leurs réponses de ligand endogène, ce qui suggère que ces récepteurs chimériques conservent leurs activités de récepteur (Extended Data Fig. 9d). De plus, PTH1R (TM6-GLP-1R) a complètement aboli la production d'AMPc par PCO371, tandis que PTH1R (TM6-PAC1R) a montré une production d'AMPc distinguable par PCO371 (Extended Data Fig. 9d). Conformément à notre idée, GCGR (TM6-GLP-1R) manquait également principalement de production d'AMPc par PCO371 (Extended Data Fig. 9d). Ces résultats appuient fortement notre proposition selon laquelle PCO371 active des récepteurs capables de mobiliser indépendamment la moitié intracellulaire de TM6 à partir de la moitié extracellulaire.

Dans cette étude, nous avons identifié une nouvelle poche agoniste intracellulaire de PTH1R et un processus d'activation atypique dans lequel PCO371 agit comme un coin moléculaire. Les structures GPCR de classe B1 rapportées précédemment ont révélé les mécanismes communs de la transduction du signal allostérique par les peptides et les petits agonistes chimiques qui se lient au site orthostérique, bien que les modes de liaison diffèrent entre les agonistes chimiques et les agonistes peptidiques (Extended Data Figs. 4 et 5). Contrairement à ces ligands précédemment rapportés, PCO371 se lie directement à la poche de transducteur intracellulaire de PTH1R et l'active sans nécessiter de transduction de signal allostérique du côté extracellulaire (Fig. 5). Ces résultats suggèrent que PCO371 traverse avec succès la membrane cellulaire et accède directement au côté intracellulaire ou à la région intramembranaire comme un lipide membranaire (Fig. 5). Au lieu d'induire le coude pointu typique dans TM6 à Gly4186.50, PCO371 déroule TM6 à Pro4156.47, ce qui est nécessaire à son activité (Figs. 3e et 5 et données étendues Fig. 6b, f). Notre étude a révélé un mécanisme distinct pour l'activation des GPCR, qui élargit le potentiel des stratégies de développement de médicaments.

Le mécanisme distinct d'activation et de sélectivité fonctionnelle de PTH1R. En haut, la PTH induit le réarrangement des parties extracellulaires de TM1, TM6 et TM7, ce qui provoque le mouvement vers l'extérieur de la partie intracellulaire de TM6 et la formation d'un coude au niveau de Gly4186.50. Le PTH1R lié à la PTH peut adopter des conformations préférentielles pour les protéines G et les β-arrestines, respectivement. En bas, PCO371 déplace directement la partie intracellulaire de TM6 vers l'extérieur et provoque la formation d'un coude modéré dans TM6 au niveau de Pro4156.47 sans nécessiter de réarrangement extracellulaire. Le PTH1R lié à PCO371 adopte uniquement la conformation préférentielle des protéines G en stabilisant la conformation vers l'extérieur de la partie intracellulaire de TM6. ECD, domaine extracellulaire.

Les poches de ligands intracellulaires ont suscité un intérêt considérable dans la pharmacologie des GPCR en raison de leur potentiel à interagir sélectivement avec et à activer des transducteurs de signal spécifiques. Jusqu'à présent, les structures d'antagonistes multiples, de modulateurs allostériques positifs et d'un modulateur ago-allostérique en complexe avec leurs GPCR correspondants ont été rapportées1,4,5,6,11,12 (Fig. 9a étendue). Bien que ces ligands se lient à la région intracellulaire de chaque GPCR, il n'y a pas de structure qui accueille un agoniste dans la poche du transducteur intracellulaire, ce qui limite les connaissances structurelles concernant la signalisation biaisée du côté intracellulaire. Notre structure fournit une vue détaillée d'un agoniste lié dans la cavité intracellulaire et interagissant directement avec une protéine G. Étant donné que les protéines G nécessitent une conformation à cavité ouverte, alors que les β-arrestines préfèrent une conformation fermée27,28,29, la taille de cette cavité est considérée comme essentielle pour l'agonisme biaisé (Fig. 3g – i et Extended Data Fig. 8a, b ). L'agonisme biaisé par la protéine G est bénéfique pour la découverte de médicaments avec les GPCR de classe B1, car l'activation de la β-arrestine médiée par les GPCR de classe B1 induit généralement une signalisation prolongée via l'endosome précoce, ce qui entraîne des effets indésirables31. PCO371 interagit directement avec le crochet C-terminal de Gαs, qui présente des séquences divergentes parmi les sous-unités Gα. Ainsi, les modifications de PCO371 peuvent acquérir une fonctionnalité sélective supplémentaire parmi les sous-types de protéines G (données étendues Fig. 9e, f).

Pour analyser plus en détail la sensibilité de PCO371 dans les GPCR de classe B1, nous avons superposé et soigneusement inspecté les GPCR actifs de classe B1 liés à un ligand endogène rapportés précédemment. Nous avons noté une conformation alternative de Asn5.50 entre le GCGR et le récepteur du polypeptide inhibiteur gastrique (GIPR), qui est génétiquement similaire mais avec une sensibilité différente pour PCO371 (Extended Data Fig. 10a, b). Les structures GPCR actives de classe B1 superposées ont montré que les récepteurs insensibles à PCO371 adoptaient la conformation Asn5.50 vers l'extérieur vers TM3, tandis que les récepteurs sensibles à PCO371 adoptaient la conformation vers l'intérieur vers le centre du récepteur (Fig. 4d et Données étendues Fig. 10c ). Nous avons également effectué trois simulations de dynamique moléculaire indépendantes, à partir de notre structure cryo-EM PTH1R liée à PCO371, et analysé la fonctionnalité d'Asn5.50 pour la reconnaissance de PCO371. Ces simulations ont montré que le TMD du récepteur maintenait une conformation active similaire à la structure cryo-EM et que PCO371 était lié de manière stable au récepteur (Extended Data Figs. 10d, deux panneaux supérieurs). La conformation Asn5.50 était stable dans sa position dans notre structure cryo-EM PTH1R liée à PCO371, qui est distincte de celle de la structure active GLP-1R liée à GLP-1 (identifiant de la banque de données protéiques (PDB) : 6X18) ( Données étendues Fig. 10d, deuxième à partir du bas, et 10e). Notamment, lors de la deuxième analyse, le récepteur a montré un état intermédiaire et PCO371 a créé une nouvelle interaction stable avec Asn3745.50 (Extended Data Fig. 10d, bas, 10f, g). Conformément à la simulation, le mutant N3745.50A PTH1R a réduit sélectivement l'activation du récepteur induite par PCO371, alors que ce mutant n'a eu aucun effet sur l'activation du récepteur induite par la PTH (Extended Data Fig. 10h). Ces résultats suggèrent que l'orientation de la chaîne latérale d'Asn3745.50 est cruciale pour la reconnaissance de PCO371 et que Asn3745.50 peut répondre à PCO371 lorsque sa chaîne latérale est orientée vers le centre du récepteur (Extended Data Fig. 10a – c). Combinés à nos simulations de dynamique moléculaire et à notre étude fonctionnelle, ces résultats suggèrent que Asn5.50 est l'un des déterminants de la reconnaissance et de la sensibilité de PCO371 dans les GPCR de classe B1. À l'avenir, la structure du GCGR lié à PCO371 pourrait fournir une compréhension complète de la sélectivité des récepteurs de PCO371.

Dans le développement de médicaments, la spécificité des récepteurs est cruciale pour l'efficacité et la sécurité thérapeutiques. Pour les GPCR, le noyau TMD partage une similitude de séquence élevée, tandis que les boucles extracellulaires et intracellulaires ont des séquences diverses. Ces différences indiquent que les agonistes gagnent en sélectivité vis-à-vis du récepteur en étendant le ligand vers l'extérieur du récepteur32. Notre structure a révélé que la cavité intracellulaire du PTH1R lié à PCO371 est étroitement scellée par Gs et que PCO371 ne peut pas interagir avec les boucles intracellulaires (Extended Data Fig. 11a, b). Au lieu de cela, la poche de liaison au ligand de PCO371 est ouverte latéralement entre TM6 et TM7, qui est accessible à l'hélice 8 (Données étendues Fig. 11b, à gauche). De plus, notre structure a visualisé une poche intracellulaire constituée de TM1, TM7 et de l'hélice 8, tournée vers la région membranaire. Étant donné que l'hélice 8 possède une diversité de séquences, une molécule de liaison liée à cette poche peut fournir une sélectivité du récepteur, conduisant au développement d'un ligand bitopique (Extended Data Fig. 11c, d). De plus, PTH1R possède un résidu cystéine non conservé en position 7.60 sur la boucle intracellulaire, reliant TM7 et l'hélice 8 (Extended Data Fig. 11c, droite). Notez que seuls PTH1R, PTH2R et CALCR ont le résidu cystéine en position 7.60, et PCO371 n'active pas CALCR et PTH2R. Ainsi, l'ajout d'un groupe fonctionnel covalent à PCO371 peut fournir une sélectivité du récepteur PCO371 vis-à-vis de PTH1R. Cβ de Cys7.60 est situé à 6,4 Å de O6 de PCO371 (Données étendues Fig. 11c, droite), et trois ou quatre résidus de carbone seraient suffisants pour connecter PCO371 et Cys7.60. De plus, des agents covalents précédemment signalés (composé 2) 11 pour le GLP-1R peuvent également être utiles dans la génération de ligands bitopique. Le composé 2 agit comme un agent de liaison covalente faible et se lie sélectivement à Cys3476.36. En optimisant la liaison du composé 2 à la cavité formée par TM6, TM7 et Gαs de PTH1R, un composé modifié 2-PCO371 peut devenir un agoniste sélectif de PTH1R.

En résumé, la poche de transducteur intracellulaire distincte identifiée dans cette étude peut avoir un large potentiel dans le développement de composés chimiques biaisés pour les agonistes, les antagonistes et les modulateurs allostériques. Nos résultats élargiront la compréhension globale des mécanismes d'activation des GPCR et fourniront de nouvelles stratégies pour la conception et le développement de thérapies ciblées par les GPCR.

Le plasmide codant pour le PTH1R humain (identifiant GenBank : U17418.1 ; résidus 27 à 491) a été construit et purifié comme indiqué précédemment17. La construction a été exprimée dans des cellules HEK293 GnTI (N-acétylglucosaminyltransférase I-négative) (American Type Culture Collection, CRL-3022) en utilisant le système BacMam (Thermo Fisher Scientific), et les cellules ont été cultivées et maintenues dans du milieu FreeStyle 293 (Gibco) à 37 °C, avec 8 % de CO2 dans des conditions humidifiées. Notez que les cellules ont été infectées par le baculovirus généré dans des cellules Sf9 (Life Technologies), additionné de butyrate de sodium 10 mM pour stimuler l'expression des protéines après 18 h et cultivées en suspension à 30 ° C pendant encore 48 h. Les cellules cultivées ont été recueillies par centrifugation (5 000 g, 10 min, 4 ° C) et rompues par sonication dans un tampon de lyse hypotonique (Tris-HCl 20 mM, pH 7, 5, NaCl 150 mM et 20% de glycérol). Les débris cellulaires ont été éliminés par centrifugation (10 000 g, 10 min, 4 °C). La fraction membranaire a été recueillie par ultracentrifugation à 180 000 g pendant 1 h, et solubilisée dans un tampon de solubilisation (20 mM Tris-HCl, pH 9,0, 200 mM NaCl, 1 % LMNG, 0,1 % CHS, 20 % glycérol et 100 μM PCO371) pendant 2h à 4°C. Les récepteurs solubilisés ont été séparés du matériau insoluble par ultracentrifugation à 180 000 g pendant 20 min et incubés avec de la résine Ni-NTA (Qiagen) pendant 30 min. Les micelles de détergent ont été remplacées par un lavage avec 20 volumes de colonne de tampon de lavage (Tris-HCl 20 mM, pH 9, 0, NaCl 500 mM, GDN 0, 03%, glycérol 10%, PCO371 100 μM et imidazole 30 mM). Le récepteur a été élué dans un tampon d'élution (20 mM Tris-HCl, pH 9,0, 500 mM NaCl, 0,01 % GDN, 10 % glycérol, 100 μM PCO371 et 300 mM imidazole). L'éluat a été traité avec la protéase TEV pour cliver l'étiquette GFP-His10 et dialyse contre un tampon de dialyse (Tris-HCl 20 mM, pH 9, 0, NaCl 500 mM, PCO371 100 μM et 10% de glycérol). Les étiquettes GFP-His10 clivées et les protéases TEV ont été éliminées avec de la résine Ni-NTA. Le récepteur a été purifié par chromatographie d'exclusion stérique sur une colonne Superdex 200 10/300 Increase, équilibrée en tampon SEC (20 mM Tris-HCl, pH 9,0, 150 mM NaCl, 0,01% GDN et 100 μM PCO371). Les fractions maximales ont été recueillies et concentrées à environ 5 mg ml–1.

Le plasmide codant pour les mini-G a été construit et purifié comme indiqué précédemment34. Mini-Gs a été exprimé dans des cellules d'Escherichia coli (BL21). Les cellules ont été cultivées dans du milieu LB additionné de 1 mM d'isopropyl-β-d-thiogalactopyranoside (IPTG) à 25 ° C. Après 20 h, les cellules ont été rompues par ultrasons dans un tampon hypotonique (Tris-HCl 20 mM, pH 7,5, NaCl 150 mM, MgCl2 2 mM et GDP 1 μM), et la protéine mini-Gs a été purifiée par chromatographie d'affinité Ni-NTA puis soumis à une chromatographie d'exclusion stérique sur une colonne HiLoad Superdex75 16/600.

Le rat Gβ1 et le Gγ2 bovin fusionnés avec His6-tag ont également été construits, exprimés et purifiés comme indiqué précédemment 17 . Les cultures cellulaires ont été cultivées jusqu'à une densité cellulaire de 4 × 106 cellules par ml dans du milieu Sf900 II (Gibco) pendant 60 h à 27 ° C. Les cellules ont été recueillies par centrifugation et lysées dans un tampon hypotonique. L'hétérodimère Gβ1-Gγ2 a été purifié par chromatographie d'affinité Ni-NTA puis soumis à une chromatographie d'exclusion stérique sur une colonne HiLoad Superdex75 16/600.

Les mini-G purifiés et Gβ1 – Gγ2 ont été mélangés et incubés pendant une nuit sur de la glace. Le mélange a été concentré et chargé sur une colonne d'exclusion de taille Superdex 75 10/300 et équilibré dans un tampon (Tris-HCl 20 mM, pH 7,5, NaCl 150 mM et GDP 1 μM). Les fractions de pic contenant l'hétérotrimère mini-Gs ont été regroupées et concentrées à 5 mg ml–1.

Le plasmide codant pour Nb35 a été préparé comme indiqué précédemment17,35. La protéine a été exprimée dans le périplasme de cellules E. coli C41 (Rosetta) cultivées dans du milieu LB additionné d'IPTG 1 mM pendant 20 h à 25 °C. Après 20 h, les cellules ont été collectées et dissociées par ultrasons dans un tampon hypotonique (Tris-HCl 20 mM, pH 7,5, NaCl 150 mM et MgCl2 2 mM), et la protéine Nb35 a été purifiée par chromatographie d'affinité Ni-NTA puis soumise à chromatographie d'exclusion stérique sur une colonne HiLoad Superdex75 16/600. Les fractions maximales ont été regroupées et concentrées à 3 mg ml–1.

PCO371 a été synthétisé à Chugai Pharmaceutical, et sa pureté et sa stabilité ont été confirmées par chromatographie liquide-spectrométrie de masse. Les protéines PTH1R liées à PCO371 purifiées ont été mélangées avec un excès molaire de 1,2 fois de mini-Gsβ1γ2 et un excès molaire de 1,5 fois de Nb35, et le mélange a été incubé sur de la glace pendant une nuit à pH 9,0. L'échantillon a été purifié à l'aide d'une résine d'affinité Ni-NTA et chargé sur une colonne d'exclusion de taille Superdex 200 10/300, équilibrée dans un tampon (20 mM Tris-HCl, pH 9,0, 150 mM NaCl, 0,01 % GDN et 100 μM PCO371) pour séparer le complexe des contaminants. Les fractions maximales du complexe PCO371 – PTH1R – hétérotrimère mini-Gs – Nb35 ont été regroupées et concentrées à 7 mg ml –1.

Le complexe purifié a été appliqué sur une grille de carbone trouée Quantifoil fraîchement déchargée (R1,2 / 1,3, Au, 300 mesh) à l'aide d'un Vitrobot Mark IV à 4 ° C dans une humidité de 100%. Les grilles préparées ont été transférées sur un microscope Titan Krios G4 (Thermo Fisher Scientific), fonctionnant à une tension d'accélération de 300 kV avec un filtre Gatan Quantum-LS Energy (GIF) et un détecteur direct d'électrons Gatan K3 Summit en mode nanoprobe EFTEM. Les images ont été collectées à un grossissement nominal de 105 K, correspondant à une taille de pixel calibrée de 0,83 Å par pixel (Université de Tokyo, Japon). L'ensemble de données a été acquis à l'aide du logiciel Serial EM (v.3.7.4), avec une plage de défocalisation de -0,8 à -1,6 μm. Chaque image a été dose-fractionnée en 72 images à un débit de dose de 7,5 e− pixel−1 s−1 pour accumuler une dose totale de 54,578 e− Å−2. Les 6 333 films à dose fractionnée ont été soumis à une correction de mouvement induite par faisceau à l'aide de RELION-3 (réf. 36), et la fonction de transfert de contraste et les paramètres de défocalisation ont été estimés à l'aide de CTFFIND4 (réf. 37). Les 4 880 293 particules ont été initialement sélectionnées à partir des 6 333 micrographies à l'aide de la fonction de sélection laplacienne de gaussienne dans RELION-3 et extraites à 3, 63 Å par pixel. Ces particules ont été soumises à plusieurs séries de classifications 2D et 3D. La meilleure classe contenait 109 422 particules, qui ont ensuite été réextraites avec une taille de pixel de 1,11 Å par pixel et soumises à un raffinement 3D. Le sous-ensemble homogène a été soumis à un raffinement de défocalisation par particule, à un raffinement d'inclinaison du faisceau, à un polissage bayésien et à un raffinement 3D. Le raffinement 3D final et le post-traitement ont produit des cartes avec une résolution globale à 2,9 Å selon le critère de corrélation de coquille de Fourier = 0,143. La stratégie de traitement est décrite dans Extended Data Fig. 2.

Le modèle initial du complexe PTH1R – Gs – Nb35 a été dérivé de la structure PTH – PTH1R – Gs – Nb35 (identifiant PDB: 7VVL), suivi d'un remodelage approfondi à l'aide de COOT-0.9.3 EL38. Les modèles de PCO371–PTH1R–Gs ont été réajustés manuellement à l'aide de COOT, affinés à l'aide de phenix.real_space_refine (v.1.14-3260)39 REFMAC540 et Servalcat41 par rapport aux cartes de travail, et validés dans MolProbity42.

Le système comprenait le PTH1R, le PCO371, la 1-phosphoryl-2-oléoylphosphatidylcholine (POPC), l'eau TIP3P et 150 mM de NaCl. Le modèle initial de PTH1R contenant les acides aminés 27 à 491 a été créé à l'aide de MODELLER (v.10.1)43, avec la structure cryo-EM de PTH1R en complexe avec PCO371 comme matrice. Les atomes d'hydrogène manquants ont été construits avec le programme VMD (v.1.9.3)44. La protéine a été intégrée dans la membrane POPC à l'aide du pipeline MemProtMD45. La charge nette du système de simulation a été neutralisée par l'ajout de 150 mM de NaCl. Le système de simulation était de 96 × 96 × 180 Å3 et contenait 123 567 atomes. Les topologies moléculaires et les paramètres du champ de force Charmm3646 ont été utilisés pour les molécules de protéines, de lipides et d'eau. La topologie moléculaire et les paramètres de PCO371 ont été préparés à l'aide du lecteur et modeleur de ligands CHARMM-GUI47,48.

Des simulations de dynamique moléculaire ont été réalisées avec le programme NAMD (v.2.13). Les systèmes de simulation ont été minimisés en énergie pour 1 000 étapes avec des positions fixes des atomes autres que l'hydrogène. Après minimisation, 1 000 autres étapes de minimisation de l'énergie ont été effectuées avec des contraintes de 10 kcal mol-1 pour les atomes autres que l'hydrogène, à l'exception des molécules lipidiques à moins de 5,0 Å des protéines. Ensuite, des équilibrages ont été effectués pendant 0,1 ns dans des conditions NVT, avec des contraintes de 10 kcal mol-1 Å-2 pour les atomes lourds des protéines. Enfin, l'équilibrage a été effectué pendant 2,0 ns dans des conditions NPT, avec les contraintes de 1,0 kcal mol-1 Å-2 pour tous les atomes Cα des protéines. Les cycles de production ont été effectués pendant 200 ns sans contraintes tout en maintenant une température constante à 310 K en utilisant la dynamique de Langevin et une pression constante à 1 atm en utilisant un piston Nosé-Hoover Langevin49,50. Les interactions électrostatiques à longue portée ont été calculées à l'aide de la méthode d'Ewald à mailles de particules50. Les simulations ont été effectuées trois fois de manière indépendante. Les résultats de la simulation ont été analysés et visualisés à l'aide de mdtraj (v.1.9.8)51, seaborn (https://zenodo.org/record/54844) et CUEMOL (v.2.2.3.443) (http://www.cuemol. org).

L'activation de Gs induite par PTH1R a été mesurée à l'aide du test d'accumulation d'AMPc GloSensor. Nous avons d'abord construit un plasmide dans lequel le gène PTH1R humain complet était fusionné en position N-terminale à l'étiquette d'épitope Flag avec la séquence signal précédente dérivée de l'hémagglutinine. Les cellules HEK293A ont été ensemencées dans une boîte de culture de 6 cm à une concentration de 2 × 105 cellules par ml (4 ml par puits dans du DMEM (Nissui Pharmaceutical) additionné de 10 % de FBS (Sigma, F7524, lot 0001641439) et de pénicilline–streptomycine– glutamine (DMEM complet)) 1 jour avant la transfection. La solution de transfection a été préparée en combinant 10 μl (par puits ci-après) de 1 mg ml–1 solution de polyéthylèneimine MAX (Polysciences) et un mélange de plasmide constitué de 1 000 ng de biocapteur Glo-22F cAMP (human codon-optimized and gene-synthetic)- codant pour les plasmides pCAGGS et 400 ng de plasmides Flag – PTH1R dans 400 µl d'Opti-MEM (ThermoFisher Scientific). Après incubation pendant 24 h, les cellules transfectées ont été recueillies à l'aide de PBS de Dulbecco contenant 0,53 mM d'EDTA (D-PBS), centrifugées et mises en suspension dans 2 ml de HBSS contenant 0,01 % de BSA (grade sans acide gras ; SERVA) et 5 mM d'HEPES. (pH 7,4) (tampon de dosage). La suspension cellulaire a été distribuée dans une plaque blanche à 96 puits à un volume de 40 μl par puits et chargée avec 10 μl de solution de d-luciférine potassique 10 mM (FujiFilm Wako Pure Chemical) diluée dans un tampon de dosage. Après 2 h d'incubation à température ambiante, la plaque a été mesurée pour la luminescence de base (SpectraMax L équipé de 2PMT, Molecular Devices ; SoftMax Pro (v.7.03), Molecular Devices) et 20 μl de ligand 6× dilué dans le tampon de dosage ou le tampon de dosage seul (véhicule) a été ajouté manuellement. La plaque a été lue pendant 20 min avec un intervalle de 30 s à température ambiante. Les comptages de luminescence sur 8 à 10 min après l'ajout de ligand ont été moyennés et normalisés par rapport aux comptages initiaux, et les changements de pli dans les signaux au cours du traitement par le véhicule ont été davantage normalisés à la forskoline (10 µM) et tracés pour la réponse d'accumulation d'AMPc. À l'aide du logiciel Prism 9 (GraphPad), la réponse a été ajustée à toutes les données à l'aide de la régression non linéaire. La pente variable (quatre paramètres) dans l'outil Prism 9 avec une contrainte de pente de Hill de valeur absolue inférieure à 2 a été utilisée. Les valeurs de pEC50 et Emax ont été obtenues à partir de la courbe de régression non linéaire des données moyennées. Pour l'analyse de comparaison multiple, une ANOVA unidirectionnelle ou bidirectionnelle suivie du test de Dunnett a été utilisée.

Le recrutement de la β-arrestine vers PTH1R a été mesuré à l'aide du test de recrutement de la β-arrestine NanoBiT52 avec des modifications mineures. En bref, la transfection de plasmide a été réalisée dans une boîte de culture de 6 cm avec un mélange de 200 ng de β-arrestine 1 fusionnée au grand BiT N-terminal (Lg-β-arrestine 1) ou Lg-β-arrestine 2 et 1 000 ng C Plasmides PTH1R (PTH1R-Sm) fusionnés au petit BiT terminal. Après 24 h d'incubation, les cellules transfectées ont été recueillies à l'aide de D-PBS contenant 0, 53 mM d'EDTA, centrifugées à 190 g pendant 5 min et mises en suspension dans 4 ml du tampon de test décrit pour le test GloSensor. La suspension cellulaire a été distribuée dans une plaque blanche à 96 puits à un volume de 80 μl par puits (ci-après plaque à 96 puits) et chargée avec 20 μl de coelenterazine 50 μM (Carbosynth) dilué dans le tampon de dosage. Après 2 h d'incubation à température ambiante, la plaque a été mesurée pour la luminescence de base (SpectraMax L équipé de 2PMT, Molecular Devices ; SoftMax Pro (v.7.03), Molecular Devices) et 20 μl de ligand 6× dilué dans le tampon de dosage ou véhicule a été ajouté manuellement. La plaque a été lue pendant 15 min avec un intervalle de 40 s à température ambiante. Les comptages de luminescence de 13 à 15 min après l'addition du ligand ont été moyennés et normalisés aux comptages initiaux. la réponse a été ajustée à toutes les données en utilisant la même procédure que celle décrite pour le test GloSensor.

L'expression de surface cellulaire de PTH1R a été mesurée à l'aide d'une méthode de cytométrie en flux décrite précédemment17. En bref, les cellules HEK293A ont été ensemencées dans une plaque de culture à 6 puits à une concentration de 2 × 105 cellules par ml 1 jour avant la transfection. La transfection a été réalisée en utilisant la même procédure que celle décrite pour le test GloSensor. Un jour après la transfection, les cellules ont été collectées en ajoutant 100 µl de D-PBS contenant 0,53 mM d'EDTA, puis 100 µl d'HEPES 5 mM (pH 7,4) contenant du HBSS. La suspension cellulaire a été transférée dans une plaque à fond en V à 96 puits et marquée par fluorescence avec un anticorps monoclonal anti-étiquette d'épitope Flag (DYKDDDDK) (clone 1E6, FujiFilm Wako Pure Chemicals ; 10 μg ml-1 dilués dans du sérum de chèvre à 2 % et D-PBS contenant 2 mM d'EDTA (tampon de blocage) et un anticorps secondaire IgG anti-souris de chèvre (H+L) conjugué avec Alexa Fluor 488 (1:200) (ThermoFisher Scientific, 10 μg ml–1 dilué dans le tampon de blocage Après lavage avec du D-PBS, les cellules ont été remises en suspension dans 100 ul de D-PBS contenant de l'EDTA 2 mM et filtrées à travers un filtre de 40 μm. L'intensité de fluorescence des cellules individuelles a été quantifiée à l'aide d'un cytomètre en flux (EC800 équipé d'un un laser de 488 nm, Sony). Le signal fluorescent dérivé d'Alexa Fluor 488 a été enregistré dans un canal FL1, et les données de cytométrie en flux ont été analysées à l'aide du logiciel FlowJo 10 (FlowJo). Les cellules vivantes ont été contrôlées avec une diffusion vers l'avant (FS- Peak-Lin) au réglage 390, avec une valeur de gain de 1, 7. Les valeurs d'intensité de fluorescence moyenne d'environ 20 000 cellules par échantillon ont été utilisées pour l'analyse.

La transfection a été réalisée à l'aide d'un mélange de 500 ng de plasmides mVenus – β-arrestin 2 et 200 ng Flag – PTH1R (par puits dans une boîte de 6 cm). Après incubation pendant 1 jour, les cellules transfectées ont été collectées et réensemencées sur une boîte à fond en verre recouverte de collagène de 35 mm (Matsunami). Après 1 jour, le milieu a été remplacé par du DMEM sans rouge de phénol ni FBS (tampon de famine). Après 1 h d'incubation, les cellules ont été incubées avec l'anticorps Flag-M1 marqué à l'Alexa-647 (1: 2 000) pendant 1 h, lavées une fois dans le tampon de famine et placées sur le microscope confocal. L'imagerie des cellules vivantes a été réalisée à l'aide du LSM880 avec Airyscan (Zeiss) équipé d'une lentille à immersion dans l'huile ×100/1,46 alpha-Plan-Apochromat et ImmersolTM 518F/37 °C (444970-9010-000, Zeiss). Au cours de l'imagerie des cellules vivantes, le plat a été monté dans une chambre (STXG-WSKMX-SET, TOKAI HIT) pour maintenir les conditions d'incubation à 37 ° C et 5 % de CO2. Nous avons pris des images time-lapse bicolores avec les réglages suivants : intervalle de temps de 5 min ; durée totale de 35 min. La solution de ligand de 200 µl dans du BSA-HBSS à 0,01 % a été ajoutée entre les points de temps 1 et 2. Les images en série acquises ont été traitées par Airyscan à l'aide de Zeiss ZEN 2.3 SP1 FP3 (noir, 64 bits) (v.14.0.21.201). L'analyse de co-localisation a été réalisée à l'aide de Fiji (v.2.0.0-rc-69/1.52p).

De plus amples informations sur la conception de la recherche sont disponibles dans le résumé des rapports sur le portefeuille Nature lié à cet article.

Les coordonnées atomiques du complexe PTH1R – mini-Gsβ1γ2 – Nb35 lié à PCO371 ont été déposées dans la PDB sous le code d'accession 8GW8. Les données de microscopie électronique associées ont été déposées dans la banque de données de microscopie électronique sous le code d'accession EMD-34305. Toutes les autres données sont fournies avec ce document. Les données sources sont fournies avec ce document.

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Nous remercions R. Danev et M. Kikkawa pour la mise en place de l'infrastructure cryo-EM ; K. Ogomori pour l'assistance technique ; K. Sato, S. Nakano et A. Inoue de l'Université de Tohoku pour leur aide dans la préparation des plasmides et les tests GPCR basés sur les cellules ; et K. Yamashita pour la validation du modèle. Ce travail a été soutenu par les subventions JSPS KAKENHI JP20J21820 (K. Kobayashi), JP21H05037 (ON), JP21H04791 (AI), JP21H05113 (AI), JP18H05425 (TM), JPJSBP120213501 (AI) et JPJSBP120218801 (AI); JP19gm5910013, JP20gm0010004, JP20am0101095, JP22ama121038 et JP22zf0127007 (AI) de l'Agence japonaise pour la recherche et le développement médicaux (AMED) ; JP22am0101115, JP22ama121002 (numéro d'assistance 3272), JP22ama121012 (numéro d'assistance 4826) et JP233fa627001 (ON) ; JPMJFR215T et JPMJMS2023 (AI) de l'Agence japonaise des sciences et technologies (JST); Programme JST CREST 20344981 (Ont.); Fondation scientifique Takeda (IA); la Fondation commémorative d'Uehara (AI); Fondation de recherche biochimique de Tokyo (AI); et la Fondation Daiichi Sankyo des sciences de la vie (AI); et une bourse de recherche de Chugai Pharmaceutical (AI, TM et ON). Des graphiques et des analyses moléculaires ont été réalisés à l'aide de l'UCSF ChimeraX 1.0, développé par la Resource for Biocomputing, Visualization, and Informatics de l'Université de Californie à San Francisco, avec le soutien des National Institutes of Health (R01-GM129325) et de l'Office of Cyber Infrastructure et biologie computationnelle, Institut national des allergies et des maladies infectieuses.

Atsuhiro Tomita

Adresse actuelle : Preferred Networks, Tokyo, Japon

Ces auteurs ont contribué à parts égales : Kazuhiro Kobayashi, Kouki Kawakami

Département des sciences biologiques, Graduate School of Science, Université de Tokyo, Tokyo, Japon

Kazuhiro Kobayashi, Tsukasa Kusakizako, Atsuhiro Tomita, Michihiro Nishimura, Kazuhiro Sawada, Hiroyuki H. Okamoto et Osamu Nureki

École supérieure des sciences pharmaceutiques, Université du Tohoku, Sendai, Japon

Kouki Kawakami, Suzune Hiratsuka, Gaku Nakamura, Riku Kuwabara et Asuka Inoue

Division de la recherche, Chugai Pharmaceutical, Shizuoka, Japon

Hiroshi Noda, Hiroyasu Muramatsu et Masaru Shimizu

Laboratoire de physiopathologie des organites, Département des sciences de la vie intégratives, École supérieure des sciences de la vie, Université de Tohoku, Sendai, Japon

Tomohiko Taguchi

Département de chimie, École supérieure des sciences, Université de Chiba, Chiba, Japon

Takeshi Murata

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K. Kobayashi a conçu toute l'expérience. K. Kobayashi. KS et HHO ont construit et purifié les plasmides. K. Kobayashi a purifié l'hétérotrimère mini-Gs, Nb35 et PTH1R lié à PCO371, et a préparé les grilles complexes et cryo-EM. K. Kobayashi, K. Kawakami, SH et HN ont effectué les tests de mutation et les analyses. HM et MS ont effectué des analyses et dirigé ce programme en se basant sur leur expertise biologique. K. Kobayashi et TK ont collecté les données cryo-EM, et K. Kobayashi a traité les données cryo-EM. K. Kobayashi a construit des modèles et effectué des modélisations et des raffinements. AT a conçu le système de simulation de dynamique moléculaire. AT et K. Kobayashi ont réalisé et analysé la simulation de dynamique moléculaire. K. Kobayashi a préparé le manuscrit initial, et K. Kobayashi, K. Kawakami, AT, TK et MN ont rédigé le manuscrit avec la contribution de tous les auteurs. TK, AI, TM et ON ont supervisé la recherche.

Correspondance à Asuka Inoue, Takeshi Murata ou Osamu Nureki.

ON est co-fondateur et administrateur externe de Curreio Inc. HN, HM et MS sont des employés de Chugai Pharmaceutical. Tous les autres auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Nature remercie Sudarshan Rajagopal et les autres évaluateurs anonymes pour leur contribution à l'évaluation par les pairs de ce travail. Les rapports des pairs examinateurs sont disponibles.

Note de l'éditeur Springer Nature reste neutre en ce qui concerne les revendications juridictionnelles dans les cartes publiées et les affiliations institutionnelles.

Sensibilité au pH des réponses GloSensor cAMP de PTH1R lors de la stimulation avec PTH et PCO371. Notez que nous avons ajusté le tampon de dosage (voir aussi Méthodes) au pH indiqué. Les symboles et les barres d'erreur représentent la moyenne et le SEM, respectivement, de trois expériences indépendantes, chacune réalisée en double.

( a ) Micrographie représentative de 6 333 images de l'ensemble de données PCO371 – PTH1R – Gs, montrant la distribution des particules PCO371 – PTH1R – Gs. (b) Moyennes de classes bidimensionnelles représentatives, indiquant les caractéristiques de la structure secondaire. Le diamètre des fenêtres circulaires est de 18 nm. ( c ) Flux de travail de traitement des données pour le complexe PCO371 – PTH1R – Gs après classification 3D. ( d ) Courbes de corrélation de coquille de Fourier (FSC) étalon-or, indiquant une résolution globale globale à 2, 9 Å.

( a ) Cartes et modèles de densité Cryo-EM pour PTH1R et PCO371. (b) Validation croisée de chaque modèle affiné à l'aide de deux demi-cartes. Le surajustement des modèles raffinés a été testé avec une méthode de validation croisée décrite précédemment53.

( a ) Comparaison du complexe PCO371 – PTH1R – Gs avec des complexes GPCR endogènes de classe B1 liés à des peptides et à des agonistes chimiques orthostériques. Comme il n'y a pas de structure de structure PTH1R liée à un agoniste chimique orthostérique, nous avons utilisé LY3502970 (un agoniste propriétaire du récepteur GLP-1) –GLP-1R –G pour représenter les structures des GPCR de classe B1 liés à un agoniste chimique orthostérique. Les vues orthogonales et les modèles montrent PTH–PTH1R–Gs (PDB : 7VVL), PCO371–PTH1R–Gs (8GW8) et LY3502970–GLP-1R–Gs (PDB : 6XOX). Vert, PTH1R lié à la PTH ; orange, PTH; jaune, domaine de type Ras mini-Gs; tomate, Gβ1; marine, Gγ2; bleu poudre, Nb35; violet, PTH1R lié à PCO371; cramoisi, GLP-1R lié à LY3502970; bleu ciel, LY3502970. Gris, PTH–PTH1R–Gs ; violet, PCO371–PTH1R–Gs ; rouge, LY3502970–GLP-1R–Gs. La carte PTH1R liée à PCO371 ne montre aucune densité évidente de type ligand dans la poche orthostérique, contrairement aux cartes PTH1R liée à PTH et GLP-1R liée à LY3502970. ( b ) Vues en coupe des structures PTH1R et GLP-1R liées aux peptides endogènes et des structures GLP-1R liées aux agonistes chimiques. Vert, PTH1R lié à la PTH ; orange, PTH; blanc, GLP-1R ; jaune-vert, GLP-1; violet, PTH1R lié à PCO371; cramoisi, PCO371; jaune, GLP-1R lié au CHU-128; bleu-violet, CHU-128; violet, GLP-1R lié au danuglipron (PF-06882961); kaki, PF-06882961; rouge, GLP-1R lié à LY3502970; bleu ciel, LY3502970. Seul PCO371 se lie dans la cavité intracellulaire, alors que d'autres agonistes se lient de diverses manières à la poche orthostérique.

( a ) Quatre GPCR actifs de classe B1 (vert, PTH1R; blanc, GLP-1R; rose, récepteur du glucagon [GCGR]; violet, récepteur du facteur de libération de la corticotropine 1 [CRF1R]) sont superposés sur des structures inactives ou de type inactif. ( b ) PTH1R lié à PTH et PTH1R lié à PCO371 sont superposés sur la structure PTH1R inactive liée à ePTH (vert, PTH1R lié à PTH; orange, PTH; violet, PTH1R lié à PCO371; magenta, PCO371; gris, ePTH -lié à PTH1R). Le PTH1R lié à PCO371 présentait le pli modéré dans TM6 (environ 145 °), tandis que le PTH1R lié à PTH présentait le pli prononcé typique dans TM6 (environ 90 °). ( c ) Angle TM6 constitué des trois atomes Cα des résidus I / M / V6.39, G6.50 et A / V / L6.54. ( d ) PCO371 stabilise directement la moitié intracellulaire de TM6 dans la conformation extérieure, ce qui augmente le volume dans la cavité interne et active la protéine Gs.

( a ) Région TMD du PTH1R lié à PCO371. L'œil et le carré indiquent les vues en (c–h). ( b ) Réseaux polaires centraux de PTH1R actif lié à la PTH (gauche, violet), PCO371- PTH1R (centre, vert) et PTH1R inactif lié à l'ePTH (droite, gris). ( c – h ) Les structures superposées de PTH1R lié à PTH (vert), PCO371-PTH1R (violet) et PTH1R lié à ePTH (gris) sont représentées parallèlement à la membrane. Vues agrandies du motif actif PYQ et du commutateur actif PxxG (c–d et f–g). Vues agrandies du motif HETY inactif (e et h). ( i ) Structures superposées de PCO371 (cramoisi) et de PTH1R lié à ePTH.

Relatif à la figure 3d. ( a – c ) Activation de Gs induite par PTH1R mesurée par le test d'accumulation d'AMPc GloSensor et expression à la surface cellulaire de WT et de PTH1R mutant évaluée par l'analyse de cytométrie en flux. ( a ) Courbes concentration-réponse de la réponse GloSensor cAMP dans des cellules transfectées par WT PTH1R ou fictives lors d'une stimulation par PTH ou PCO371. Les symboles et les barres d'erreur représentent la moyenne et le SEM, respectivement, de trois expériences indépendantes, chacune réalisée en double. (b) Expression de la surface cellulaire. Les symboles et les barres d'erreur représentent respectivement la moyenne et le SEM, et les points montrent les données individuelles de quatre expériences indépendantes, chacune réalisée en double. L'analyse statistique a été effectuée par ANOVA unidirectionnelle suivie du test de Dunnett pour l'analyse de comparaison multiple (en référence au WT). ns, pas significativement différent entre les groupes. ( c ) Courbes concentration-réponse de la réponse GloSensor cAMP de WT (lignes pointillées) et du mutant (lignes pleines) PTH1R lors de la stimulation PTH (bleu) ou PCO371 (rouge). Les symboles et les barres d'erreur représentent la moyenne et le SEM, respectivement, de trois expériences indépendantes, chacune réalisée en double.

( a ) Les structures TMD de PTH1R lié à PCO371 (violet) et PCO371 (cramoisi) sont représentées parallèlement à la membrane. ( b ) Structures superposées des complexes PCO371 – PTH1R – G et formotérol – β1AR – β-arrestine, alignées sur les TM 2-5. PCO371 facilite la conformation extérieure de la partie intracellulaire de TM6 et entre en conflit avec la β-arrestine. ( c ) Images représentatives de la localisation cellulaire du PTH1R marqué par Alexa-647 (magenta) et de la β-arrestine 2 fusionnée avec mVenus (vert), liées à la Fig. 3g. Ces images obtenues à partir de 10-19 images de ces expériences. ( d ) Courbes concentration-réponse de la réponse GloSensor cAMP de 15 GPCR de classe B1 lors de la stimulation d'un agoniste peptidique endogène (bleu) ou de PCO371 (rouge). Les agonistes peptidiques endogènes suivants ont été utilisés pour chaque GPCR ; PTH (1–34), PTH2R : hormone de libération de l'hormone de croissance, GHRHR ; Sécrétine, SCTR ; Polypeptide activant l'adénylate cyclase hypophysaire (PACAP, 1–27), VIP1R et VIP2R ; PACAP (1–38), PAC1R ; Glucagon, GCGR ; Polypeptide inhibiteur gastrique, GIPR ; Glucagon-like Peptide 2, GLP-2R; Glucagon-like Peptide 1, GLP-1R; facteur de libération de la corticotropine, CRF1R et CRF2R ; Calcitonine, CALCR ; Peptide lié au gène de la calcitonine, CALRL. Tous les peptides sont des séquences d'origine humaine. Les symboles et les barres d'erreur représentent la moyenne et le SEM, respectivement, de trois expériences indépendantes, chacune réalisée en double. ( e ) Expression de surface cellulaire de WT et de PTH2R mutant évaluée par l'analyse de cytométrie en flux. Les symboles et les barres d'erreur représentent respectivement la moyenne et le SEM, et les points montrent les données individuelles de quatre expériences indépendantes, chacune réalisée en double. L'analyse statistique a été réalisée par test t bilatéral. ns, pas significativement différent entre les groupes.

( a ) Les structures TMD de PTH1R lié à PCO371 et de six GPCR liés à un ligand intracellulaire sont présentées parallèlement à la membrane ou du côté intracellulaire. Violet, PTH1R lié à PCO371 ; magenta, PCO371; orange, composé 2-lié GLP-1R; bleu, composé 2, jaune, récepteur de chimiokine à motif CC (CCR2)-RA-[R]-CCR2 lié ; violet, CCR2-RA-[R] ; jaune-vert, CCR7 lié à cmpd2105; prune, cmpd2105; CCR6 vert, lié au vercirnon; brun, vercirnon; bleu poudre, β2AR lié au cmpd-15PA; corail, cmpd-15PA; cyan clair, β2AR lié au cmpd-6FA; or, cmpd-6FA. ( b, c ) Structures superposées du GLP-1R lié au composé 2, du GLP-1R lié au GLP-1, du GLP-1R lié au LY3502970 et du GLP-1R inactif. GLP-1R lié au GLP-1 blanc ; kaki, GLP-1; rouge, lié au LY3502970 GLP-1R; bleu ciel, LY3502970; gris, GLP-1R inactif. Le composé2 se lie à la partie intracellulaire de TM6, et le GLP-1R lié au composé2 présente la conformation active identique de TM6. ( d ) Réponses GloSensor cAMP dans le PTH1R de type sauvage (WT) et les mutants remplacés par TM6 lors d'une stimulation par des agonistes endogènes (PTH ou glucagon) ou PCO371. Les symboles et les barres d'erreur représentent la moyenne et le SEM, respectivement, de trois expériences indépendantes, chacune réalisée en double. ( e ) Vue en coupe de PCO371 – PTH1R – Gs et vue agrandie de l'interface PCO371-G-protéine. La région Gαs interagissant avec PCO371 est colorée en orange. ( f ) Alignement de séquence du crochet C-terminal des protéines Gα.

( a ) Une vue en coupe du PTH1R lié à PCO371. ( b ) Une vue agrandie de la structure superposée du PTH1R lié à PCO371 (violet), du GCGR lié au GCG (orange) et du GIPR lié au GIP (gris). ( c ) Comparaison structurelle de N5.50 des récepteurs insensibles à PCO371 et des récepteurs sensibles à PCO371, liés à la figure 4d. Violet, PTH1R lié à PCO371 ; gris, récepteurs insensibles à PCO371 ; orange, récepteurs sensibles à PCO371. ( d ) Analyse de trajectoire de trois simulations indépendantes avec PTH1R lié à PCO371. Les deux panneaux du haut montrent que le PTH1R lié à PCO371 maintient une conformation active, ressemblant à notre structure cryo-EM. Le deuxième panneau à partir du bas montre l'angle dièdre de N3745.50. Les angles de PTH1R (bleu) et de GLP-1R (rouge) liés à PCO371 sont représentés par des lignes en pointillés. Le panneau inférieur montre la distance entre N3745.50-ND2 et PCO371-O1, représentant de manière stable l'interaction PCO371 avec N3745.50 dans un état intermédiaire. ( e ) Conformation distincte de N3745.50 entre le PTH1R lié à PCO371 et le GLP-1R actif lié au GLP-1 (PDB ID: 6X18). L'angle dièdre est calculé avec les angles N–Cα et Cβ–Cγ de N5.50. ( f ) Superposition de notre structure cryo-EM (violet) et d'un instantané représentatif de la simulation MD de 1, 5 µs dans l'exécution 2 de PTH1R lié à PCO371 (jaune). Dans la simulation, le récepteur a adopté une structure intermédiaire et PCO371 s'est déplacé vers TM5. ( g ) Comparaison de notre structure cryo-EM (violet) et d'une structure intermédiaire (jaune) observée dans la simulation. PCO371 n'interagit pas avec N3745.50 dans notre structure cryo-EM, alors qu'il crée une interaction stable avec N3745.50 dans la simulation. ( h ) accumulation d'AMPc de WT et de mutant N3745.50A avec PTH et PCO371. Le mutant N3745.50A réduit sélectivement la réponse PCO371. Les symboles et les barres d'erreur représentent respectivement la moyenne et le SEM, et les points montrent les données individuelles de trois expériences indépendantes, chacune réalisée en double. * et ** représentent P < 0,05 et 0,01, respectivement, avec une ANOVA à deux voies suivie du test de Dunnett pour une analyse de comparaison multiple. ns, pas significativement différent entre les groupes.

( a ) Les structures TMD de PCO371 – PTH1R – G sont représentées parallèlement à la membrane. (b, c) Coupe transversale et vues agrandies du TMD. Le cercle en pointillés blancs montre une poche de liaison de ligand intracellulaire comprenant TM1, TM7 et Helix8 (panneau de gauche). La ligne pointillée blanche montre la distance entre Cβ de Cys7.60 et O6 de PCO371. ( d ) Alignement de séquence de la région C-terminale après TM7. La boîte rouge montre C4627.60 de PTH1R.

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Réimpressions et autorisations

Kobayashi, K., Kawakami, K., Kusakizako, T. et al. Activation du GPCR de classe B1 par un agoniste intracellulaire. Nature (2023). https://doi.org/10.1038/s41586-023-06169-3

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Reçu : 26 septembre 2022

Accepté : 04 mai 2023

Publié: 07 juin 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s41586-023-06169-3

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