Découverte de l'andrographolide hit analogue comme une puissante cyclooxygénase

Rapports scientifiques volume 13, Numéro d'article : 8147 (2023) Citer cet article

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La cyclooxygénase-2 (COX-2) est l'enzyme clé responsable de la conversion de l'acide arachidonique en prostaglandines qui présentent des propriétés pro-inflammatoires et, par conséquent, c'est une protéine cible potentielle pour développer des médicaments anti-inflammatoires. Dans cette étude, des approches chimiques et bio-informatiques ont été utilisées pour trouver un nouvel analogue puissant de l'andrographolide (AGP) en tant qu'inhibiteur de la COX-2 ayant de meilleures propriétés pharmacologiques que l'aspirine et le rofécoxib (témoins). La protéine COX-2 humaine entièrement séquencée en alpha (AF) (604AA) a été sélectionnée et validée pour sa précision par rapport aux structures protéiques COX-2 rapportées (PDB ID : 5F19, 5KIR, 5F1A, 5IKQ et 1V0X) suivies de plusieurs analyse d'alignement de séquences pour établir la conservation de la séquence. Le criblage virtuel systématique de 237 analogues d'AGP contre la protéine AF-COX-2 a donné 22 composés principaux sur la base du score d'énergie de liaison (< - 8,0 kcal/mol). Ceux-ci ont ensuite été sélectionnés pour 7 analogues par analyse d'amarrage moléculaire et étudiés plus avant pour la prédiction ADMET, les calculs de métriques d'efficacité des ligands, l'analyse mécanique quantique, la simulation MD, la simulation d'amarrage de l'énergie potentielle électrostatique (EPE) et le MM/GBSA. Une analyse approfondie a révélé que l'analogue A3 de l'AGP (3-[2-[(1R,4aR,5R,6R,8aR)-6-hydroxy-5,6,8a-triméthyl-2-méthylidène-3,4,4a, 5,7,8-hexahydro-1H-naphtalén-1-yl]éthylidène]-4-hydroxyoxolan-2-one) forme le complexe le plus stable avec l'AF-COX-2 présentant la valeur RMSD la plus faible (0,37 ± 0,03 nm) , un bon nombre de liaisons hydrogène (liaison H protéine-ligand = 11 et liaison H protéine = 525), score EPE minimum (− 53,81 kcal/mol) et MM-GBSA le plus bas avant et après simulation (− 55,37 et − 56,25 kcal/mol, respectivement) valeur par rapport aux autres analogues et témoins. Ainsi, nous suggérons que l'analogue A3 AGP identifié pourrait être développé comme un anti-inflammatoire végétal prometteur en inhibant la COX-2.

La cyclooxygénase (COX ou prostaglandine G/H synthase) joue un rôle essentiel dans la génération de médiateurs biologiques tels que les prostaglandines (PG), le thromboxane et les prostacylines de l'acide arachidonique. L'enzyme COX existe sous deux isoformes : (i) l'isoenzyme COX-1 est constitutivement active et principalement impliquée dans les fonctions homéostatiques telles que la régulation de l'agrégation plaquettaire et l'acidité gastrique ; (ii) en revanche, la forme isomérique COX-2 induit des conditions pathologiques telles que l'inflammation, la douleur et la fièvre1,2,3. Pour développer des médicaments anti-inflammatoires et analgésiques, la COX-2 est une cible viable et spécifique et divers médicaments inhibiteurs de la COX-2 ont été développés au cours des dernières décennies4. La COX-2 comprend une longueur de séquence de 604 acides aminés avec trois domaines principaux : (i) le domaine du facteur de croissance épidermique (EGF) (34-72 acides aminés), (ii) le domaine de liaison à la membrane (73-116 acides aminés), et (iii) le domaine catalytique qui contient les sites actifs COX et peroxydase [UniProt-P35354]. Les sites actifs de la COX et de la peroxydase sont spatialement distincts mais fonctionnellement liés5. La proximité de Tyr371 et Ser516 sont les acides aminés catalytiques critiques pour le site actif COX-26. Le résidu valine en position 509 dans la COX-2 forme une poche hydrophobe (HYD) sur son site actif et joue un rôle clé dans l'induction sélective de l'enzyme et donc de la réponse inflammatoire7,8.

La COX-2 catalyse la réaction en deux étapes : (i) la première étape est la réaction COX dans laquelle l'arachidonate est converti en PG-G2 qui se produit dans le canal HYD du noyau de la protéine et (ii) la deuxième étape est la réaction à la peroxydase dans laquelle PG-G2 est réduit en PG-H2 (un précurseur important de la prostacycline et exprimé lors de l'inflammation) qui a lieu au niveau du site actif contenant l'hème situé près de la surface de la protéine9. Les anti-inflammatoires non stéroïdiens (AINS), en particulier les coxibs et l'aspirine, réduisent l'inflammation en inhibant la synthèse de PG via une interaction covalente avec le résidu Ser-516 au niveau du site actif COX-210,11. Bien que ces médicaments soient sûrs et efficaces, ils peuvent provoquer une toxicité gastro-intestinale, ce qui a limité leur utilisation chez les patients très sensibles. Conception d'inhibiteurs sélectifs de la COX-2, y compris le célécoxib et le rofécoxib (coxibs), inhibent la COX-2 au lieu de la COX-1 afin de fournir un soulagement de la douleur et des propriétés anti-inflammatoires et de prévenir les malaises gastriques ressentis avec les AINS non sélectifs12,13,14 . Le rofécoxib est un AINS hautement sélectif en raison de l'absence d'acide carboxylique (donc moins irritant GI) et de la présence de deux grands cycles aromatiques liés à un hétérocycle central15. Outre la sélectivité et l'efficacité, le coût élevé du médicament, les effets cardiovasculaires indésirables potentiels et le risque accru d'AVC ischémique, l'utilisation des inhibiteurs de la COX-2 est controversée16,17,18. Par conséquent, il existe une demande urgente pour un médicament thérapeutique contre la COX-2 avec des effets secondaires minimes ou nuls, de préférence d'origine naturelle19.

Il a été démontré que les métabolites secondaires tels que les alcaloïdes, les terpénoïdes, les stilbènes, les flavonoïdes, les saponines et les acides gras ont une activité inhibitrice de la COX-220. Parmi ceux-ci, l'andrographolide (AGP), qui est obtenu à partir de la plante Andrographis paniculata, s'est avéré être un agent anti-inflammatoire naturel important ainsi que divers autres avantages pharmacologiques21,22,23. L'andrographolide est un inhibiteur covalent électrophile naturel, dérivé de la voie des terpénoïdes et privilégié avec les caractéristiques structurelles nécessaires à la liaison avec de multiples cibles24,25,26. Structurellement, l'AGP contient une architecture 3D complexe avec un nombre élevé de carbones hybrides sp3, une riche teneur en oxygène, une faible teneur en azote, une structure polycyclique avec des chaînes latérales aliphatiques et aucun cycle aromatique. De plus, les propriétés chimiques de l'andrographolide sont renforcées par le fragment α-alkylidène-β-hydroxy-γ-butyrolactone qui est un fragment électrophile spécifique qui lui permet de modifier de manière irréversible et covalente la protéine cible avec un résidu d'acide aminé contenant du thiol25. Cela fournit sensiblement à l'affinité de liaison avec la protéine cible et présente l'andrographolide comme un inhibiteur covalent efficace26,27.

Quelques groupes de recherche ont récemment tenté de comprendre les cibles des voies de signalisation de l'andrographolide impliquées directement ou indirectement dans la réaction inflammatoire28. Tran et al. (2020) ont rapporté l'activité anti-inflammatoire de l'andrographolide et de ses quelques dérivés dans un modèle de lésion pulmonaire aiguë induite par les lipopolysaccharides et ont souligné que les fractions α–Alkylidène-β-hydroxy-γ-butyrolactone et ent-labdane sont vitales pour l'anti-inflammatoire activité25. Daï et al. (2011) ont rapporté que l'AGP exerce son effet anti-inflammatoire accru en diminuant l'activité de l'oxyde nitrique synthase inductible par le sérum (iNOS), la production de NO et la production de PGE229. Récemment, Wang et al. (2019) ont rapporté que l'AGP et son dérivé inhibent efficacement l'expression induite par les lipopolysaccharides de la COX-2 dans les macrophages murins30. De même, d'autres groupes de recherche ont rapporté que l'andrographolide démontre une activité anticancéreuse en inhibant l'expression de la protéine COX-231,32. Bien que des efforts aient été faits pour prouver l'activité anti-inflammatoire de l'andrographolide, les paramètres pharmacocinétiques, c'est-à-dire une faible solubilité et une faible biodisponibilité sont les facteurs limitants pour le succès de son développement médicamenteux33.

Dans cette étude, une analyse informatique systématique est effectuée pour découvrir un nouvel analogue naturel d'andrographolide à base de plantes en tant qu'agent anti-inflammatoire contre l'enzyme COX-2 qui a une meilleure puissance, efficacité et sélectivité que l'aspirine et le rofécoxib (témoins). Des techniques de mécanique moléculaire de la chimioinformatique et des approches de mécanique quantique sont utilisées pour une enquête détaillée. La longueur complète de la séquence de la structure de la protéine AF-COX-2 humaine est utilisée après la validation par rapport à la structure cristalline 3D disponible. En outre, un alignement de séquences multiples a été effectué pour la longueur de la séquence d'acides aminés de la protéine afin de découvrir les régions conservées pour l'activité biologique. Un total de 237 analogues d'AGP sont utilisés pour le dépistage, suivis d'études d'amarrage pour les analogues touchés, la prédiction des paramètres ADMET, les calculs de métriques d'efficacité du ligand, l'analyse approfondie de la mécanique quantique et les études de rescoring MM/GBSA. En outre, la stabilité du complexe d'analogues AGP frappé a été évaluée par la simulation d'amarrage moléculaire et l'analyse de simulation d'amarrage de l'énergie potentielle électrostatique (EPE). Les résultats de la présente étude aident au développement d'un inhibiteur de la COX-2 à base de plantes en tant que futurs candidats anti-inflammatoires.

La structure 3D de la protéine COX-2 cristallisée (5F19, 5KIR, 5F1A, 5IKQ et 1V0X) a été extraite de la base de données PDB tandis que la structure prédite de la protéine COX-2 humaine, contenant 604 acides aminés, a été obtenue à partir de l'AlphaFold (AF ) (ID : AF-P35354-F1)34,35,36,37. La structure de la protéine a été validée par SAVES v6.0 (https://saves.mbi.ucla.edu/), ProSA et ProQ38,39,40,41,42. Pour l'exactitude de la structure de la protéine humaine AF-COX-2, les résultats de validation ont été comparés avec d'autres structures PDB cristallisées disponibles de COX-2, c'est-à-dire 5F19, 5KIR, 5F1A et 5IKQ, et le modèle prédit de COX-2 (1V0X). Avant toute analyse d'interaction, la structure de la protéine AF-COX-2 a été affinée par 3Drefine (https://3drefine.mu.hekademeia.org/)43. Par la suite, d'éventuelles poches de liaison pour la protéine AF-COX-2 ont été prédites par CASTp 3.0 et visualisées par Chimera44,45.

Pour vérifier la présence des acides aminés conservés dans la protéine AF-COX-2, un alignement de séquences multiples (MSA) a été réalisé à l'aide du programme PRALINE46. Pour la même chose, 10 espèces de mammifères différentes, à savoir Homo sapiens, Rattus norvegicus, Mus musculus, Ovis aries, Bos Taurus, Oryctolagus cuniculus, Cavia porcellus, Equus caballus, Neovison vison et Gallus gallus ont été sélectionnées et des séquences d'acides aminés de leurs COX- 2 protéines ont été extraites d'Uniprot (http://www.uniprot.org/). Les séquences d'acides aminés alignées résultantes ont été colorées en fonction de l'indice de conservation (0 à 10), dans lequel les séquences d'acides aminés hautement conservées parmi les espèces sont responsables de la fonction biologique particulière de la protéine47.

Un total de 237 analogues d'AGP ont été extraits de la base de données PubChem qui consiste en la fraction α, β-insaturée γ-lactone commune qui est responsable de l'activité biologique en formant un adduit avec les résidus au cours de l'interaction biologique25,26. Ensuite, les analogues ont été convertis en un format autodock PDBQT pour le criblage virtuel par Open Babel48,49. Le logiciel PyRx (AutoDock Vina) a été utilisé pour le criblage virtuel dirigé sur le site des analogues de l'AGP contre la protéine AF-COX-250. En outre, sur la base des résidus d'acides aminés en interaction présents pour le co-cristal d'aspirine et de rofécoxib dans la structure PDB 5F19 et 5KIR respectivement, les acides aminés à savoir His75, Arg106, Val330, Tyr334, Val335, Tyr341, Tyr371, Trp373, Arg499, Phe504, Glu510, Ser516 et Leu517 ont été choisis comme résidus de site actif dans la protéine AF-COX-2 pour la mise en place de la grille pour le criblage virtuel35,36. La boîte de la grille a été définie avec le centre de l'espace de recherche 4,76, 5,07 et − 0,12 à x, y et z, respectivement, avec 8 exhaustivité, tandis que les dimensions (Å) ont été définies pour la grille à x, y et z avec un valeur de 29,54, 29,74 et 27,37 chacun. Pour la présélection des analogues AGP à succès, la valeur seuil de l'énergie de liaison (BE) a été fixée à moins de - 8,00 kcal / mol.

Les analogues d'AGP obtenus à partir du criblage virtuel ont été soumis à une analyse d'amarrage moléculaire avec l'AGP, l'aspirine et le rofécoxib comme témoins. AutoDock4.2 a été utilisé pour l'amarrage dirigé de ces composés avec AF-COX-251. Étant donné que la structure de la protéine AF de COX-2 est une structure protéique prédite, les ligands co-cristallins, c'est-à-dire l'aspirine et le rofécoxib de la structure cristallisée existante de la protéine COX-2 5F19 et 5KIR, respectivement, ont été pris comme composés de référence pour l'analyse d'amarrage. En outre, les acides aminés, à savoir His75, Arg106, Val330, Tyr334, Val335, Tyr341, Tyr371, Trp373, Arg499, Phe504, Glu510, Ser516 et Leu517 ont été choisis comme résidus de site de liaison sur la base des résidus interagissant avec l'aspirine et le rofécoxib dans le 5F19 et Structures de l'APB 5KIR. La boîte de ceinture pour l'amarrage a été générée avec un espacement et une dimension de 0,375 Å le long des coordonnées x, y et z avec les valeurs de 84, 88 et 94, respectivement. Le centre de la grille a été défini sur le centroïde des résidus du site de liaison avec la dimension de 4,305, 4,394 et 1,611, respectivement, le long des axes x, y et z. En outre, GA (algorithme génétique) a été utilisé pour calculer les paramètres d'amarrage avec un nombre de 25000000 d'évaluations d'énergie, un nombre de générations de 27000 et une tolérance de 2,0 Å RMSC (root mean square cluster). L'algorithme génétique lamarckien a été utilisé pour effectuer une simulation d'amarrage. L'AutoGrid et l'AutoDock ont ​​été utilisés pour effectuer l'amarrage moléculaire et pour étudier la meilleure pose de liaison des ligands dans les complexes protéine-ligand. Enfin, les conformères du ligand avec l'énergie de liaison libre la plus faible ont été sélectionnés pour une analyse plus approfondie. Les fichiers de sortie obtenus à partir de l'étude d'amarrage ont été visualisés et analysés par ICM-Browser et Accelrys discovery studio visualizer52.

ADMETlab 2.0 a été utilisé pour prédire les paramètres physicochimiques, médicinaux, d'absorption, de distribution, de métabolisme, d'excrétion et toxicologiques de l'AGP et des analogues de l'AGP présélectionnés, ainsi que de l'aspirine et du rofécoxib53. Il a également été utilisé pour établir la similarité médicamenteuse de l'AGP et des analogues présélectionnés.

Les mesures d'efficacité de liaison du ligand ont été calculées en termes de constante d'inhibition (Ki), d'efficacité du ligand (LE), d'efficacité lipophile du ligand (LLE), de fonction de mise à l'échelle de l'efficacité du ligand (LE_Scale), de qualité d'ajustement (FQ) et d'efficacité du ligand corrigée de la lipophilie (LELP) en suivant l'Eq. (1–6)54,55,56,57,58.

Le package Spartan 20 (wavefun.com) a été utilisé pour calculer les descripteurs de mécanique quantique (QM) en termes d'orbitale moléculaire occupée la plus élevée (HOMO), d'orbitale moléculaire inoccupée la plus basse (LUMO), d'écart HOMO-LUMO (HLG) et de paramètres EPE pour évaluer les propriétés orbitales moléculaires, le potentiel électrostatique et élucider divers types d'interactions. Tous les composés chimiques ont été optimisés pour calculer les variables géométriques d'équilibre à l'état gazeux au sol en utilisant la théorie de la fonctionnelle de la densité (DFT) avec le potentiel d'échange à trois paramètres de Becke59. En outre, la fonctionnelle de corrélation de Lee Yang Parr (LYP), qui est une combinaison fonctionnelle d'échange de Becke avec un ensemble de base 6-31G*, a été utilisée pour calculer les géométries de l'état fondamental60,61,62.

La protéine AF-COX-2 native et ses complexes avec les analogues de l'AGP hit (dépistés à partir des études d'amarrage), l'AGP, l'aspirine et le rofécoxib ont été utilisés pour commencer les études de simulation MD. GROMACS 2019.2 a été utilisé pour réaliser la simulation MD63. Tous les paramètres topologiques des composés chimiques ont été obtenus à partir du serveur PRODRG64. Le champ de force GROMOS96 54a7 a été utilisé pour effectuer toutes les études de simulation65. En outre, un modèle d'eau à charge ponctuelle simple (SPC) explicite a été utilisé pour solvater le système dans un type de boîte de dodécaèdre. Le système a été neutralisé par l'ajout de contre-ions pour maintenir l'état résiduel protoné à un pH physiologique de 7,4. Par la suite, l'encombrement stérique initial a été éliminé par la méthode d'énergie de descente la plus raide pour 50 000 pas afin de minimiser le système. Par la suite, des ensembles NVT/NPT avec un intégrateur saute-mouton à une température de 300 K et une pression de 1,0 bar ont été utilisés pour équilibrer le système. La simulation MD a été exécutée pendant 100 ns pour chaque système équilibré avec 5000 trames. L'analyse de simulation statistique MD a été réalisée via WebGRO (https://simlab.uams.edu/) en calculant le RMSD (root-means-square-deviation), RMSF (root-mean-square-fluctuation), la surface moyenne par résidu, surface, volume et densité SAS (solvant-surface accessible), liaisons H (nombre de liaisons hydrogène dans la protéine ainsi qu'entre la protéine et le ligand) et valeur Rg (rayon de giration).

Pour évaluer la stabilité des adduits d'AGP, des analogues de hit, de l'aspirine et du rofécoxib avec la longueur de peptide sélectionnée d'AF-COX-2, l'étude de simulation d'amarrage EPE a été réalisée à l'aide de Spartan 20. Pour la même longueur de séquence d'acides aminés de 511 à 520 de AF-COX-2 (c'est-à-dire Val511, Gly512, Ala513, Pro514, Phe515, Ser516, Leu517, Lys518, Gly519 et Leu520) a été sélectionné comme peptide pour former les adduits avec les composés. Pour la même chose, un modèle composé d'un peptide de 10 résidus d'acides aminés et d'un ligand a d'abord été construit. Cela a été suivi par la minimisation de l'énergie avec l'option de mécanique moléculaire suivie des calculs en un seul point B3LYP/6-31G*. L'énergie de l'adduit a été obtenue directement à partir de la sortie des calculs. De plus, pour calculer les paramètres électroniques, les données relatives à l'ensemble de base B3LYP/6-31G* ont été prises comme le nombre d'électrons non appariés (multiplicité) = 0, la charge totale = le couplage neutre et la constante de couplage = l'énergie empirique et de stabilisation a été déterminée. en déduisant la somme de l'énergie des constituants individuels de l'énergie de l'adduit. Ensuite, l'EPE a été calculée pour chaque adduit et peptide qui caractérisait la distribution des électrons à la surface des composés66. Enfin, l'énergie de liaison des composés complexes avec le peptide a été calculée en utilisant l'équation suivante. (7).

Les énergies libres de liaison en termes de surface née généralisée de la mécanique moléculaire (MM/GBSA) des analogues à succès de l'AGP, AGP, aspirine et complexes de rofécoxib ont été calculées par Fast Amber Rescoring (FAR)67. Le champ de force ff14SB a été utilisé pour les petites molécules, tandis que le champ de force ambre généralisé2 (GAFF2) a été utilisé pour l'analyse des protéines68. En outre, la méthode AM1-BCC a été utilisée pour attribuer la charge partielle dans les analogues via un module d'antichambre d'Amber69,70.

La structure de la protéine COX-2 entièrement séquencée AF-P35354-F1, comprenant 1 à 604 acides aminés, a été utilisée dans cette étude, qui est modélisée par AlphaFold et utilise une méthode d'apprentissage automatique de pointe pour la modélisation des protéines. Avant d'effectuer toute analyse informatique, cette structure protéique a été validée en comparant la qualité globale de la protéine avec les quatre structures protéiques COX-2 cristallisées existantes (PDB ID : 5F19, 5KIR, 5F1A et 5IKQ) et une structure modélisée (PDB ID : 1V0X). Le tableau supplémentaire S1 résume les résultats obtenus à partir de SAVES, ProSA et ProQ pour toutes les structures protéiques, qui utilisent ERRAT, VERIFY, PROVE, Whatcheck, Procheck, Z score et LGscore pour évaluer la qualité de la protéine en calculant le facteur de qualité global , compatibilité d'un modèle atomique 3D avec sa séquence d'acides aminés, les volumes d'atomes, les paramètres stéréochimiques et la qualité stéréochimique. La structure de la protéine AF-COX-2 a passé avec succès les tests VERIFY et PROVE avec un facteur de qualité global de 97,74 % avec 90,9 % de résidus dans la raison la plus favorisée. De plus, les valeurs du score z et du score LG pour la protéine AF-COX-2 se sont avérées être respectivement de -8,97 et 7,639, ce qui indique que la structure de la protéine modèle AF-COX-2 est de bonne qualité40,42. En outre, la qualité globale de la structure de la protéine AF-COX-2 s'est avérée être la meilleure parmi toutes les autres structures en termes de paramètres de qualité, de compatibilité et de stéréochimie, et donc cette structure de protéine 3D a été utilisée pour d'autres études.

CASTp 3.0 a prédit 96 poches de liaison possibles pour la protéine AF-COX-2 (tableau supplémentaire S2). Ensuite, selon la forme, les cavités internes, la surface et les valeurs de volume des poches de liaison, les acides aminés de la deuxième poche de liaison (His75, Arg106, Phe191, Val214, Val330, Ile331, Tyr334, Val335, Leu338, Tyr341, Leu345 , Lys346, Gln358, Asn361, Tyr371, Trp373, Lys454, Arg455, Met457, Arg499, Phe504, Glu510, Phe515, Ser516, Leu517, Leu520, Met521) ont été sélectionnés pour un examen plus approfondi. Ensuite, les résidus du site de liaison pour l'étude ont été sélectionnés en fonction de l'interaction du rofécoxib et de l'aspirine présents dans la structure 5KIR et 5F19 PDB, respectivement. En outre, dans la structure 5KIR PDB, les résidus du site de liaison du rofécoxib se sont avérés être Val344, Trp387, Phe518, Tyr385, 355, Ser530, ​​Leu531, Arg120, 513, Glu524 et His90. Alors que, dans la structure PDB 5F19, les résidus du site de liaison de l'aspirine sont reconnus comme Tyr385, Ser530, ​​Leu531, Glu524, Arg120, 513 et His 90. Par conséquent, pour trouver le composé le plus efficace que le rofécoxib et l'aspirine, nous avons considéré le site de liaison résidus des deux composés. Par conséquent, nous avons sélectionné les résidus de liaison communs (Tyr385, Ser530, ​​Leu531, Arg120 et Glu524) ainsi que les résidus de liaison uniques présents sur le rofécoxib et l'aspirne. En conséquence, nous avons considéré les résidus His75, Arg106, Val330, Tyr334, Val335, Tyr341, Tyr371, Trp373, Arg499, Phe504, Glu510, Ser516 et Leu517 comme site de liaison dans cette étude pour la protéine AF-COX-2. Fait intéressant, l'analyse CASTp 3.0 a révélé que tous les résidus de site de liaison sélectionnés sont également présents dans la poche de liaison prédite pour l'AF-COX-2 et peuvent également être importants pour la liaison du ligand et l'inhibition des protéines71.

La protéine AF-COX-2 a une structure 3D modélisée sans ligand co-cristallisé, par conséquent, la prédiction du résidu du site de liaison dans la structure protéique raffinée a été réalisée en la comparant avec le site actif de la structure PDB cristallisée existante de COX-2 présent dans la base de données PDB. Pour la même chose, les structures 5F19 et 5KIR PDB de COX-2 ont été sélectionnées, qui ont respectivement de l'aspirine et du rofécoxib comme ligands co-cristallins. Sur la base des sites de liaison des deux ligands co-cristallins dans la structure protéique, les acides aminés His75, Arg106, Val330, Tyr334, Tyr341, Tyr371, Trp373, Arg499, Phe504, Glu510, Ser516 et Leu517 ont été sélectionnés comme sites actifs pour études d'interaction de liaison. Pour vérifier ces résidus en tant que site actif proéminent, un alignement de séquences multiples a été effectué à l'aide de la protéine COX-2 de 10 espèces de mammifères différentes, ce qui a prouvé qu'à l'exception de Arg499, tous les acides aminés sélectionnés sont entièrement conservés (Fig. S1 et tableau S3 supplémentaires ). Cela signifie également l'importance de ces acides aminés dans diverses fonctions biologiques et en tant que cible potentielle pour le développement de médicaments47.

Un ensemble de 237 analogues d'andrographolide constitués de la fraction γ-lactone α, β-insaturée commune qui est importante pour l'activité biologique a été criblé par rapport à la protéine AF-COX-2 validée à séquence complète pour découvrir un puissant composé anti-inflammatoire à base de plante25 ,26. Le criblage virtuel dirigé par le site a été utilisé pour découvrir les analogues de l'AGP à succès par une approche informatique. Il calcule l'énergie de liaison pour tous les analogues soumis par les résultats de l'interaction protéine-ligand. Par la suite, les complexes d'analogues énergétiquement plus favorables ont été sélectionnés pour une analyse plus approfondie. Les résultats de l'analyse de criblage virtuel ont révélé que l'énergie de liaison la plus faible était de - 8,80 kcal/mol pour PubChem ID : 132210370, tandis que l'énergie de liaison la plus élevée était de - 5,90 kcal/mol pour PubChem ID : 59876522 (tableau supplémentaire S4). Par la suite, sur la base de la valeur de coupure de l'énergie de liaison (- 8, 00 kcal / mol), 22 analogues d'AGP sur 237 ont été sélectionnés pour une analyse plus approfondie. Par conséquent, ces 22 analogues de l'AGP ont été soumis à des études d'amarrage moléculaire pour découvrir le puissant inhibiteur de la COX-2 avec l'AGP et les médicaments de contrôle (aspirine et rofécoxib).

Les valeurs d'énergie de liaison obtenues à partir de l'analyse d'amarrage moléculaire se sont avérées comprises entre − 9,35 kcal/mol (PubChem ID : 132210508) et − 3,2 kcal/mol (PubChem ID : 132217538) (tableau supplémentaire S5). En revanche, l'aspirine, le rofécoxib et l'AGP ont montré des valeurs d'énergie de liaison de - 5,61 kcal/mol, - 8,17 kcal/mol et - 7,95 kcal/mol, respectivement. Sur 22 analogues de l'AGP, 7 analogues à succès, nommés A1 à A7, ont été sélectionnés pour une analyse plus approfondie en fonction de la valeur de coupure de l'énergie de liaison inférieure à - 8,00 kcal/mol. En termes d'énergie de liaison, les sept analogues de hit ont montré une valeur moindre par rapport à l'aspirine et à l'AGP, tandis que cinq analogues (A1-A5) ont montré une valeur moindre que le rofécoxib (tableau 1), indiquant leur potentiel d'inhibition de la protéine COX-2.

Le schéma de liaison de l'AGP et de ses sept analogues sélectionnés par rapport aux inhibiteurs de la protéine COX-2 existants, c'est-à-dire l'aspirine et le rofécoxib (témoins), a été examiné pour comparer l'interaction de liaison moléculaire et l'analyse de la pose de liaison (tableau 2). Cette analyse révèle que les acides aminés Val335, Leu338, Ser339, Phe504, Val509 et Ala513 sont communs dans les interactions de tous les composés soumis avec la protéine AF-COX-2. De plus, les acides aminés Trp373, Gly512 et Ser516 sont partagés par l'aspirine, l'AGP et les analogues A1–A7, tandis que les résidus Leu78, Val102, Arg106, Tyr341, Leu345, Leu517 sont occupés par le rofécoxib, l'AGP et A1–A7. De plus, parmi tous les acides aminés en interaction, les résidus Arg106, Tyr371, Arg499, Met508, Val509, Glu510, Ala513 et Ser516 ont été impliqués dans l'interaction des liaisons H, tandis que Leu78, Val102, Arg106, Val335, Leu338, Tyr341, Leu345, Phe504 , Met508, Val509, Ala513, Leu517 ont été engagés dans l'interaction HYD. L'AGP et les analogues frappés A1 à A5 ont montré respectivement 3, 3, 4, 1, 3 et 4 liaisons H, alors qu'aucune liaison H n'a été formée dans le cas des analogues A6 et A7. Curieusement, il ressort du schéma de liaison que les analogues AGP et A1–A7 partagent les résidus d'acides aminés en interaction du site de liaison de l'aspirine et du rofécoxib de la protéine AF-COX-2 (Fig. 1 et 2), indiquant leur potentiel en tant que COX- 2 inhibiteur de protéine avec interaction de liaison améliorée. En outre, l'orientation de la liaison de l'AGP et des analogues de hit montre que la fraction oxalone est tournée vers le site de liaison de l'aspirine, tandis que la fraction naphtalène / naphtol est positionnée vers le site de liaison du rofécoxib (Fig. S2 supplémentaire).

Superposition d'aspirine, de rofécoxib, d'AGP et d'analogues de l'AGP hit au site de liaison de l'AF-COX-2. Tous les composés chimiques sont représentés sous forme de modèle de balle et de bâton, les protéines sous forme de ruban et les acides aminés en interaction sous forme de code à une seule lettre. Code couleur : gris clair = protéine AF-COX-2, surface pointillée bleue = poche de liaison à l'aspirine, surface pointillée rouge = poche de liaison au rofécoxib, bleu = aspirine, rouge = rofécoxib, jaune = AGP, vert = A1, orange = A2, magenta = A3, rose vif = A4, gris ardoise foncé = A5, cyan = A6 et prune = A7. Ce chiffre est tracé à l'aide d'ICM-Browser52.

Interactions de liaison 2D de l'aspirine (a), du rofécoxib (b), de l'AGP (c) et des analogues de l'AGP (A1–A7) (d–j) avec le site de liaison de la protéine AF-COX-2. Tous les composés chimiques sont représentés sous forme de modèle de balle et de bâton ; les acides aminés avec leur nombre sont représentés par un cercle avec un code à trois lettres et une ligne pointillée montre le site d'interaction des composés chimiques avec les acides aminés. Code couleur : vert = liaisons H, rose = interactions HYD.

Les propriétés physicochimiques, d'absorption, de distribution, de métabolisme, d'excrétion et toxicologiques de l'AGP et des analogues A1-A7 ont été prédites et comparées à l'aspirine et au rofécoxib pour évaluer leur similarité avec le médicament (tableau 3). Propriétés physicochimiques telles que le poids moléculaire (MW), le nombre d'accepteurs de liaisons H (nHA), le nombre de donneurs de liaisons H (nHD), la surface polaire topologique (TPSA) et le logarithme du coefficient de distribution n-octanol/eau (logP) ont été calculés pour tous les composés sélectionnés. De plus, les propriétés de la chimie médicinale, c'est-à-dire le score de similarité du produit naturel (NPscore), la règle de Lipinski et la règle de Pfizer, ont été analysées pour tous les composés. À l'exception du rofécoxib et de l'analogue A5, tous les composés remplissaient les critères de propriétés physicochimiques et de chimie médicinale pour les candidats de type médicament. En outre, les propriétés d'absorption telles que la perméabilité de Caco-2 (les lignées cellulaires d'adénocarcinome du côlon humain), l'activité inhibitrice de la Pgp (inhibiteur de la glycoprotéine P), l'absorption intestinale humaine (plage HIA 0-0,3) et F30% (la voie orale humaine biodisponibilité 30 %) ont également été calculées pour tous les composés. À l'exception du rofécoxib et de l'analogue A6, tous les composés remplissaient les critères pour être utilisés comme médicaments actifs par voie orale. De plus, les propriétés de distribution, par exemple la liaison aux protéines plasmatiques (PPB), le volume de distribution (VD), la pénétration de la barrière hémato-encéphalique (BBB) ​​et la fraction non liée dans le plasma (Fu) ont été prédites pour toutes les molécules étudiées. Les propriétés de distribution de l'AGP et des analogues A1-A7 se sont avérées dans la plage acceptable pour un candidat de type médicament. De plus, l'analyse cumulative des propriétés de métabolisme et d'excrétion a également favorisé l'AGP et l'analogue A1-A7 en tant que candidats médicaments potentiels. En outre, l'évaluation des propriétés toxicologiques a également prédit la nature non toxique des analogues A1-A7 AGP.

La qualité de liaison du ligand de la sélection a été calculée sur la base de la masse moléculaire et de la lipophilie dans le contexte de la cible protéique particulière. En règle générale, une valeur Ki faible fait référence à une puissance élevée et elle doit se situer dans la plage micromolaire pour qu'une molécule soit qualifiée de composé à succès ou principal55. L'efficacité du ligand (valeur seuil = 0,3 kcal/mol/HA) donne une idée de la capacité d'un composé à se lier pour sa taille à la protéine56. L'efficacité lipophile du ligand (valeur seuil = 3) permet de mesurer l'affinité d'une molécule vis-à-vis de la lipophilie qui est le facteur majeur de la promiscuité de la LLE sélective et des composés optimisés54,56,57. LE_Scale est une fonction de mise à l'échelle indépendante de la taille de l'efficacité du ligand et est dérivée en ajustant une fonction exponentielle aux valeurs maximales d'efficacité du ligand observées pour un atome lourd (HA) donné. La qualité d'ajustement (valeur seuil = 0,8), également appelée efficacité du ligand mise à l'échelle, inclut l'efficacité et la taille du ligand dans une seule métrique et les résultats en divisant le LE observé avec LE_scale55,56,58. Enfin, la LELP (plage acceptable = -10 à + 10) a été calculée et présente une métrique indiquant le prix de l'efficacité du ligand payé en lipophilicité54,55. De plus, l'énergie de liaison (BE) obtenue à partir des études d'amarrage (tableau 1), HA et LogP acquis à partir de la prédiction des propriétés physicochimiques (tableau 3) ont été prises pour le calcul de toutes les métriques LE. On peut observer à partir du tableau 4 qu'à l'exception de A5 et des contrôles (aspirine et rofécoxib), tous les analogues criblés présentent des valeurs respectives de métriques d'efficacité de ligand qui dépassent les seuils minimaux et doivent être appelés analogues HIT. De plus, en termes de constante d'inhibition, les analogues A1-A5 affichaient une valeur Ki plus petite que les témoins (aspirine Ki = 75,604 µM et rofécoxib Ki = 0,995 µM) et AGP (Ki = 1,440 µM) indiquant leur plus grande affinité de liaison vis-à-vis de l'inhibition de protéine COX-2 que les contrôles et l'AGP.

Les orbitales moléculaires frontières (FMO) telles que HOMO, LUMO et HLG ont été calculées pour anticiper les propriétés électroniques de l'AGP, des analogues frappés, de l'aspirine et du rofécoxib contre l'AF-COX-2. Dans le cas des analogues AGP et A1-A7, les orbitales HOMO et LUMO se localisent respectivement sur la fraction naphtalène / naphtol et oxalone, alors que, dans le cas de l'aspirine, les orbitales HOMO et LUMO se localisent sur la partie acide benzoïque de la structure. En revanche, les orbitales HOMO se limitent au fragment phényl-furane tandis que les orbitales LUMO se positionnent sur le fragment méthylsulfonylphény-furane du rofécoxib (Fig. 3). Le HLG entre deux états énergétiques, à savoir HOMO et LUMO, explique la réactivité chimique des molécules où la valeur HLG la plus faible induit une plus grande réactivité chimique et activité biologique, et une moindre stabilité du composé en facilitant la circulation des électrons72. Il joue également un rôle important dans la stabilisation du complexe protéine-ligand73. Les valeurs HLG se sont avérées être dans la gamme de 4,24 à 5,63 eV pour tous les composés étudiés avec l'ordre de A6 (5,63 eV) > A7 (5,51 eV) = A5 (5,51 eV) > aspirine (5,43 eV) > AGP ( 5,26 eV) > A4 (5,21 eV) > A2 (5,15 eV) > A3 (5,05 eV) > A1 (5,03 eV) > rofécoxib (4,24 eV). Sur la base de la valeur HLG, A1 et A3 présentent la plus grande réactivité chimique, tandis que A6 est la moins réactive et la plus stable.

Illustration des orbitales moléculaires HOMO et LUMO de l'aspirine (a), du rofécoxib (b), de l'AGP (c) et des analogues de hit de l'AGP {A1–A7} (d–j) avec leur HLG (HOMO–LUMO-GAP). La structure supérieure montre LUMO tandis que la structure inférieure représente les orbitales HOMO. Code couleur : rouge = potentiel le plus négatif ; bleu = potentiel le plus positif.

La carte EPE est utilisée pour prédire les sites actifs des interactions intermoléculaires en tant que distribution spatiale de la densité électronique sur les composés chimiques74,75. La figure 4 montre la carte EPE de l'aspirine, du rofécoxib, de l'AGP et de A1 – A7 dans laquelle la région de couleur bleue représente le potentiel le plus positif responsable de l'interaction nucléophile tandis que la couleur rouge indique le potentiel le plus négatif qui est le site d'interaction électrophile . Il ressort de l'analyse de la carte EPE que les groupes acétyloxy et carboxyle dans l'aspirine, les groupes méthylsulfonyle et furane dans le rofécoxib, et les groupes oxalone et hydroxyle de la fraction naphtalène dans l'AGP et les analogues de hit sont au potentiel négatif (région rouge) et donc ce sont les site important pour les interactions électrophiles. En revanche, le potentiel positif (région bleue), qui est un site potentiel d'interactions nucléophiles, se situe autour de l'hydrogène du groupe carboxyle de l'aspirine, du groupe phényle du rofécoxib et de la fraction naphtalène ou naphtol de l'AGP et des analogues A1-A7. Les EPE positives (kcal/mol) étaient de l'ordre de rofécoxib (36,24) < aspirine (59,54) < A7 (61,75) < A3 (62,15) < A4 (64,90) < AGP (65,08) < A1 (65,50) < A2 (65,79) < A6 (67,07) < A5 (68,07). La tendance négative de l'EPE (kcal/mol) était différente et suivait l'ordre de A7 (− 48,98) > AGP (48,97) > A3 (48,31) > A6 (-47,84) > A4 (− 46,65) > A2 (− 46,53) > A1(− 45,97) > A5 (− 43,98) > rofécoxib (−43,51) > aspirine (− 41,70) (Fig. 4). Comme la valeur négative de l'EPE favorise la formation de liaisons H plus fortes76, 77, l'AGP et ses analogues de frappe A1 – A7 ont montré un meilleur potentiel pour une interaction de liaisons H plus forte par rapport à l'aspirine et au rofécoxib.

Cartes d'énergie potentielle électrostatique de l'aspirine (a), du rofécoxib (b), de l'AGP (c) et des analogues de l'AGP {A1–A7} (d–j). Le code couleur des cartes de contours EPE montre la valeur la plus négative en rouge à la valeur la plus positive en bleu ; L'ordre des potentiels est : bleu (plus + ve) > vert > jaune > orange > rouge (plus -ve).

Structurellement, tous les analogues d'AGP criblés partagent l'échafaudage chimique principal qui se compose de deux groupes cycliques (c'est-à-dire naphtalène/naphtol et oxalone) liés à la fraction éthylédine. Les groupes bicycliques contenant des composés manifestent une myriade d'activités biologiques78. Ces groupes bicycliques contenant des médicaments interagissent principalement avec les protéines par le biais de résidus hydrophobes et aromatiques. De plus, il a également été démontré que les composés bicycliques interagissent avec les groupes polaires tels que l'hydroxyle et les amides de l'acide aminé79. Dans cette étude, parmi les analogues AGP sélectionnés, il existe deux stéréoisomères A1 (6S)/A3 (6R) et A2 (6S)/A4 (6R), alors que les analogues A5, A6 et A7 sont distincts les uns des autres. Par rapport à l'AGP, les analogues A1 à A5 diffèrent structurellement aux positions 5 et 6 du fragment naphtalène, tandis que le reste de l'échafaudage chimique est le même. A la place du naphtalène, les analogues A6 et A7 possédaient une fraction naphtol et avaient un groupe différent à la 3ème position du cycle naphtol. En outre, l'analyse des interactions moléculaires a révélé que parmi les analogues sélectionnés, les composés contenant le groupement naphtalène présentaient plus d'affinité que le naphtol envers la protéine COX-2 en termes d'énergie de liaison, de liaisons H et d'interactions HYD (tableaux 1 et 2). Il ressort de la figure 2 et du tableau 2 de l'analyse des interactions moléculaires que la fraction oxolane est principalement impliquée dans l'interaction de la liaison H tandis que la fraction naphtalène / naphtol concerne principalement les interactions HYD. Cela a été confirmé par l'analyse des descripteurs de mécanique quantique. Structurellement, par rapport à l'AGP, l'analogue A1-A4 a un groupe -OH de moins en 5ème position dans le groupement naphtalène, ce qui augmente la durée d'action de ces analogues, ce qui a été prouvé par la prédiction ADMET (tableau 3). Cela augmente encore l'interaction HYD de ces types d'analogues avec la protéine COX-2 et augmente également l'affinité avec le récepteur80. Par conséquent, sur la base de la relation ci-dessus entre les caractéristiques de la structure chimique et les résultats obtenus à partir de l'amarrage moléculaire et de l'analyse DFT, nous avons conclu que les analogues d'AGP criblés partageaient une activité anti-inflammatoire améliorée par rapport à l'AGP et aux médicaments de référence (aspirine et rofécoxib).

Une analyse de simulation MD a été effectuée pour l'AGP et les complexes d'analogues frappés avec la protéine AF-COX-2 avec des contrôles appropriés {protéine AF-COX-2 seule (contrôle neutre) et son complexe avec l'aspirine et le rofécoxib (contrôle positif)}. L'analyse de la trajectoire de simulation MD du complexe AGP et des analogues frappés a été comparée à la protéine native AF-COX-2, à l'aspirine et au complexe de rofécoxib en termes de RMSD, RMSF, aire résiduelle, Rg, aire SAS, volume SAS, densité SAS, protéine Liaisons H et liaisons H du complexe protéine-ligand.

Le RMSD mesure la conformation de la protéine en calculant la distance moyenne entre les atomes du squelette d'une protéine pendant la simulation et en évaluant la stabilité structurelle. Les valeurs moyennes de RMSD pour l'AGP et les analogues de hit se sont avérées inférieures à celles du contrôle neutre (protéine native). En comparaison avec les témoins positifs, la valeur RMSD moyenne a été observée comme étant moindre dans les analogues A2, A3 et A4. La valeur RMSD la plus faible a été observée pour l'analogue A3, indiquant sa capacité à former un adduit stable avec la protéine AF-COX-2 (Fig. 5a et tableau supplémentaire S6). Le RMSF est calculé pour la mobilité résiduelle de chaque complexe protéine-ligand ainsi que pour la protéine native. Aucune différence notable n'a été trouvée entre les profils de fluctuation résiduelle de tous les complexes (Fig. 5b). Cela peut être attribué à la formation de liaisons H et aux interactions de van der Waal entre les résidus d'acides aminés et les ligands. Comme le montre la figure 5b, les régions du site de liaison actif ont des fluctuations plus faibles indiquant leur stabilité dans la protéine AF-COX-2. De plus, il a été observé que le RMSF moyen était plus faible dans les complexes A1, A3, A6 et A7 que dans le contrôle neutre ainsi que dans le contrôle positif (tableau supplémentaire S6). Le RMSF individuel pour les résidus d'acides aminés en interaction dans chaque système complexe de simulation a été calculé et comparé à la valeur RMSF moyenne respective pour le système de simulation. En outre, à partir du tableau supplémentaire S6, la plage RMSF moyenne pour tous les systèmes de simulation étudiés s'est avérée être de 0,16 ± 0,10 à 0,21 ± 0,18 nm. En outre, il est évident qu'à l'exception de Arg106, Ser339 et Phe 504, le reste de l'acide aminé en interaction présentait une valeur RMSF inférieure à 0, 21 nm (qui est la valeur RMSF moyenne la plus élevée parmi tous les systèmes de simulation) (tableau supplémentaire S7). Cela signifie que les résidus de liaison en interaction sont assez stables pendant la simulation MD. De plus, la valeur RMSF moyenne plus faible pour les analogues A1, A2, A3, A6 et A7 que la protéine démontre que les analogues sont capables de former des interactions stables avec la protéine lors de la simulation MD. Cette étude RMSF a suggéré la capacité de ces quatre analogues de l'AGP à former une interaction stable avec la protéine AF-COX-2 pendant la période de simulation.

Représentation picturale des résultats de l'analyse de simulation MD en termes de RMSD (a), RMSF (b), zone SAS pour chaque résidu (c) et Rg (d) de la protéine AF-COX-2 native et de son complexe avec les ligands soumis.

La surface SAS de chaque résidu lors de la simulation a également été calculée afin de calculer la surface de chaque résidu accessible au solvant (Fig. 5c)81. La valeur SAS par résidu s'est avérée être comprise entre 0 et 2,49 nm2. Il est évident que quelques résidus de la protéine AF-COX-2 ne sont pas accessibles pour des solvants tels que Asn181 dans le rofécoxib et le complexe A2, et Lys237 dans le complexe A7. En outre, parmi tous les analogues et composés témoins étudiés, la valeur moyenne de la surface SAS par résidu s'est avérée la plus élevée pour A3. De plus, la valeur maximale de la surface SAS par résidu (nm2) s'est avérée être de l'ordre de A4 (2,49) > A5 (2,44) > A3 (2,27) > A6 (2,22) > Rofécoxib (2,21) > A7 (2,19) > A2 (2.18) > A1 (2.11) > AGP (2.06) > aspirine (2.06) > protéine (2.05) ce qui signifie que les analogues A3–A6 ont une meilleure accessibilité pour le solvant que les autres complexes ainsi que la protéine native (Supplément Tableau S8).

L'analyse Rg a été réalisée pour calculer le niveau de compacité en termes de repliement et de dépliement protéique de la structure de la protéine AF-COX-2 en présence et en l'absence des ligands. La valeur Rg moyenne pour les analogues A3 et A6 s'est avérée équivalente à la valeur Rg de la protéine native (contrôle neutre) mais inférieure à celle du contrôle positif. Cela suggère une formation de complexe protéine-ligand plus stable et compacte par rapport à d'autres analogues et témoins positifs (Fig. 5d et tableau supplémentaire S8)82.

Le nombre de liaisons H dans la protéine ainsi qu'entre la protéine et le ligand joue un rôle important dans la stabilité des complexes, par conséquent, l'analyse des liaisons H a été effectuée pour l'AF-COX-2 natif et ses complexes avec l'AGP, les analogues de hit, l'aspirine , et le rofécoxib. Il ressort de la figure 6a que le complexe analogue A3 présentait un nombre maximal de liaisons H dans la protéine, tandis que les complexes AGP et A3 présentaient le nombre maximal de liaisons H protéine-ligand par rapport aux autres analogues et positifs (Fig. 6b ). Cela suggère la liaison plus forte et plus efficace de l'analogue A3 avec la protéine AF-COX-2, ce qui est en bon accord avec les résultats obtenus à partir de l'analyse RMSD et RMSF (tableau supplémentaire S6).

Illustration graphique des études de simulation MD de la protéine COX-2 native et de ses complexes avec l'aspirine, le rofécoxib, l'AGP et les analogues de l'AGP frappé. ( a ) Nombre de liaisons H dans la protéine, ( b ) nombre de liaisons H entre la protéine et le ligand, ( c ) surface SAS, ( d ) volume SAS et ( e ) densité SAS.

SASA, la zone d'une surface complexe accessible à un solvant aqueux, est utilisée pour prédire le niveau de variations conformationnelles qui se produisent par l'interaction entre les protéines et les ligands. La figure 6c montre le tracé SASA pour tous les analogues de hit, AGP, contrôle neutre et positif. La valeur moyenne de SASA pour tous les analogues d'AGP frappés avec l'AGP s'est avérée supérieure au contrôle neutre (protéine native SASA = 273,57 nm2). Alors que, par rapport au témoin positif (rofécoxib et complexe d'aspirine SASA = 273,13 et 279,12 nm2, respectivement), AGP, A2, A3, A4 et A5 ont montré des valeurs SASA plus élevées (c'est-à-dire> 279,12 nm2) (tableau supplémentaire S9). Parmi tous les analogues à succès et l'AGP, A3 présentait la valeur SASA la plus élevée = 284,59 nm2. En conclusion, l'analogue A3 forme un complexe relativement stable avec la protéine AF-COX-2 après l'interaction. De plus, le volume de surface accessible au solvant (Vsas), le volume entouré par le centre d'une sonde de solvant roulant autour de la protéine, a également été calculé pour tous les ligands étudiés, ce qui signifie la stabilité du système complexe83. En règle générale, il mesure l'effet des forces sur les surfaces des protéines exercées par les solvants suivis des interactions protéine-solvant. De plus, Vsas est une alternative pour affiner le terme SASA, afin d'inclure l'influence de l'effet des solvants sur l'intérieur de la protéine et également de définir l'interaction entre la protéine et le solvant84. C'est une application précise et rapide pour examiner les volumes géométriques des protéines. De plus, il peut être utilisé pour calculer le volume qui change en raison de l'interaction du complexe protéine-ligand avec le solvant85. Vsas avec SASA fournit un meilleur acquiescement des forces de solvant non polaires implicites et explicites sur la protéine et son effet sur le repliement de la protéine86. Comme le montre la figure 6d et le tableau supplémentaire S9, les complexes analogiques AGP, A3, A4 et A5 ont montré une valeur plus élevée de Vsas par rapport à tous les témoins, tandis que la valeur la plus élevée a été observée pour le complexe analogique A3 (119,24 nm\s3\n ). Ces résultats indiquent que l'analogue A3 forme le complexe le plus stable avec la protéine AF-COX-2 par rapport à tous les autres analogues et témoins. De plus, la densité SAS, qui est inversement proportionnelle à la SASA, a été déterminée pour calculer la densité de voisinage des acides aminés HYD enfouis dans le noyau protéique qui conduit au repliement des protéines87. La densité de voisinage calcule les quantités moléculaires et atomiques précises avec les coordonnées de la surface protéique accessible au solvant. Il mesure non seulement l'effet hydrophobe de la densité des acides aminés, mais capture également l'effet électrostatique du solvant sur le repliement et la stabilité des protéines88. Comme le montrent la figure 6e et le tableau supplémentaire S9, l'analogue A3 possédait la plus petite valeur de densité SAS indiquant un meilleur repliement des protéines par rapport aux autres analogues de hit et à tous les témoins après interaction avec la protéine AF-COX-2. Les trois analyses de surface accessibles aux solvants (surface, volume et densité) mettent ensemble davantage l'accent sur l'analyse de simulation MD liée à la stabilité complexe des analogues en termes de repliement des protéines et ont révélé plus de stabilité de l'analogue A3 que les autres composés étudiés, y compris la référence molécules. Dans l'ensemble, à partir de l'analyse de simulation MD, on peut déduire que l'analogue A3 présente une meilleure stabilité protéique que les autres analogues frappés, l'AGP, la protéine native, l'aspirine et le rofécoxib.

De plus, les interactions moléculaires des analogues frappés ont également été analysées après la simulation MD (Fig. S3 et tableau S10 supplémentaires). Fait intéressant, à l'exception de A7, le site de liaison de tous les analogues de hit a été observé comme étant cohérent avant et après la simulation. En outre, les résidus d'acides aminés, à savoir Val102, Arg106, Val335, Leu338, Ser339, Tyr341, Leu345, Phe504, Val509, Ala513 et Ser516, se sont avérés être des résidus importants avant et après la simulation, car ils sont cohérents avant et après la simulation. En outre, une analyse comparative avant et après la simulation MD dans la protéine aspirine a révélé qu'après la simulation, deux interactions hydrophobes (Val509, Ala513) et deux liaisons H (Arg106 et Arg499) sont formées, qui étaient respectivement trois et une avant la simulation. Dans le cas du rofécoxib, seules trois interactions hydrophobes (Leu338, Tyr371 et Trp373) ont été observées après la simulation, alors qu'avant la simulation, une liaison H (résidu) et six interactions hydrophobes (résidu) ont été notées. Ensuite, le complexe protéique AGP a présenté six interactions hydrophobes sans liaison H après simulation, tandis que trois liaisons H avec six interactions hydrophobes ont été observées avant simulation. Ensuite, le complexe protéique analogue A1 a montré deux liaisons H avec sept interactions hydrophobes après simulation, tandis que trois liaisons H avec cinq interactions hydrophobes ont été trouvées avant simulation. Le complexe protéique analogique A2 a révélé neuf interactions hydrophobes sans aucune liaison H après simulation, tandis que quatre liaisons H avec six interactions hydrophobes ont été observées avant simulation. Le complexe protéique analogique A3 présentait une liaison H avec huit interactions hydrophobes après simulation, tandis que sept interactions hydrophobes et une liaison H ont été observées avant simulation. Le complexe protéique A4 présentait une liaison H et sept interactions hydrophobes après simulation, tandis que trois liaisons H avec six interactions hydrophobes ont été observées avant simulation. Le complexe protéique A5 a révélé 2 liaisons H et sept interactions hydrophobes après simulation alors que 4 liaisons H avec cinq interactions hydrophobes avant simulation. Le complexe protéique A6 a montré une liaison H avec quatre interactions hydrophobes après simulation alors que seules des interactions hydrophobes ont été observées avant simulation. Enfin, le complexe protéique A7 a révélé une liaison H avec trois interactions hydrophobes et seules les interactions hydrophobes étaient principalement impliquées avant la simulation (tableau supplémentaire S10). Dans l'ensemble, à partir de l'analyse comparative, il a été observé que les analogues de hit, à l'exception de l'A7, restent proches du site de liaison identifié par l'analyse d'amarrage moléculaire, ce qui indique la stabilité de liaison efficace du complexe d'analogues de hit avec AF-COX-2. De plus, les complexes analogiques A1, A3 et A5 ont conservé leur consistance avant et après la simulation.

Les cartes EPE décrivent la distribution des électrons sur la surface moléculaire, l'énergie HOMO et LUMO des molécules. Dans cette étude, nous avons calculé l'EPE, HOMO et LUMO de la séquence sélectionnée de la protéine AF-COX-2 et de son adduit avec l'AGP, les analogues de l'AGP, la protéine native, l'aspirine et le rofécoxib. Ensuite, l'énergie de liaison de l'adduit a été calculée, où la valeur la plus négative de l'énergie de liaison indique la plus grande stabilité du complexe protéine-ligand89. Pour cette étude, l'aspirine, le rofécoxib, l'AGP et les analogues A1-A7 AGP ont été sélectionnés comme ligands, tandis que les séquences protéiques de 511 à 520 acides aminés de l'AF-COX-2, c'est-à-dire Val511, Gly512, Ala513, Pro514, Phe515, Ser516 , Leu517, Lys518, Gly519, Leu520 ont été sélectionnés comme peptide pour une étude de simulation d'amarrage en calculant EPE35. Plus tard, les valeurs d'énergie de liaison calculées des adduits se sont avérées comprises entre - 53, 81 kcal / mol (A3) et - 34, 53 kcal / mol (aspirine) (tableau 5). De plus, tous les AGP et les sept analogues présentaient une énergie de liaison moindre que le rofécoxib et l'aspirine, tandis que la valeur d'énergie de liaison la plus faible a été observée pour A3, suggérant le complexe protéine-ligand le plus stable.

L'énergie libre de liaison des analogues d'AGP frappés en interaction, l'AGP, l'aspirine et le rofécoxib à la protéine AF-COX-2 a été calculée par la méthode MM/GBSA pour une analyse de simulation avant et après. Les résultats ont révélé qu'il existe une différence subtile entre le score MM/GBSA avant et après l'analyse de simulation (Fig. 7). En outre, on peut noter à partir de la Fig. 7 que parmi tous les composés étudiés, l'analogue A3 a montré l'énergie libre de liaison la plus négative (avant simulation = − 55,37 kcal/mol et après simulation = − 56,25 kcal/mol) en termes de MM /GBSA indiquant sa forte interaction avec la protéine AF-COX-2. Le score MM/GBSA s'est avéré être dans l'ordre décroissant d'affinité de liaison A3 > A1 > A5 > Rofécoxib > A2 > A4 > A6 > A7 > AGP > aspirine. En outre, il a été observé que tous les analogues de l'AGP touchés ainsi que l'AGP présentaient une valeur d'énergie libre plus négative que l'aspirine, tandis que les analogues A3, A1 et A5 présentaient une meilleure affinité de liaison que le rofécoxib, l'aspirine, l'AGP et d'autres analogues. . De plus, les complexes analogues A3, A1 et A5 avec la protéine se sont avérés plus stables après l'analyse de simulation et impliquent également que l'analogue A3 a montré la meilleure liaison à la protéine COX-2 par rapport aux composés de référence et aux autres analogues étudiés. Les résultats MM/GBSA ont également corroboré les résultats de l'amarrage, de la simulation MD et de l'analyse DFT, et établissent que l'analogue A3 serait un composé prometteur pour inhiber l'activité AF-COX-2 et peut être utilisé comme anti-inflammatoire naturel prometteur. médicament.

Le score énergétique MM / GBSA du rofécoxib (1), de l'aspirine (2), de l'AGP (3) et des analogues sélectionnés A1 à A7 (4 à 10, respectivement) pour la simulation avant et après MD.

Dans l'ensemble, nos résultats révèlent que l'analogue A3 de l'andrographolide est la molécule médicamenteuse naturelle à base de plantes la plus puissante et la plus efficace contre la protéine COX-2. L'efficacité de cet analogue a été comparée à d'autres composés naturels ainsi qu'à des composés synthétiques pour l'inhibition de la COX-2. L'énergie de liaison pour A3 à partir de l'analyse d'amarrage s'est avérée être de - 8,56 kcal / mol, ce qui est meilleur que les dérivés d'huile de noix de coco vierge (plage BE pour les dérivés: - 5,65 kcal / mol à - 7,58 kcal / mol), l'alliine (- 4,90 kcal /mol), le pinorésinolme (− 8,38 kcal/mol) et le syringarésinol (− 8,23 kcal/mol)90,91,92,93. En outre, une simulation MD ainsi qu'une analyse de simulation d'amarrage EPE ont été effectuées pour la stabilité complexe de A3. De plus, les résultats détaillés de l'analyse comparative avec les composés de référence confirment que l'analogue A3 identifié serait un candidat de type médicament efficace contre la protéine COX-2. A notre connaissance, à ce jour, l'analogue A3 de l'andrographolide n'a pas été exploré pour son activité anti-inflammatoire en inhibant la COX-2. Par conséquent, le présent travail fournit une base pour le développement de l'analogue A3 de l'andrographolide en tant que candidat potentiel de type médicament anti-inflammatoire agissant via l'inhibition de la COX-2. Bien que nous ayons utilisé une myriade d'outils chimioinformatiques pour l'identification et la validation de l'analogue A3 en tant qu'inhibiteur potentiel de la COX-2, une authentification expérimentale supplémentaire est requise de la part de la communauté scientifique pour accélérer le processus de développement de médicaments.

Dans la présente étude, un composé anti-inflammatoire végétal prometteur contre la COX-2 a été identifié en utilisant une approche informatique combinée comprenant des études de simulation d'amarrage moléculaire et quantique. Une structure de protéine AF-COX-2 humaine entièrement séquencée validée a été utilisée pour l'alignement de séquences multiples afin de découvrir les résidus de site actif pour l'activité anti-inflammatoire. Le criblage virtuel de 237 analogues d'AGP contre la protéine AF-COX-2, suivi d'études d'amarrage interactives, a éliminé 7 analogues d'AGP qui ont montré leur candidature de type médicament également à partir de l'analyse de prédiction ADMET. En outre, les mesures d'efficacité des ligands, les descripteurs DFT, c'est-à-dire HOMO, LUMO, HLG et EPE ont établi leur bonne réactivité chimique. De plus, la simulation MD, la simulation d'amarrage EPE et l'étude MM/GBSA ont révélé que l'analogue A3 (3-[2-[(1R,4aR,5R,6R,8aR)-6-hydroxy-5,6,8a-triméthyl- 2-méthylidène-3,4,4a,5,7,8-hexahydro-1H-naphtalène-1-yl]éthylidène]-4-hydroxyoxolan-2-one) forme le complexe le plus stable avec l'AF-COX-2 et serait un agent anti-inflammatoire naturel prometteur. Dans un avenir proche, des validations expérimentales supplémentaires sont nécessaires pour étayer ces résultats.

Toutes les données générées ou analysées au cours de cette étude sont incluses dans cet article et ses fichiers d'informations supplémentaires. Des données brutes supplémentaires ou des ensembles de données générés et/ou analysés au cours de l'étude en cours sont disponibles auprès de l'auteur correspondant sur demande raisonnable.

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Les auteurs remercient la direction du Vellore Institute of Technology, Vellore, pour avoir fourni les installations nécessaires à la réalisation de ce travail.

École des biosciences et de la technologie, Vellore Institute of Technology, Vellore, Tamil Nadu, 632014, Inde

Priyanka Jain & C. Sudandiradoss

Centre de nanobiotechnologie, Vellore Institute of Technology, Vellore, Tamil Nadu, 632014, Inde

Jitendra Satija

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PJ : Conceptualisation et conception de l'étude. Analyse informatique et rédaction de la première ébauche. Dr CSD : Conceptualisation, supervision, conservation des données, révision et édition. JS : Conceptualisation, révision et édition. Tous les auteurs ont lu et approuvé le manuscrit final.

Correspondance à C. Sudandiradoss.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

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Réimpressions et autorisations

Jain, P., Satija, J. & Sudandiradoss, C. Découverte de l'andrographolide hit analogue en tant qu'inhibiteur puissant de la cyclooxygénase-2 grâce à la simulation MD par consensus, à la simulation de l'énergie potentielle électrostatique et aux mesures d'efficacité du ligand. Sci Rep 13, 8147 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-35192-7

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Reçu : 10 novembre 2022

Accepté : 14 mai 2023

Publié: 19 mai 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s41598-023-35192-7

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