L'isoliensinine des rhizomes de Cissampelos pariera présente un potentiel gamétocytocide et anti

Malaria Journal volume 22, Article number: 161 (2023) Citer cet article

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La demande non satisfaite d'agents bloquant la transmission du paludisme efficaces ciblant les stades transmissibles de Plasmodium nécessite des efforts de découverte intensifs. Dans cette étude, une bisbenzylisoquinoline bioactive (BBIQ), l'isoliensinine, issue des rhizomes de Cissampelos pariera (Menispermaceae) a été identifiée et caractérisée pour son activité antipaludique.

Le test de fluorescence Malaria SYBR Green I a été réalisé pour évaluer l'activité antipaludique in vitro contre les clones D6, Dd2 et F32-ART5, et la sensibilité immédiate ex vivo (IEV) pour 10 isolats de P. falciparum fraîchement collectés. Pour déterminer la vitesse et le stade d'action de l'isoliensinine, un test de vitesse IC50 et des analyses morphologiques ont été effectués à l'aide d'asexués Dd2 synchronisés. L'activité gamétocytocide contre deux isolats cliniques producteurs de gamétocytes adaptés à la culture a été déterminée à l'aide de lectures de microscopie, avec des cibles moléculaires possibles et leurs affinités de liaison déduites in silico.

L'isoliensinine a affiché une puissante activité gamétocytocide in vitro à des valeurs moyennes d'IC50gam comprises entre 0,41 et 0,69 µM pour les isolats cliniques de Plasmodium falciparum. Le composé BBIQ a également inhibé la réplication asexuée à une IC50Asexuelle moyenne de 2,17 µM, 2,22 µM et 2,39 µM pour D6, Dd2 et F32-ART5 respectivement, ciblant la transition tardive du trophozoïte au schizonte. Une caractérisation plus poussée a démontré une puissance ex vivo immédiate considérable contre les isolats cliniques humains à une moyenne géométrique IC50IEV = 1,433 µM (IC à 95 % 0,917–2,242). Des analyses in silico ont postulé un mécanisme d'action antipaludéen probable par des affinités de liaison élevées pour quatre protéines kinases de division mitotique ; Pfnek1, Pfmap2, Pfclk1 et Pfclk4. De plus, il a été prédit que l'isoliensinine possède un profil pharmacocinétique optimal et des propriétés de type médicament.

Ces résultats mettent en évidence des motifs considérables pour une exploration plus approfondie de l'isoliensinine en tant qu'échafaudage propice à la chimie bloquant la transmission du paludisme et à la validation des cibles.

Les stratégies thérapeutiques anticipées pour bloquer la différenciation sexuelle et la maturation des gamétocytes de Plasmodium [1, 2], avant l'absorption par les moustiques anophèles femelles réduiraient les transmissions du paludisme par des plis de magnitude [3]. L'absence de telles interventions efficaces de blocage de la transmission a par conséquent entraîné plus de 234 millions de nouvelles infections et 593 000 décès signalés en Afrique subsaharienne en 2021. Les gamétocytes de Plasmodium falciparum mettent environ 12 à 14 jours à mûrir lorsqu'ils sont séquestrés dans la moelle osseuse et la rate [4]. Dans ces niches vasculaires, les parasites affichent des changements de développement dynamiques en vue d'une transition de phase homme-moustique. Avec un tel phénomène de homing, les gamétocytes à travers les transformations morphologiques des stades I à V remodèlent activement les cellules hôtes de manière réversible permettant des rétentions vasculaires [5,6,7]. La maturation finale des gamétocytes de stade IV à V est caractérisée par le désassemblage du cytosquelette structurel en pointes arrondies coïncidant avec une déformabilité cellulaire accrue induite par l'adénosine monophosphate cyclique (cAMP) et STEVOR [8, 9]. Lors de la phosphorylation de P. falciparum STEVOR, les gamétocytes matures de stade V quittent les niches médullaires et persistent pendant des jours à des semaines dans la circulation périphérique en attendant la capture des moustiques lors de l'acquisition du repas de sang [9]. Comme démontré précédemment [10, 11, 12, 13, 14, 15, 16], le développement de Plasmodium est étroitement régulé par un réseau robuste de profils transcriptionnels spécifiques au stade et au sexe, des expressions protéiques et de la coordination métabolique physiologique. Malgré cette biologie et ces connaissances vitales des gamétocytes, le rythme de découverte de médicaments pour les inhibiteurs contre ces parasites transmissibles semble assez lent.

La majorité des médicaments antipaludéens actuellement disponibles agissant au-delà de la réplication asexuée ne parviennent pas à éliminer complètement les gamétocytes matures de stade V circulant périphériquement [17], permettant ainsi la transmission aux moustiques vecteurs [18, 19]. Cette limitation, ajoutée aux tendances actuelles et futures de la résistance antipaludique, démontre le besoin urgent de nouvelles entités chimiques. Au cours des dernières années, diverses plates-formes de dépistage à haut débit (HTS) [20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31] ont identifié divers échafaudages chimiques à fort potentiel de blocage de la transmission du paludisme. Les efforts visant à optimiser certaines de ces molécules en candidats principaux accompagnés de déconvolutions cibles ont donné KAE609 [32], DDD107498 [33], (+)-SJ557733 [34], ACT-451840 [35], MMV390048 [36] pour n'en citer que quelques-uns, qui sont actuellement en début d'essais cliniques. Cependant, les inconvénients pertinents liés au manque de diversité cible et chimique, et les taux d'attrition élevés sont très préoccupants [37]. Les produits naturels, y compris les herbes antipaludiques orthogonales [38], ont alternativement été recherchés pour les agents bloquant la transmission de Plasmodium. Dans le cadre de ces efforts de découverte antipaludique, plusieurs composés naturels dont : la maduramicine [22], la parthénine et le parthénolide [39], le thiostrepton, l'époxomicine [40], le monensin, la salinomycine, la nigéricine [41], les dérivés de l'acide (+)-usnique (BT37 et BT122) [42], les dérivés de la naphtyl isoquinoline [43], l'azadirachtine A [44] , le vernodalol [45], le 1α,4α-dihydroxybishopsolicepolide [46], la p-orlandine [47], la cryptolépine [48], la lanceoline B [49], la dihydronitidine [50], le daucovirgolide G [51] et la lophirone E [52] ont été signalés comme tuant les gamétocytes in vitro ou empêchant leur développement sporogonique dans l'intestin moyen du moustique.

Dans le cadre de la recherche continue de nouveaux échafaudages antipaludéens polyvalents, en particulier des produits naturels dotés d'une capacité de blocage de la transmission de Plasmodium [53], l'écran actuel a identifié un agent prometteur bisbenzylisoquinoline (BBIQ). Les BBIQ, qui sont généralement caractérisés par des sous-types de liaison éther structurelle queue-à-queue, tête-à-tête et tête-à-queue [54], présentent des échafaudages de médicaments multi-maladies. Cette classe chimique particulière cible préférentiellement les voies de signalisation Ca2+ de type L et T dans les cellules de mammifères en plus de la modulation des canaux d'efflux membranaires des familles des transporteurs ABC et des glycoprotéines P (P-gp) [55, 56]. Chez Plasmodium, la mobilisation de Ca2+ intracellulaire accompagnée de l'expression concomitante de protéines kinases dépendantes de Ca2+ effectrices végétales, PfCDPK1 - PfCDPK7, initie des événements opportuns spécifiques à la kinase ; la sortie des mérozoïtes et les invasions de RBC (CDPK1, CDPK5), la croissance asexuée (CDPK2, CDPK7), active les exflagellations mâles (CDPK2, CDPK4), la motilité de glissement des ookinètes (CDPK3), la motilité des sporozoïtes et l'invasion des hépatocytes (CDPK6) (examiné dans [57]). Dans le cadre de l'inversion de la résistance antipaludique, des études antérieures sur les BBIQ ont également démontré une sensibilisation potentielle des parasites Plasmodium résistants à la quinoléine par une action synergique [58, 59]. La sensibilisation sous-jacente à la CQ par les BBIQ suggère des effets modulateurs possibles sur l'activité d'efflux de la chloroquine (CQ) de son transporteur PfCRT. Bien qu'ils présentent ces propriétés pharmacologiques intéressantes, y compris de puissantes activités antipaludiques d'IC50 < 1 µM [59, 60, 61, 62], les composés contenant du BBIQ n'ont pas été poursuivis plus avant pour le développement antipaludique à ce jour, peut-être en raison de leurs profondes complexités structurelles. Parmi les BBIQ, l'isoliensinine est représentée (Fig. 1A), qui a d'abord été isolée à partir d'embryons de graines de lotus (Nelumbo nucifera, Nelumbonaceae) [63] et plus tard à partir de Cissampelos mucronata [64]. Le profil d'activité antipaludique de l'isoliensinine est jusqu'à présent mal caractérisé. Ici, la première caractérisation antipaludique détaillée de l'isoliensinine des rhizomes de Cissampelos pariera (fichier supplémentaire 1 : Fig. S1-S2) a été décrite et rapportée comme un agent sélectif des gamétocytes avec un potentiel de blocage de la transmission du paludisme contre les isolats cliniques de Plasmodium humain. L'étude décrit en outre son effet d'inhibition puissant à action relativement lente sur les stades asexués, agissant préférentiellement sur l'étape de transition mature du trophozoïte au schizonte. Les cibles moléculaires possibles extraites et validées par une approche informatique ont mis en évidence une forte affinité pour le transport transmembranaire et les protéines régulatrices de la division mitotique. Les découvertes actuelles fournissent un échafaudage de produit naturel avec un potentiel de blocage de la transmission de Plasmodium susceptible d'être développé en d'excellents candidats qui peuvent être des ajouts efficaces à l'arsenal antipaludéen pour traiter et prévenir les transmissions du paludisme.

Effets du traitement à l'isoliensinine sur les gamétocytes IV/V de stade avancé à partir d'isolats cliniques humains de Plasmodium falciparum. A Structure chimique de l'isoliensinine, B L'isoliensinine réduit la survie des gamétocytes de stade IV/V. Les courbes dose-réponse de l'isoliensinine contre les gamétocytes de stade IV/V ont estimé les valeurs IC50gam à 0,2528 µg/mL (0,41 ± 0,043 µM), 0,4241 µg/mL (0,69 ± 0,019 µM) pour MGT 0063 (isolat Marigat) et KCH 016/19 (isolat Kericho) Plasmodium isolats cliniques , respectivement (n = 3 répétitions indépendantes). Les barres d'erreur indiquent l'écart type (sd). La primaquine a servi de contrôle positif dans ces tests avec une IC50gam moyenne de 7,46 ± 0,102 µM. C : Changements morphologiques des gamétocytes lors du traitement à l'isoliensinine capturés à partir de lames colorées au Giemsa à un objectif d'immersion dans l'huile de 100 ×. Voie 1 : gamétocytes traités au DMSO à 0,2 %, voie 2 : gamétocytes traités à l'isoliensinine et voie 3 : gamétocytes traités à la primaquine

Médicaments antipaludéens ; la dihydroartémisinine (DHA), le chlorhydrate de méfloquine (MQ), la monodéséthylamodiaquine (AMQ), l'artéméther (ARM), le diphosphate de chloroquine (CQ), la luméfantrine (LUM), la pipéraquine tétrahydratée (PPQ), l'atovaquone (ATQ), l'artémisinine (ART), l'artésunate (ARS), la quinine (QN) et la primaquine (PQ) proviennent du WorldWide Antimalarial Resistance Network (WW ARN). Des détails sur la purification et la caractérisation de l'isoliensinine sont inclus dans le fichier supplémentaire 1 : Méthodes S1. Sauf indication contraire, tous les composés médicamenteux ont été dissous dans du DMSO à 100 % et reconstitués aux concentrations souhaitées pour le dosage.

Parasites intra-érythrocytaires P. falciparum asexués; Les clones D6, W2, Dd2 et F32-ART5 ont été cultivés comme décrit précédemment [65], avec des modifications mineures. En bref, des érythrocytes parasités à 0,5 % de parasitémie dans 4 % d'hématocrite (sang humain O+) ont été cultivés à 37 ºC avec 90 % de N2, 5 % de CO2 et 5 % d'O2 dans du milieu RPMI 1640 (Gibco Life Technologies) additionné de 20 % de sérum humain ABO inactivé par la chaleur, 5,94 g/L HEPES (Sigma-Aldrich), 2 g/L de glucose, 2 mM de l-glutamine, 4 µg/mL d'hypoxanthine et 2 g/L de NaHCO3 (Sigma-Aldrich). Pour générer des cultures hautement synchrones, des traitements au D-sorbitol à 5 % (p/v) au stade de l'anneau pendant 10 min à 37 °C ont été effectués. Le milieu usé a été remplacé de manière aseptique tous les deux jours jusqu'à l'atteinte du niveau de parasitémie maximal (anneaux de 5 à 8 %), au cours duquel 100 µL de suspension de parasite reconstituée à 1 % de parasitémie et 2 % d'hématocrite ont été distribués dans des plaques à 96 puits pré-dosées, pour une incubation de 72 h à 37 °C. La concentration finale de DMSO dans tous les tests n'a pas dépassé 0,2 % v/v. L'activité d'inhibition de la réplication a été analysée dans 3 répétitions par des lectures basées sur SYBR Green I comme décrit précédemment [66]. Un test de sensibilité ex vivo immédiat (IEV) [66] a été réalisé sur des isolats cliniques de P. falciparum (collecte 0 à 6 h après la phlébotomie ; à un niveau de parasitémie ≥ 1 %) recueillis auprès d'individus consentants atteints de paludisme non compliqué dans les cliniques du site d'étude de Kisumu et Kombewa (protocoles approuvés ; KEMRI SSC # 1330 et WRAIR # 1384). Les parasites circulants dans cette région endémique de l'ouest du Kenya étaient auparavant caractérisés comme étant mono-/multirésistants aux médicaments ou avec une sensibilité réduite à la CQ, à la sulfadoxine/pyriméthamine (SP), à la doxycycline (DOX), au QN, au LUM et au MQ [67, 68, 69, 70, 71]. Après un ajustement à 1% de parasitémie, ces parasites fraîchement collectés ont été directement testés sans culture-adaptation préalable, aux côtés d'un panel d'antipaludéens standards.

Pour étudier la vitesse et le stade d'action de l'isoliensinine contre les asexués, des anneaux Dd2 synchronisés (0 à 5 h après l'invasion (hpi);> 98%), respectivement, ont été examinés à 1% de parasitémie contre des parasites traités au DMSO à différentes périodes de traitement au cours de la réplication intraérythrocytaire de 48 h; 5–16, 17–29 et 29–41 hpi [72]. Le test de vitesse SYBR Green I IC50 a été adopté pour la spécificité temporelle de l'action de l'isoliensinine dans le cadre de l'analyse standard de 72 h. Après chaque période de traitement, des analyses morphologiques du parasite spécifiques au stade et l'imagerie de films minces colorés au Giemsa ont été effectuées.

L'induction de gamétocytes d'isolats cliniques humains adaptés à la culture (KCH 016/19 et MGT 0063 de Kericho et Marigat, respectivement) a été réalisée selon la méthode publiée [73]. Des frottis colorés au Giemsa ont été régulièrement préparés lors des changements de milieu aux jours 5, 8 et 12 post-induction. Des gamétocytes enrichis en Percoll (42 % stade IV ; 58 % stade V) à 2 % d'hématocrite ont été distribués dans 100 µL par puits dans des plaques à 96 puits prédosées contenant 50 µL d'isoliensinine (concentration maximale de 20 µg/mL). 0,2 % (v/v) de véhicule DMSO et de PQ ont été inclus comme témoins négatifs et positifs, respectivement. Les parasites ont été incubés pendant 72 h à 37 °C dans une atmosphère humidifiée de 90 % N2, 5 % CO2 et 5 % O2. Des frottis sanguins minces ont été préparés à partir de chaque puits, colorés au Giemsa, et le pourcentage d'inhibition des gamétocytes a été déterminé à partir des lectures au microscope optique de 2 000 à 3 000 globules rouges en fonction de la catégorisation morphologique ; altéré/déformé (mort/mourant) versus normal (sain) [74]. Trois répétitions indépendantes d'analyses expérimentales ont été effectuées (n = 3).

Les prédictions cibles de l'isoliensinine ont été effectuées sur une base de données ChEMBL accessible au public et organisée (https://www.ebi.ac.uk/chembl/) sur la base de ses empreintes chimiques, comme décrit précédemment [75]. Les séquences de protéines cibles respectives ont été extraites de la base de données UniProt (https://uniprot.org/) pour interroger la cartographie orthologique par rapport à PlasmoDB (www.plasmodb.org/) à l'aide de la fonction BLASTp dans les paramètres par défaut. Les cibles protéiques de Plasmodium résultantes ont été regroupées en fonction des rôles fonctionnels annotés (fonction moléculaire) en référence aux données publiées sur le transcriptome et le protéome spécifiques au stade [10]. Afin d'effectuer l'amarrage moléculaire de l'isoliensinine contre des cibles sélectionnées, des modèles d'homologie 3D ont été construits à l'aide du serveur de modélisation d'homologie SWISS-MODEL (https://swissmodel.expasy.org) à partir de séquences de protéines (.fasta) extraites de PlasmoDB (Fichier supplémentaire 1 : Tableau S5). La qualité des modèles structurels pdb résultants a été évaluée à l'aide des paramètres de tracé de Ramachandran. Le fichier Isoliensinine 2D.sdf (ZINC42806008) a été téléchargé en tant que ligand d'amarrage à partir de la base de données ZINC15. Suite à la minimisation de l'énergie de l'isoliensinine par champ de force universel (uff; 200 étapes) sous l'algorithme des gradients conjugués et la conversion au format de ligand AutoDock .pdbqt dans l'outil OpenBabel, des simulations d'amarrage ont été effectuées à l'aide d'AutoDock Vina dans PyRx 0.8 - Outil de dépistage virtuel au paramètre d'espace de recherche Vina X: Y: Z 25 × 25 × 25 Å par défaut. Les scores d'amarrage pour les énergies d'affinité de liaison libre les plus basses ont été enregistrés pour chaque cible, classés et les visualisations des interactions moléculaires 2D analysées à l'aide du visualiseur Biovia Discovery Studio 2020 (v20.1.0.19295; Dassault Systèmes). Les prédictions Isoliensinine ADMET ont été réalisées sur SWISSADME (http://www.swissadme.ch).

Le logiciel Graphpad Prism (GraphPad Prism v.7.0 pour Windows, San Diego, CA) a été utilisé pour les analyses de données. Un modèle de régression non linéaire pour les lectures d'unités fluorescentes relatives normalisées (RFU) a été ajusté aux concentrations de médicament transformées en log10 pour des tracés dose-réponse sigmoïdaux afin d'estimer les valeurs de CI50 pour les asexués. Les paramètres utilisés étaient ; logdose à quatre paramètres avec une pente variable : ajustement Y = Bottom + (Top–Bottom)/[1 + 10^((LogIC50-X) × HillSlope)]. Pour la détermination de la CI50 gamétocytocide, les pourcentages moyens d'inhibition pour chaque dose de traitement ont été tracés par rapport aux doses transformées en log10 à l'aide d'une analyse de régression non linéaire [74]. Les valeurs géométriques moyennes IC50 pour les données ex vivo immédiates continues (IEV) ont été analysées avec des intervalles de confiance à 95 % (IC à 95 %) à l'aide de statistiques de colonne. Les corrélations entre les valeurs d'IC50 entre les traitements antipaludéens ont été calculées par l'analyse non paramétrique des coefficients de rang de Spearman. Les différences entre deux groupes de traitement indépendants ont été analysées par le test t de Student et une valeur p inférieure à 0,05 considérée comme statistiquement significative.

Au départ, 13 extraits de plantes ont été criblés contre P. falciparum W2 pour des antipaludéens actifs. Les résultats obtenus par ce criblage ont conduit à l'isolement et à l'identification d'un antipaludéen actif dans l'extrait de rhizome de C. pariera (Menispermaceae), révélé comme l'isoliensinine. L'isoliensinine est un puissant inhibiteur du cycle cellulaire en phase G1 avec des activités anticancéreuses [76] et anti-réplication du VIH [77], parallèlement à une activité antipaludéenne précédemment rapportée d'une espèce congénère C. mucronata (IC50Asexual = 124,3 ng/mL D6 ; 133,5 ng/mL W2) [64]. Comme pour l'activité susmentionnée, l'isoliensinine isolée des rhizomes de C. pariera a été explorée pour son activité antiplasmodiale afin de caractériser pharmacologiquement son profil d'activité contre les stades sexuels asexués et transmissibles de Plasmodium. D'après les données présentées dans le tableau 1 et le fichier supplémentaire 1 : tableau S1 - S2, le produit naturel isoliensinine a inhibé la réplication intraérythrocytaire de tous les parasites testés dans la gamme micromolaire inférieure (moyenne IC50Asexual = 2,17 µM pour D6, 2,22 µM pour Dd2 et 2,39 µM pour F32-ART5). Il est en outre démontré que, à l'instar des médicaments antipaludéens de référence; l'artésunate (ARS), la dihydroartémisinine (DHA), l'atovaquone (ATQ), l'artéméther (ARM), la pipéraquine (PPQ) et l'amodiaquine (AMQ), l'isoliensinine n'ont pas présenté de résistance croisée, RI (indice de résistance) < 10 (tableau 1), suggérant un mécanisme inhibiteur/tueur possiblement différent. Remarquablement, le traitement à l'isoliensinine a affiché une sélectivité quintuplée significative contre les gamétocytes IV / V de stade avancé par rapport aux asexués (test t de Student, t = 8, 464, p = 0, 007), avec des valeurs de puissance IC50gam moyennes à faible micromolaire allant de 0, 41 à 0, 69 µM (Fig. 1B). Cette observation semble suggérer une meilleure sensibilité et/ou absorption de l'agent antipaludéen par les gamétocytes IV/V tardifs moins métabolisants, comme une découverte récente avec la bichalcone lophirone E de Lophira lanceolata (IC50gam = 0,14 µM, IC50Asexual = 12,23 µM W2, 38,47 µM 3D7) [52]. Les distorsions morphologiques induites par l'isoliensinine consistaient en ; retrait, perte du contour structurel externe et dommages nucléaires (Fig. 1C).

De plus, lorsqu'elle a été testée contre des asexués de Plasmodium dérivés d'isolats cliniques humains collectés dans la région de Kisumu, à l'aide d'un test de sensibilité ex vivo immédiat (IEV), l'isoliensinine a constamment maintenu son efficacité thérapeutique à faible micromolaire à une moyenne géométrique IC50IEV = 1,433 µM (IC à 95 % 0,917-2,242, n = 10 isolats (fichier supplémentaire 1 : Tableau S3, Fig. 2). Cependant, aucune corrélation inhibitrice significative sur la base du coefficient de rang de corrélation de Spearman entre les valeurs IC50 appariées ont été notées, ce qui pourrait impliquer une résistance croisée (tableau 2).

Modèles de distribution des sensibilités immédiates ex vivo des isolats cliniques de Plasmodium falciparum à l'isoliensinine et aux médicaments antipaludéens standard. La moyenne géométrique IC50sIEV pour les 10 isolats cliniques était ; CQ = 0,011 µM (IC à 95 % 0,008–0,016), AMQ = 0,005 µM (IC à 95 % 0,004–0,007), DHA = 0,005 µM (IC à 95 % 0,003–0,010), ARS = 0,002 µM (IC à 95 % 0,002–0,004), MQ = 0. 016 µM (0,010–0,026), ARM = 0,005 µM (IC à 95 % 0,003–0,007), PPQ = 0,046 µM (IC à 95 % 0,030–0,070), ATQ = 0,003 µM (IC à 95 % 0,001–0,005), ART = 0,010 µM (IC à 95 % 0,007–0,014), LUM = 0,132 µM (IC à 95 % 0,070–0,250), QN = 0,062 µM (IC à 95 % 0,038–0,102) et isoliensinine = 1,433 µM (IC à 95 % 0,917–2,242). Chaque point représente un seul isolat. Les lignes horizontales entre les schémas de distribution représentent les IC50 médianes pour les traitements respectifs

Après caractérisation du profil antipaludéen de l'isoliensinine contre les parasites Plasmodium, le stade cible précis du cycle intra-érythrocytaire de ~ 48 h a été déterminé. Tout d'abord, un test spécifique au temps SYBR Green I a été réalisé avec des parasites Dd2 synchrones. Au cours de l'incubation initiale de 24 h, les parasites semblaient insensibles au traitement à l'isoliensinine représentant une courbe linéaire, mais l'activité est apparue entre 24 et 48 h et a culminé entre 48 et 72 h après l'incubation avec une courbe sigmoïde lisse (Fig. 3A). En conséquence, l'isoliensinine a montré une action antipaludique initiale relativement lente in vitro semblable aux antifolates à action tardive, à la sulfadoxine/pyriméthamine et au MMV390048 [36]. Pour délimiter le stade exact d'inhibition, une culture Dd2 hautement synchronisée au stade de l'anneau a été traitée à des périodes de temps respectives (voir Méthodes). L'activité antipaludéenne s'est exercée au cours du premier cycle de réplication de 48 heures. Cela a exclu la possibilité d'un effet de mort retardé exercé par les antibiotiques ciblant les apicoplastes tels que la doxycycline, l'azithromycine, la tétracycline et la clindamycine qui se produisent à la suite d'un trafic intracellulaire dépendant de la prénylation perturbé [78]. Le développement de Plasmodium a échoué de manière plus prononcée à progresser au-delà des trophozoïtes tardifs indiquant une ou des cibles critiques à ce stade du parasite avant la réplication de l'ADN. Morphologiquement, les parasites traités à l'isoliensinine présentaient des trophozoïtes matures pycnotiques entourés d'une membrane plasmique élargie et saignée (Fig. 3B), décrivant en partie les effets du déséquilibre ionique ciblé associé aux ionophores [32, 41]. D'autres effets délétères ont été observés chez les schizontes, caractérisés par une division mitotique défectueuse présentant du matériel nucléaire agrégé (Fig. 3B). Dans les cellules tumorales, il a été démontré que l'isoliensinine arrête la division cellulaire [76]. De même, le traitement des trophozoïtes Plasmodium Dd2 avec de l'isoliensinine entre 29 et 41 hpi a entraîné un manque de segmenteurs de schizonte matures (Fig. 3B), observé chez les parasites traités au DMSO. Cet arrêt spécifique au schizonte dans la division nucléaire et cellulaire caractérisé par du matériel nucléaire non divisé suggère une machinerie de division mitotique altérée qui, autrement, se traduit par 18 à 24 noyaux de mérozoïtes infectieux. Ces phénotypes de traitement bloqués ressemblent à ceux exercés par NITD609 (inhibiteur de PfATP4) [32], DDD107498 (synthèse des protéines - inhibiteur de PfeEF2) [33], AN3661 (facteur de traitement du pré-ARNm - inhibiteur de PfCPSF3) [79], cladosporine (inhibiteur de la lysyl-ARNt synthétase) [80], NED-19 (inhibition de NAADP) [81], TCMDC-135051 (épissage d'ARNm, inhibiteur de PfCLK3) [82], aminopyrimidines et oxo-β-carbolines (épissage de pré-ARNm, inhibiteurs de CLKs) [83], et tétrathiomolybdate (TTM) (déstabilisateur de l'homéostasie Cu2+) [84] suggérant des mécanismes possibles similaires.

Effets thérapeutiques de l'isoliensinine sur le développement de Plasmodium. A Cinétique inhibitrice dose-réponse dans le temps de l'action de l'isoliensine contre Dd2 dans quatre répétitions indépendantes du test de vitesse SYBR Green I IC50 (n = 4). Chaque point représente une valeur moyenne des répétitions expérimentales pour les périodes représentatives et les barres d'erreur indiquent l'écart type (sd). B Images représentatives illustrant les effets de spécificité de stade exercés contre la maturation des trophozoïtes et des schizontes matures. Des frottis ont été réalisés après traitement à l'isoliensinine à 2,2 µM. Des aliquotes de parasites Dd2 synchronisés à des stades annulaires de parasitémie de 1% ont été traités à 5–16, 17–29 et 29–41 hpi. L'examen morphologique par microscopie optique, sous objectif 100 × immersion dans l'huile, a été utilisé pour détecter la spécificité de stade d'action par rapport au traitement de contrôle DMSO, comme décrit dans la section Méthodes. Trois répétitions expérimentales indépendantes ont été réalisées (n = 3)

Une approche bioinformatique basée sur des données d'essais historiques a été déployée pour rechercher des cibles protéiques putatives dans une base de données ChEMBL accessible au public, prédisant 54 cibles actives putatives (fichier supplémentaire 1 : tableau S4). La majorité de ces principales cibles candidates se sont regroupées en récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) (18/54 ; 33,33 %), protéines nucléaires (9/54 ; 16,67 %), protéases (7/54 ; 12,96 %), protéines kinases (6/54 ; 11,11 %) et oxydoréductases (5/54 ; 9,26 %) (Fig. 4A). Cibles homologues de Plasmodium annotées fonctionnellement (36) regroupées en ; protéines kinases (8), oxydoréductases (4), protéines nucléaires (5), protéines membranaires (7), protéines variantes clonales (4), hydrolases (2), autres (6) et 18 inconnues dépourvues d'homologie plasmodiale (Fig. 4B). Les cibles inconnues étaient 11 GPCR, 2 protéases, 1 kinase, 2 hydrolases et 2 récepteurs nucléaires (fichier supplémentaire 1 : tableau S5). Lorsqu'ils sont classés en fonction de leurs fonctions plasmodiales, la majorité est regroupée pour la régulation du cycle cellulaire (8) et les fonctions membranaires (7), avec quelques enrichissements pour la phosphorylation des protéines (4), le traitement de l'ARN (4), la cytoadhérence (4), la biosynthèse des acides gras (2), la transduction du signal (2), le métabolisme (2) et d'autres (3) (Fig. 4B). Sur la base de ces cibles, il a été postulé que le mécanisme d'action antipaludique de l'isoliensinine impliquait des mécanismes en deux étapes au niveau du trafic transmembranaire et de la division mitotique, cibles actuellement prioritaires des médicaments antipaludiques faisant l'objet d'une enquête active.

Analyses ciblées formulant des hypothèses de mode d'action. A Répartition des 54 classes cibles prédites affectées par l'isoliensinine. Toutes les cibles cellulaires de mammifères marquées "actives" prédites dans la base de données ChEMBL avec un niveau de confiance de 70 à 90 % pour l'isoliensinine (ID : ChEMBL502370) ont été enregistrées et leurs classes identifiées. Le nombre total de chaque classe est indiqué entre parenthèses. B : Classification fonctionnelle des homologues de Plasmodium identifiés avec succès. Encart : Classes cibles enrichies après recherches d'homologie dans PlasmoDB. Les séquences protéiques des cibles prédites respectives extraites de la base de données UniProt (à l'aide des identifiants ChEMBL) ont été utilisées pour interroger PlasmoDB à l'aide de la fonction BLASTp. Les orthologues renvoyés sur la base du score d'identité ont été classés de manière fonctionnelle à l'aide d'annotations sur PlasmoDB et de résultats de caractérisation sur la littérature publiée.

Pour valider l'hypothèse de prédiction de cible in silico, une analyse d'amarrage moléculaire inverse a été réalisée contre 66 protéines régulatrices de la division cellulaire de Plasmodium et 16 transporteurs transmembranaires, dont 4 autres cibles avec des phénotypes de traitement similaires - ATP4, eEF2, CLK3 et CPSF3 (Fichier supplémentaire 1 : Tableau S5). Il a été établi que quatre protéines kinases essentielles prioritaires ; 2 Ser/Thr : PfCLK1 (- 10,0 kCal/mol) et PfCLK4 (- 9,8 kCal/mol) ; 1 Nima : PfNek1 (- 10,8 kCal/mol) ; et 1 CGMC : PfMap2 (- 10, 0 kCal / mol) présentait des interactions d'énergie de liaison libre négatives élevées (< - 9, 6 kCalmol - 1 seuil) avec l'isoliensinine au niveau de leurs poches de liaison respectives (tableau 3). Un seul symporteur lactate/H+ transmembranaire médicamentable, PfFNT, a fortement interagi avec l'isoliensinine avec un score d'énergie de liaison de - 9,1 kCal/mol. Isoliensinine a démontré des profils de liaison distincts avec les résidus protéiques des cibles Plasmodium en utilisant six interactions de liaison clés ; la liaison hydrogène classique, les forces π-cation, π-sigma, π-alkyle, alkyle et van der Waals (Fig. 5).

Modes de liaison de l'isoliensinine sur les protéines cibles de Plasmodium. a PfNek1, b PfMap2, c PfClk1 et d PfClk4. Les modes d'interaction bidimensionnels (2D) de l'isoliensinine avec les protéines cibles de Plasmodium ont été analysés à l'aide du visualiseur Discovery Studio après l'amarrage moléculaire dans le logiciel PyRx

Enfin, les propriétés ADME de l'isoliensinine pour sa similarité médicamenteuse, ses risques toxicologiques ou sa pharmacocinétique ont été profilées à l'aide de la plateforme Web SWISSADME et les résultats sont fournis dans le fichier supplémentaire 1 : tableau S6. Il a été prédit que l'Isoliensinine avait un score de biodisponibilité orale optimal, une absorption intestinale élevée et qu'elle était non toxique pour les cinq principales isoformes métaboliques du CYP450 humain (CYP1A2, CYP2C19, CYP3A4, CYP2C9 et CYP2D6). De plus, l'isoliensinine s'est avérée imperméable à travers la barrière hémato-encéphalique, mais capable d'inhiber les mécanismes d'efflux de médicaments cellulaires basés sur l'activité de la glycoprotéine p. Aucune similitude structurelle avec les composés d'interférence pan-essai (PAINS) n'a été trouvée, cependant, les stratégies de chimie médicinale pour améliorer ce composé devraient se concentrer sur sa solubilité dans l'eau et réduire le poids moléculaire à <500. Avec un tel profil ADME in silico, l'isoliensinine fournit un échafaudage prometteur pour le développement de médicaments dépourvu de risques potentiels responsables.

Les taux de transmission et le fardeau mondiaux soutenus du paludisme continuent de donner la priorité à la recherche d'interventions appropriées susceptibles de neutraliser l'infectiosité des gamétocytes transmissibles aux moustiques. Axée sur cet objectif insaisissable d'élimination du paludisme et sur une tentative d'élargir l'espace chimique fini existant pour ce stade parasitaire accentué, cette étude a identifié un composé de bisbenzylisoquinoline (BBIQ) et a caractérisé de manière exhaustive son activité antipaludique. Ce BBIQ a présenté une activité gamétocytocide sélective considérable. De plus, l'agent antipaludéen identifié a inhibé les réplications asexuées en bloquant la transition des trophozoïtes matures en schizontes. Les résultats de l'étude fournissent la première caractérisation détaillée du profil antipaludéen de l'isoliensinine des rhizomes de C. pariera. Conformément aux études précédentes qui décrivaient les BBIQ comme des antipaludéens potentiels limités aux stades asexués du parasite [59, 60, 61, 62], l'isoliensinine a également été établie pour inhiber les parasites asexués, bien que d'une puissance légèrement moindre. En dehors de cette observation initiale, l'isoliensinine a inhibé activement les isolats de parasites P. falciparum provenant d'échantillons cliniques humains à une moyenne géométrique IC50IEV = 1,433 µM. Avant cette étude, aucun des BBIQ précédemment signalés n'avait été testé contre des isolats de parasites contemporains d'origine clinique. Cette découverte sans précédent a un potentiel passionnant pour la gestion des parasites d'origines génétiques très diverses résultant de la pression de sélection actuelle exercée par les schémas thérapeutiques combinés à base d'artémisinine (ACT). Les résultats actuels démontrent clairement que l'isoliensinine possède une activité gamétocytocide impressionnante en ce qui concerne le blocage des transmissions parasitaires. Une telle sensibilité des gamétocytes par rapport aux asexués à l'isoliensinine indique probablement une expression sélective de ses cibles dans le premier qui facilite une meilleure efficacité. Des effets sélectifs similaires ont été présentés par la dihydroisoquinolone [34], le 1α,4α-dihydroxybishopsolicepolide [46] et les bichalcones [52]. Cependant, ce phénomène est sujet à d'autres interrogations en raison d'expressions transcriptomiques et protéomiques différentes selon le stade [16].

Tournant l'attention vers la compréhension des effets antipaludéens affichés par l'isoliensinine, la cinétique inhibitrice et la spécificité de stade d'action ont été déterminées. L'isoliensinine s'est avérée agir relativement lentement, inhibant la progression du développement des stades sanguins asexués de maturité tardive, entraînant l'effondrement de la progéniture traitée. Contrairement aux résultats rapportés d'une étude précédente [60], qui ont démontré qu'une cépharanthine BBIQ apparentée de Stephania rotunda (Menispermaceae) inhibait les stades annulaires en régulant à la baisse les fentes de Maurer, l'isoliensinine affectait profondément la transition trophozoïte-schizogonie à un stade avancé. Cette différence d'activité perceptible pourrait indiquer des effets chimiques structuraux de ces composés. L'examen microscopique des parasites traités a suggéré que l'isoliensinine agissait pendant ou après le début de la réplication de l'ADN, altérant les divisions et les ségrégations nucléaires plasmodiales réussies. La formation de schizontes correspondant à la phase M est caractérisée par de multiples divisions mitotiques asynchrones étroitement régulées [85], impliquant divers acteurs moléculaires encore non résolus. S'il est généralement admis que les BBIQ présentent une forte affinité pour les cibles dépendantes du cation divalent Ca2+, il n'était cependant pas clair si l'isoliensinine suivait une voie similaire pour exercer ses effets antipaludéens. Mais, le traitement à l'isoliensinine semble compromettre d'importantes protéines régulatrices nécessaires à l'homéostasie des ions et à la division mitotique pendant la schizogonie. D'une importance critique, le phénotype exercé reflète les effets antipaludéens de divers inhibiteurs de canaux ioniques [32, 81, 84]. Bien que ce mécanisme puisse être en partie prédominant, l'échec mitotique des schizontes observé suggère des effets effecteurs indirects par des messagers secondaires comme proposé pour un anticancéreux apparenté, la tétrandrine [86]. Les ions cellulaires libres comme le Ca2+ entraînent des événements majeurs de cytokinèse [87], et une perturbation bidirectionnelle pourrait souligner les phénotypes parasitaires observés à partir du déséquilibre du pH cytosolique et des signaux effecteurs inhibiteurs.

Intrigués par les effets observés du traitement et l'exploration partielle relative des mécanismes d'action antipaludéens de divers BBIQ, les cibles de l'isoliensinine ont été exploitées par ordinateur. De telles tentatives pour élucider le mécanisme d'action de l'isoliensinine sur la base de ses empreintes chimiques nous ont conduits à postuler l'implication de protéines régulatrices du transport transmembranaire et de la division mitotique, soutenant les effets phénotypiques observés du traitement. L'analyse a révélé un enrichissement de; Pf3D7_0904900 (Cu2+ ATPase), Pf3D7_1352100 (Mdr6), Pf3D7_1303500 (Nhe-1), Pf3D7_1235200 (Vp2) et Pf3D7_0830500 mettant en évidence une interaction active avec les transporteurs de solutés transmembranaires des cations monovalents et divalents, ainsi que des acides aminés traite. Des études antérieures ont démontré que les inhibiteurs des transporteurs de solutés sont de puissants gamétocytocides [22, 30, 41]. Comme une expression élevée de protéines enrichies en membrane a été rapportée dans les gamétocytes de stade avancé [88], et partant du fait que ces composés susmentionnés ciblent les transporteurs d'ions membranaires, nos données soutiennent donc l'argument selon lequel les gamétocytes de stade avancé sont probablement perméables aux perturbateurs de l'homéostasie ionique. Chez les asexués, ces transporteurs transmembranaires de soluté maintiennent l'homéostasie des ions cytosoliques et des cibles médicamenteuses attractives pour divers antipaludéens [89]. Certains de ces transporteurs d'ions transmembranaires sont réfractaires aux délétions conditionnelles de gènes, donc indispensables aux réplications schizogoniques du parasite. Guidé par les fortes distorsions morphologiques, il était donc peu probable d'exclure un éventuel mécanisme similaire impliquant le transport transmembranaire de l'action antipaludique de l'isoliensinine.

En outre, des effets perceptibles sur les schizontes traités qui n'ont pas réussi à diviser leur matériel nucléaire ont été notés. L'enrichissement cible des protéines de Plasmodium prédites a montré le plus grand nombre de régulateurs du cycle cellulaire précédemment caractérisés qui pourraient souligner l'arrêt du développement observé. Par exemple, les modificateurs de chromatine ; Pf3D7_1211600 (LSD1), Pf3D7_0809900 (JmjC1) et Pf3D7_1212900 (BDP2) culminent leurs expressions pendant les schizontes [90], et il est raisonnable que les effets correspondants de l'isoliensinine à ce stade soient plus prononcés. Les médicaments ciblant l'épigénétique [91] exercent des activités anti-asexuées et gamétocytocides prometteuses. Parmi les autres cibles médicamenteuses identifiées par les prédictions nécessaires au développement réussi du schizonte, on trouve la calpaïne protéase à cystéine dépendante du Ca2+ (Pf3D7_1362400), PI4K (Pf3D7_0509800) [92], dfhr-TS (Pf3D7_0417200), CDPK7 (Pf3D7_1123100), PKB (Pf3D7_1 246900) et la caséine kinase 2 (Pf3D7_1108400) [93]. Cependant, à partir des analyses d'amarrage moléculaire, une affinité remarquable pour quatre protéines kinases essentielles de la division mitotique ; PfNek1, PfCLK1, PfCLK4 et PfMap2 ont été notés. Les orthologues de ces protéines kinases stabilisent l'attachement kinétochore-microtubule des centrosomes pour réguler les événements mitotiques protozoaires et la progression du cycle cellulaire [94, 95], offrant des opportunités de ciblage des médicaments. Chez Plasmodium, les kinases de type kinase dépendantes de la cycline (CLK) phosphorylent les substrats du facteur d'épissage pré-ARNm riches en sérine/arginine. Il a été rapporté que leurs knockouts chimiques inhibaient la transition trophozoïte-schizonte, altéraient le développement des gamétocytes et réduisaient les exflagellations de gamètes mâles et la prévalence des infections par les moustiques à 50 % [82, 83]. Le gène A de Plasmodium jamais en mitose (PfNek1) régule le cycle cellulaire au niveau de la transition trophozoïte/schizonte et des gamétocytes mâles [96], tandis que PfMap2 est exprimé pendant les asexués, les ookinètes et est essentiel à la gamétogenèse mâle [97]. Raisonnablement, il n'est pas surprenant que l'interaction potentielle de l'isoliensinine avec ces protéines kinases de Plasmodium ait pu conduire à des résultats de traitement similaires.

Comme les approches in silico des propriétés ADME d'un nouveau composé bioactif pourraient formuler des stratégies pour son optimisation structurelle, les analyses ont démontré un profil pharmacocinétique acceptable pour l'isoliensinine. D'autres études de priorisation visant à améliorer sa ressemblance au médicament ont été identifiées pour incliner vers la solubilité dans l'eau et la réduction du poids moléculaire à la limite acceptable < 500.

La principale stratégie de validation de l'activité de blocage de la transmission du paludisme pour tout médicament candidat consiste principalement à utiliser un test d'alimentation membranaire standard des moustiques (SMFA). Cependant, il est considéré ici que l'interruption de la formation et de la maturation des schizontes pourrait réduire la gamétocytémie à Plasmodium. De plus, la destruction sélective des gamétocytes IV/V de stade avancé par l'isoliensinine ouvre une voie remarquable vers la réduction des parasites infectieux et les futures explorations SMFA de cet agent antipaludéen. Les SMFA fourniront en outre des informations sur les mécanismes de diffusion potentiels pour le déploiement de technologies déployant l'isoliensinine sur des vecteurs cibles ou sur l'interface hôte humain. En résumé, les résultats ont démontré que l'isoliensinine, un BBIQ isolé des rhizomes de C. pariera, est un agent antipaludéen sélectivement gamétocytocide. Cette étude recommande que la limitation de la lecture par microscopie pour l'estimation de l'activité gamétocytocide soit résolue et validée par de meilleurs tests de fluorescence. Néanmoins, les preuves fournies appuient la poursuite des efforts de caractérisation et de développement de cet échafaudage prometteur en plomb bloquant la transmission du paludisme avec un profil ADME optimal.

Toutes les données générées ou analysées au cours de cette étude sont incluses dans cet article et ses fiches d'informations complémentaires.

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Nous tenons à remercier Edwin W. Mwakio, Farid S. Abdi et Charles O. Okudo du laboratoire Malaria Drug Resistance (MDR) de la direction de la recherche médicale de l'armée américaine - Afrique (USAMRD-A), Kisian Field Station pour leur assistance technique.

Cette étude a été soutenue par le prix de la bourse d'études supérieures du Higher Education Loans Board (HELB) et la Fondation internationale pour la science (IFS), Stockholm, Suède, par le biais d'un numéro de subvention I-1-F-6439-1 attribué à JMM *. Les organismes de financement n'ont pas participé à la conception de l'étude et à la collecte, à l'analyse et à l'interprétation des données ni à la rédaction du manuscrit.

James M. Mutunga, Meshack A. Obonyo, Merid N. Getahun, Ramadhan S. Mwakubambanya, Hoseah M. Akala, Agnes C. Cheruiyot, Redemptah A. Yeda, Dennis W. Juma, Ben Andagalu, Jaree L. Johnson et Amanda L .Roth

Adresse actuelle : School of Engineering Design, Technology and Professional Programs, Pennsylvania State University, University Park, PA, 16802, États-Unis

Département de biochimie, Université d'agriculture et de technologie Jomo Kenyatta (JKUAT), Nairobi, Kenya

Jackson M. Muema et Joel L. Bargul

Direction de la recherche médicale de l'armée américaine-Afrique (USAMRD-A), Centre de recherche en santé mondiale (CGHR), Institut de recherche médicale du Kenya (KEMRI), Kisumu, Kenya

Jackson M. Muema, James M. Mutunga, Hosea M. Akala, Agnes C. Cheruiyot, Redemptah A. Yeda, Dennis W. Juma, Ben Andagalu, Jaree L. Johnson et Amanda L. Roth

Département des sciences biologiques, École des sciences pures et appliquées, Université Mount Kenya, Thika, Kenya

James M.End

Département de biochimie et de biologie moléculaire, Université d'Egerton, Egerton, Kenya

Meshack A. Obonyo et Ramadhan S. Mwabambanya

Centre international de physiologie et d'écologie des insectes (Icipe), Nairobi, Kenya

Merid N. Getahun et Joel L. Bargul

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JMM*, JMM, MAO, HMA, RSM et JLB ont conçu les études expérimentales et supervisé la collecte des données. MNG, HMA, DWJ, BA, JLJ, ALR, JLB ont fourni le matériel d'étude. JMM* a exécuté la plupart des essais de dépistage avec l'assistance technique de l'ACC et du RAY. JMM* a effectué des analyses de données et rédigé le premier brouillon du manuscrit. Tous les auteurs ont examiné et approuvé la version finale du manuscrit. Tous les auteurs ont lu et approuvé le manuscrit final.

Correspondance à Jackson M. Muema ou Joel L. Bargul.

N'est pas applicable.

Les auteurs déclarent n'avoir aucun intérêt concurrent.

Springer Nature reste neutre en ce qui concerne les revendications juridictionnelles dans les cartes publiées et les affiliations institutionnelles.

: Méthodes S1 ; Tableau S1 : Dépistage antipaludéen d'extraits de plantes à l'aide du test SYBR Green I ; Tableau S2 : Lectures d'activité antipaludique des fractions de solvant de C. pariera ; Tableau S3 : sensibilités ex vivo immédiates des isolats cliniques de Plasmodium à l'isoliensinine par rapport aux médicaments antipaludéens standard en µM ; Tableau S4 : Cibles de protéines d'isoliensinine prévues ; Tableau S5 : Amarrage moléculaire des cibles de Plasmodium à l'isoliensinine ; Tableau S6 : Profil de prédiction ADME enrôlant l'isoliensinine de la plateforme SWISSADME. Fig. S1 : Cissampelos pariera dans son écosystème naturel et les rhizomes racinaires ; Fig. S2 : Fragmentation LC–MS/MS de l'isoliensinine.

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Réimpressions et autorisations

Muema, JM, Mutunga, JM, Obonyo, MA et al. L'isoliensinine des rhizomes de Cissampelos pariera présente des activités gamétocytocides et antipaludéennes potentielles contre les isolats cliniques de Plasmodium falciparum. Malar J 22, 161 (2023). https://doi.org/10.1186/s12936-023-04590-7

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Reçu : 24 décembre 2022

Accepté : 15 mai 2023

Publié: 20 mai 2023

DOI : https://doi.org/10.1186/s12936-023-04590-7

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