Régulation réversible des activités Cas12a par AcrVA5

Cell Discovery volume 8, Numéro d'article : 45 (2022) Citer cet article

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Monsieur le rédacteur,

Le système de répétitions palindromiques courtes régulièrement espacées (CRISPR)/CRISPR associé (Cas) protège les bactéries et les archées des éléments génétiques mobiles (MGE) tels que les bactériophages1. L'effecteur Cas peut être guidé par un ARN CRISPR (ARNcr) pour cibler les acides nucléiques envahisseurs par appariement de bases, puis clive la cible pour fournir à l'hôte une immunité2,3. Pour faire face à la pression immunitaire imposée par le système CRISPR de l'hôte, les phages ont développé différents types de systèmes anti-CRISPR (Acr) pour inactiver les nucléases Cas et fermer à leur tour le système immunitaire de l'hôte4. Les protéines Acr peuvent interagir directement avec les protéines Cas pour empêcher le chargement d'ARNc ou la liaison à la cible ; alternativement, ils possèdent des activités enzymatiques pour cliver les ARNc ou modifier post-traductionnelle les protéines Cas4. Parmi eux, il existe une acétyltransférase de la famille GNAT récemment rapportée, à savoir AcrVA5, qui est codée par les MGE et inhibe spécifiquement l'effecteur de type VA Cas12a par modification acétyle d'un site clé de la lysine. Le Cas12a inactivé par AcrVA5 perd la capacité d'interagir avec le site du motif adjacent du protospacer (PAM) et ne parvient pas à protéger les hôtes en clivant les MGE envahisseurs5,6. En inactivant le système Cas12a, les MGE contenant le gène acrVA5 peuvent arrêter efficacement le système immunitaire bactérien et avoir le potentiel de se propager largement parmi les hôtes hébergeant Cas12a. Cependant, à notre grande surprise, le gène acrVA5 n'existe que dans trois souches de Moraxella bovoculi qui ont perdu leurs désacétylases (Tableau supplémentaire S1). Par conséquent, il est raisonnable de soupçonner qu'il peut exister une relation compétitive entre l'acétyltransférase AcrVA5 et les désacétylases bactériennes largement distribuées, qui peuvent réactiver Cas12a par désacétylation pour protéger les hôtes de l'invasion des MGE hébergeant la cassette acrVA5.

Nous avons d'abord effectué l'expérience d'acétylation in vitro médiée par AcrVA5 et avons montré que la bactérie Lachnospiraceae acétylée par AcrVA5 (Lb) Cas12a perdait à la fois les activités de clivage cis et trans vis-à-vis de l'ADN cible double brin (dsDNA) (Fig. S1a, b supplémentaire) , ce qui était cohérent avec les découvertes précédentes5,6, cependant, le traitement à l'AcrVA5 n'a montré aucun effet sur les activités de trans-clivage de LbCas12a lorsqu'il est déclenché par l'ADN simple brin cible (ADNss) (Fig. S1c supplémentaire). Comme le site PAM n'est nécessaire que pour que Cas12a reconnaisse l'ADNdb cible mais pas l'ADNss8, les résultats ci-dessus ont en outre confirmé que l'acétylation médiée par AcrVA5 empêchait Cas12a d'interagir avec les séquences PAM dans l'ADNdb cible5.

Outre LbCas12a, nous avons également analysé les orthologues Cas12a de Francisella tularensis subsp. novicida (FnCas12a) et Acidaminococcus sp. (AsCas12a) et a démontré qu'AcrVA5 était capable d'inactiver les deux orthologues (Figs. S2 et S3 supplémentaires). Remarquablement, AcrVA5 s'est jamais avéré inefficace contre AsCas12a dans une étude précédente6, cependant, nous avons constaté qu'AsCas12a contenait le résidu de lysine conservé (Fig. S3c supplémentaire) et a montré que le traitement médié par AcrVA5 entraînait la perte de cis- et activités de trans-clivage d'AsCas12a avec l'ADNdb cible.

L'acétylation post-traductionnelle de la lysine joue un rôle important dans divers processus cellulaires dans les organismes, des bactéries à l'homme9. Chez les bactéries, le CobB de type sirtuine dépendant du NAD+ désacétyle un grand nombre de protéines et régule le niveau global d'acétylation7. Pour tester si CobB peut désacétyler le Cas12a traité avec AcrVA5 et réactiver ses activités de clivage cis et trans, nous avons ensuite purifié E. coli recombinant CobB et LbCas12a et effectué le test de désacétylation in vitro. Sur la base des résultats du transfert Western, Cas12a a été acétylé avec succès par AcrVA5 en présence d'acétyl-CoA, et la modification acétyle a pu être efficacement éliminée après avoir été traitée par CobB. Conformément aux découvertes précédentes7, la désacétylation médiée par CobB nécessite strictement NAD + comme cofacteur (Fig. S4 supplémentaire). En conséquence, la LbCas12a acétylée par AcrVA5 a perdu ses activités de clivage cis et trans avec l'ADNdb cible, mais a récupéré les deux activités dans une large mesure après avoir été désacétylée par CobB (Fig. 1a, b). De plus, nous avons testé plusieurs orthologues Cas12a tels que FnCas12a et AsCas12a et avons découvert que CobB était capable de désacétyler et de réactiver les deux orthologues Cas12a (Figs. S5-S8 supplémentaires). Il convient de mentionner que la réactivation réussie de l'AsCas12a acétylé par le traitement CobB a une fois de plus prouvé que l'AsCas12a était une cible de l'AcrVA5 (Fig. S3 supplémentaire), alors que la raison des résultats distincts entre ce travail et l'étude précédente6 était encore inconnue et pourrait être une question intéressante sujette à une enquête plus approfondie. Sur la base des résultats ci-dessus, on peut conclure que AcrVA5 et CobB régulent de manière réversible les activités de clivage cis et trans de Cas12a en modulant son statut acétyle in vitro.

a L'expérience de clivage cis de LbCas12a avec l'ADNdb cible. Comme illustré ci-dessous, le Cas12a actif a réussi à cliver l'ADNdb cible en deux morceaux sous la direction de l'ARNc, cependant, le Cas12a acétylé est devenu inactivé et a perdu les activités de clivage cis contre l'ADNdb cible. M, échelle d'ADN de 1 kb (Thermo Fisher Scientific); S, substrat d'ADNdb ; P, Cas12a produits clivés en cis. b L'expérience de trans-clivage LbCas12a avec l'ADNdb cible. Comme illustré ci-dessous, les activités de trans-clivage des protéines Cas12a actives ont été déclenchées par l'ADNdb cible, le trans-clivage du rapporteur d'extincteur de fluorescence (FQ-reporter) et l'illumination des signaux fluorescents. Cependant, une fois que Cas12a a été acétylé, il est devenu inactivé et a perdu les activités de trans-clivage en présence d'ADNdb cible. Le signal de fluorescence a été recueilli avec une machine qPCR en temps réel et les valeurs ont été affichées avec le signal de fond soustrait. NC, la réaction de contrôle négatif sans cible ajoutée ; LbCas12a, réaction utilisant LbCas12a non traité ; LbCas12a-AcCoA, réaction utilisant LbCas12a traité avec de l'acétyl-CoA uniquement ; LbCas12a-AcCoA-AcrVA5, réaction utilisant LbCas12a traité avec AcrVA5 en présence d'acétyl-CoA ; acLbCas12a, AcrVA5-acétylé LbCas12a ; acLbCas12a-NAD+, LbCas12a acétylé traité avec NAD+ uniquement ; acLbCas12a-NAD+-CobB, LbCas12a acétylé traité avec CobB en présence de NAD+. c Analyse du rôle physiologique de CobB dans la protection de l'hôte contre l'invasion du plasmide rapporteur apr étranger. W3110/cas12a, le type sauvage exprimant le complexe LbCas12a/ARNcr ; ΔcobB, le mutant nul cobB exprimant le complexe LbCas12a/ARNcr ; W3110/cobB+cas12a, le type sauvage exprimant le complexe LbCas12a/ARNcr ainsi que le CobB. apr-WT, plasmide rapporteur avec le gène apr de type sauvage; apr-Mut, plasmide rapporteur avec le gène apr mutant qui peut échapper au clivage par Cas12a. d Un modèle de régulation de la régulation réversible médiée par AcrVA5 et CobB des activités de Cas12a. L'acétyltransférase AcrVA5 utilise l'acétyl-CoA pour acétyler Cas12a, inactivant Cas12a ainsi que le système de résistance de l'hôte contre les MGE, cependant, l'hôte possède le CobB dépendant du NAD+, qui désacétyle et réactive Cas12a et fournit à l'hôte une protection secondaire contre l'envahisseur nucléique. acides.

Nous avons exploré plus avant le rôle physiologique de CobB dans la protection de l'hôte contenant Cas12a contre l'invasion des MGE qui hébergent le gène acrVA5. Nous avons d'abord construit un plasmide CRISPR qui exprimait à la fois LbCas12a et un ARNc ciblant une séquence spécifique du gène de résistance à l'apramycine (apr) et l'avons transformé en souches d'E. coli avec ou sans un niveau élevé d'expression de CobB (Fig. S9 supplémentaire). En raison du faible niveau d'expression du gène cobB natif dans E. coli10 (Fig. S10 supplémentaire), le type sauvage W3110 ainsi que les souches supprimées de cobB ont été considérés comme l'hôte cobB négatif, tandis que la souche de surexpression de cobB était la hôte cobB-positif. Pour préparer un plasmide rapporteur sans la séquence de ciblage du complexe Cas12a / ARNcr, nous avons muté la séquence d'ADN ciblant Cas12a dans le gène apr sans modifier la séquence d'acides aminés ainsi que la résistance à l'apramycine (Fig. S11 supplémentaire), obtenant un muté gène apr. Étant donné que la mutation non-sens a modifié à la fois le site PAM et la séquence guide, Cas12a n'a pas réussi à cliver la séquence cible in vitro (Fig. S11b supplémentaire). En conséquence, le plasmide rapporteur avec le mutant apr s'est effectivement échappé du système de défense de l'hôte et a montré des efficacités de transformation élevées de manière indépendante de l'acrVA5 (Fig. 1c), qui a donc été utilisé comme contrôle du test de transformation.

Le plasmide rapporteur contenant le gène apr de type sauvage a ensuite été transformé dans des souches d'E. coli exprimant Cas12a pour imiter l'invasion des MGE, et comme prévu, en l'absence du gène acrVA5, aucun transformant n'a pu être obtenu dans toutes les souches testées indépendamment de l'expression. niveau de CobB, représentant l'invasion du plasmide étranger pourrait être complètement bloqué par les hôtes (Fig. 1c). Cependant, si le plasmide rapporteur contenait à la fois apr et acrVA5, imitant les MGE hébergeant la cassette acrVA5, l'efficacité de transformation élevée du plasmide rapporteur a été obtenue chez les hôtes cobB-négatifs, ce qui était cohérent avec les conclusions ci-dessus selon lesquelles AcrVA5 inactivait efficacement Cas12a. Comme la surexpression de CobB dans l'hôte cobB-positif pouvait désacétyler et réactiver le Cas12a acétylé par AcrVA5, la transformation du plasmide rapporteur était largement bloquée. Comme prévu, l'efficacité du plasmide rapporteur était encore bien inférieure à celle du témoin, bien que la surexpression de CobB et d'AcrVA5 puisse réduire considérablement les efficacités de transformation d'E. coli (Fig. 1c). Sur la base des résultats ci-dessus, on peut conclure que AcrVA5 et CobB régulent de manière réversible les activités de Cas12a in vivo par acétylation et désacétylation, respectivement.

Comme la modification de l'acétyle médiée par AcrVA5 de Cas12a a été considérée comme une stratégie anti-Cas12a efficace par MGEs5,6, la réactivation de la désacétylation médiée par CobB de Cas12a par modification peut être considérée à la fois comme une stratégie de prévention des éléments anti-CRISPR et un sauvegarde du système de défense CRISPR, protégeant les hôtes de l'invasion des MGE contenant acrVA5 (Fig. 1d). De plus, cette étude met en évidence le potentiel de créer des systèmes plus complexes pour réguler les activités de clivage de Cas12a, ce qui peut faciliter à la fois l'édition de gènes in vivo et la détection d'acide nucléique cible in vitro11.

Outre Cas12a, AcrVA5 peut fonctionner comme une acétyltransférase à large spectre et influencer les processus métaboliques cellulaires. Nous avons ensuite effectué l'analyse par Western blot in vitro en utilisant des extraits cellulaires d'E. coli et de l'AcrVA5 purifié et avons découvert qu'un grand nombre de protéines pouvaient être acétylées par AcrVA5 (Fig. S12 supplémentaire). De même, après la surexpression d'AcrVA5 dans E. coli, le niveau d'acétylation cellulaire total a été considérablement augmenté et les protéines acétylées ont alors pu être efficacement désacétylées par CobB en présence de NAD + (Fig. S13 supplémentaire). Avec l'utilisation de la spectrométrie de masse, nous avons en outre caractérisé 2688 sites et 1101 protéines en tant que cibles potentielles d'AcrVA5 (tableau supplémentaire S2). Probablement en raison de la petite taille de la protéine et de l'encombrement stérique réduit, AcrVA5 n'a montré aucune préférence évidente pour la séquence cible, mais a favorisé les acides aminés chargés positivement tels que la lysine, l'arginine et l'histidine (Fig. S14 supplémentaire). Compte tenu des cibles étendues d'AcrVA5, on peut imaginer que CobB et AcrVA5 se disputent le contrôle du système immunitaire de l'hôte et au-delà. De plus, les protéines Dsr, qui contiennent les domaines de désacétylase, se sont récemment avérées protéger les hôtes contre l'invasion des phages d'ADNdb12, et la présente étude pourrait éventuellement fournir un indice sur les mécanismes peu clairs.

Pris ensemble, on pourrait en déduire que les guerres entre les MGE envahissants et les hôtes microbiens ne finiront jamais, et outre la modification de l'acétyle et du désacétyle, il existe probablement d'autres types de mécanismes compétitifs sujets à une enquête future. Alors que tout comme le dit l'idiome chinois, on peut croire qu'un vice monte d'un pied, mais que les vertus en montent dix.

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Nous remercions le professeur Jiaoyu Deng (Wuhan Institute of Virology, CAS) pour avoir généreusement fourni la souche E. coli W3110 et les mutants. Nous remercions Qiuxiang Cheng (Tolo Biotech.) pour son aide dans l'analyse des données, Weixin Li, Yuangang Ni et Bangtai Luo (Tolo Biotech.) pour leur aide dans la purification des protéines, et Jiacheng Wu (Shanghai Tech University) pour son aide en bioinformatique analyse. Ce travail a été soutenu par des subventions de la National Natural Science Foundation of China (31922046, 31770057), du Sanming Project of Medicine à Shenzhen (SZSM202011017) et du National Key Research and Development Program of China (2018YFA0903700).

Ces auteurs ont contribué à parts égales : Xiaoman Kang, Lei Yin, Songkuan Zhuang

CAS Center for Excellence in Molecular Plant Sciences, Académie chinoise des sciences, Shanghai, Chine

Xiaoman Kang et Guoping Zhao

Université de l'Académie chinoise des sciences, Pékin, Chine

Xiaoman Kang

Tolo Biotechnology Company Limited, Shanghai, Chine

Lei Yin

Département de laboratoire clinique, deuxième hôpital populaire de Shenzhen et institut de médecine translationnelle / premier hôpital affilié du centre des sciences de la santé de l'université de Shenzhen, Shenzhen, Chine

Songkuan Zhuang, Tianshuai Hu, Yong Xu et Jin Wang

Collège des sciences de la vie, Université normale de Shanghai, Shanghai, Chine

Zhile Wu

Institut des antibiotiques, Hôpital Huashan, Université Fudan, Shanghai, Chine

Yijian Chen

Laboratoire clé de pharmacologie clinique des antibiotiques, Commission nationale de la santé, Shanghai, Chine

Yijian Chen

Guangdong Key Laboratory of Systems Biology and Synthetic Biology for Urogenital Tumours, Shenzhen Second People's Hospital/First Affiliated Hospital of Shenzhen University, Shenzhen, Chine

Jin Wang

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JW a conçu le projet et conçu les expériences. XK, LY et SZ ont effectué la plupart des expériences et ont contribué à parts égales à ce travail. TH a aidé à la purification des protéines. ZW a effectué le travail de bioinformatique. GZ, YC, YX et JW ont analysé les données expérimentales. JW a écrit le manuscrit, et tous les auteurs ont révisé le manuscrit et approuvé la version finale du manuscrit.

Correspondance à Yijian Chen, Yong Xu ou Jin Wang.

JW et GZ sont les cofondateurs de Tolo Biotechnology Co., Ltd. LY est un employé de Tolo Biotechnology Co., Ltd. Tous les autres auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

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Réimpressions et autorisations

Kang, X., Yin, L., Zhuang, S. et al. Régulation réversible des activités de Cas12a par acétylation médiée par AcrVA5 et désacétylation médiée par CobB. Cellule Discov 8, 45 (2022). https://doi.org/10.1038/s41421-022-00396-0

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Reçu : 15 novembre 2021

Accepté : 10 mars 2022

Publié: 17 mai 2022

DOI : https://doi.org/10.1038/s41421-022-00396-0

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